基質(zhì)分散固相萃取結(jié)合氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 快速篩查皂角米中的73種農(nóng)藥殘留

張權(quán)，周貽兵，林野，李磊，吳玉田，劉文政，劉利亞，郭華，陳慶園

（貴州省疾病預(yù)防控制中心-實驗中心，貴州貴陽 550004）

皂莢屬（Gleditsia japonicavar. delavayi）系豆科蘇木亞科，約12種，主要分布于亞洲、美洲、熱帶非洲。中國原產(chǎn)8種，引進1種，主要分布于河南、山東、貴州、云南等地[1,2]。皂莢是皂莢屬中唯一能食用種子外胚乳的種，其外胚乳俗稱皂角米，又叫雪蓮子、皂角仁、皂角精等。而貴州多產(chǎn)雙莢皂角米，該品種顆粒飽滿，呈天然淡黃色，煮后口感軟糯，具有補腎、潤肺、明目、提神補氣之功效[3,4]。由于近年來人們對綠色健康食品的崇尚，“物以稀為貴”的皂角米也價格倍增，某些地區(qū)把種植皂角米作為一項脫貧致富的產(chǎn)業(yè)，鼓勵農(nóng)民擴大種植面積，其發(fā)展前景可觀。而目前皂角米的農(nóng)藥殘留問題報道較少，同時相關(guān)部門也未發(fā)布皂角米相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量檢驗標(biāo)準。由此可見，建立一種準確、快速、成本低廉的皂角米中多種農(nóng)藥殘留確證分析方法具有重要意義。

世界上常用農(nóng)藥有千余種之多，每種農(nóng)藥的性質(zhì)又是千差萬別，這些都給農(nóng)殘的篩查和準確定量帶來一定的困難。而樣品前處理更是農(nóng)藥殘留檢測的關(guān)鍵，占整個分析過程2/3的時間[5,6]。目前樣品前處理方法正朝著簡單化、節(jié)約化和微型化發(fā)展[7-9]。而基質(zhì)分散固相萃取法（Dispersive solid phase extraction，dSPE）是近幾年在QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型樣品前處理方法。相比固相萃取法（Solid phase extraction，SPE）[10]、凝膠滲透色譜（Gel Permeation Chromatography，GPC）[11]等傳統(tǒng)方法，dSPE法是將萃取和凈化于一體，具有操作簡單，高效，無需特殊設(shè)備和有機溶劑用量少等優(yōu)點[12,13]，特別適合批量樣品檢測，在時間效率、凈化效果等方面都優(yōu)于傳統(tǒng)方法。其次，皂角米中農(nóng)殘檢測大多數(shù)是參照食品安全國家標(biāo)準GB23200.9-2016《糧谷中475種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法》，而皂角米與其他糧食作物最大的區(qū)別是其含有豐富的植物膠質(zhì)，當(dāng)按照該標(biāo)準進行樣品前處理操作時，樣品提取液經(jīng)旋蒸濃縮后呈膠狀，無法進行后續(xù)的凈化操作，所以該標(biāo)準處理方法不適用于皂角米基質(zhì)。同時，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）比氣相色譜（GC）和氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）更適合農(nóng)殘檢測，這是由于GC-MS/MS采用二級MS離子定性，既可排除假陽性，又可提高檢測靈敏度和準確性[14-16]。

本研究結(jié)合皂角米種植中經(jīng)常噴灑的農(nóng)藥種類，選擇有機氯、有機磷、菊酯、氨基甲酸酯等73種代表性農(nóng)藥作為目標(biāo)分析化合物，其中涵蓋GB 2763-2019《食品安全國家標(biāo)準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》在糧食中明確禁止在國內(nèi)銷售和使用的25種殺蟲劑及殺菌劑，以及糙米中有農(nóng)藥限量要求的指標(biāo)。通過優(yōu)化提取溶劑、dSPE萃取管及純化管的類型及用量，建立dSPE結(jié)合GC-MS/MS快速測定皂角米中多種農(nóng)藥殘留的快速篩查方法，為日后在食品風(fēng)險監(jiān)測領(lǐng)域?qū)Z食中農(nóng)藥殘留的篩查和確證、風(fēng)險評估、定量仲裁等研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

33種藥典中農(nóng)藥定制混標(biāo)，天津阿爾塔科技有限公司；10種氨基甲酸酯混合標(biāo)準溶液，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；16種有機磷混合標(biāo)準溶液，SB05-069-2008，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；7種菊酯混標(biāo)，100 μg/mL，美國O2si公司；其余16種農(nóng)藥標(biāo)準品均購自于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；乙腈、丙酮，色譜純，美國TEDIA公司；CNW dSPE萃取包及純化管，上海安譜實驗科技股份有限公司；內(nèi)標(biāo)：環(huán)氧七氯（GSB 05-2317-2016，100 μg/mL），農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；皂角米樣品采集于貴州織金縣、納雍縣、余慶縣、修文縣。

1.2 儀器設(shè)備

布魯克Scion-TQ三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國BRUKER公司；SWLF-200多功能渦輪粉碎機，鄭州旭朗機電設(shè)備有限公司；高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 標(biāo)準儲備液的配制

分別吸取農(nóng)藥標(biāo)準溶液各1 mL混勻，合并后體積為20 mL，配制成混合標(biāo)準溶液，-4 ℃保存，待用。

1.4 樣品處理過程及實驗優(yōu)化過程

1.4.1 樣品處理過程

選取500 g以上代表性樣品，利用大功率渦輪粉粹機粉碎后置于自封袋中。準確稱取4.00 g試樣于50 mL離心管中，加入10 mL 1%乙酸乙腈渦旋振蕩2 min，超聲提取15 min，然后加入萃取包（填料為6 g硫酸鎂及1.5 g醋酸鈉），渦旋振蕩1 min，10000 r/min 離心5 min，準確吸取上清液1 mL加入到純化管中，加入內(nèi)標(biāo)40 μL，渦旋振蕩1 min，10000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm濾膜后用于上機測定。

1.4.2 實驗優(yōu)化過程

提取液考察實驗：本研究選取數(shù)份經(jīng)GC-MS/MS驗證無目標(biāo)物的皂角米空白樣品，分別添加50 μL不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準使用液，通過考察1%乙酸乙腈、乙腈、甲醇三種提取溶劑對73種目標(biāo)化合物的提取效率的影響。

dSPE純化管內(nèi)用量優(yōu)化實驗：本研究選取數(shù)份經(jīng)GC-MS/MS驗證無目標(biāo)物的皂角米空白樣品，分別添加50 μL不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準使用液，然后按照1.4.1樣品前處理過程操作，在凈化過程中分別考察GCB，PSA凈化劑的不同用量（25 mg、50 mg、100 mg、150 mg、200 mg）對目標(biāo)物提取回收率情況。

表1 73種農(nóng)藥保留時間及質(zhì)譜條件參數(shù)Table 1 Retention times and GC-MS/MS conditions of the 73 pesticide

續(xù)表1

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱：Agilent J&W DB-1701MS石英毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣：氦氣，純度≥99.999%；分流模式：不分流進樣，進樣口溫度：250 ℃，流速：1.0 mL/min，進樣量：1.0 μL。程序升溫條件：起始溫度60 ℃，保持1.0 min，以40 /min℃升至120 ℃，再以5 /min℃升至280 ℃保持8.5 min，共43.0 min，溶劑延遲5.0 min。

1.5.2 質(zhì)譜條件

電離模式：電子轟擊離子化（EI）離子源，電離能量：70 eV，分析模式：質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，離子源溫度：230 ℃，傳輸線溫度：280 ℃，碰撞氣：氬氣。

1.5.3 數(shù)據(jù)處理

采用儀器自帶MS Workstation 8.0軟件進行數(shù)據(jù)采集，通過全掃描模式獲得目標(biāo)物的保留時間，同時利用軟件自帶Factory Library數(shù)據(jù)庫選擇采集的目標(biāo)物的離子對信息，對目標(biāo)物進行準確的定性定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取包及提取溶劑的選擇

圖1 三種提取溶劑的平均提取效率對比Fig.1 Comparison of average recovery rates of the three extraction solvents

QuEChERS方法是近年發(fā)展迅速的一種農(nóng)藥多組分殘留檢測前處理方法，但在最初的過程中是沒有添加緩沖鹽類物質(zhì)的，這就可能導(dǎo)致某些對pH敏感的農(nóng)藥化合物產(chǎn)生一定的降解，而dSPE法首先加入萃取包，其填料為6 g硫酸鎂及1.5 g醋酸鈉，由于緩沖鹽的加入，就會對某些農(nóng)藥的降解速度起到一定的減緩作用。其次，本研究選取數(shù)份經(jīng)GC-MS/MS驗證無目標(biāo)物的皂角米空白樣品，分別添加50 μL不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準使用液，通過考察1%乙酸乙腈、乙腈、甲醇三種提取溶劑對73種目標(biāo)化合物的提取效率的影響，結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出，與甲醇相比，乙腈的溶劑性能較好，對大部分化合物的提取效率較高，對色素、脂肪等非極性成分的提取能力較弱，尤其是經(jīng)酸化處理的乙腈進行提取后，更適宜萃取極性范圍較寬的多種農(nóng)藥，結(jié)果表明；73種化合物提取的平均回收率為78.7%，其中回收率最低的為63.2%，可滿足實驗要求，所以本方法采用10 mL 1%乙酸乙腈為提取溶劑。

圖2 GCB用量對目標(biāo)物回收率的影響Fig.2 The effect of GCB dosage on target substance recovery

2.2 純化管內(nèi)凈化劑用量的選擇

dSPE法在靈敏度可以達到要求的情況下減少濃縮步驟，通過優(yōu)化后的凈化條件可以去除樣品中的較多雜質(zhì)及色素，凈化效果較好，操作步驟較少。dSPE純化管內(nèi)填料的選擇上要考慮基質(zhì)的復(fù)雜程度，目前主要的凈化劑主要有N-丙基乙二胺固相吸附劑（PSA）[17]，石墨化碳黑吸附劑（GCB）[18]，C18吸附劑[19]等，通常PSA去除脂肪酸等強極性雜質(zhì)的效果較好，C18去除維生素、甾醇、油脂等非極性雜質(zhì)的能力較好，無水硫酸鎂去除水分和水溶性雜質(zhì)的效果較好，GCB的脫色效果較好。

其次在dSPE純化管內(nèi)填料量也要充分考慮，雖然凈化填料越多，凈化效果越好，但過量的凈化劑也會影響某些農(nóng)藥的回收率，所以本研究在凈化過程中同時考察了GCB，PSA凈化劑的不同用量（25 mg、50 mg、100 mg、150 mg、200 mg）對目標(biāo)物回收率情況，結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出，當(dāng)GCB含量為50 mg時，只有5個目標(biāo)物的回收率在60%～65%，可以滿足實驗要求。而當(dāng)GCB含量超過100 mg時，三唑磷、喹硫磷等9種農(nóng)藥的回收率會下降至60%以下，這就表明過量的GCB會對某些平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥吸附效果明顯；其次PSA可利用-NH-H產(chǎn)生的氫鍵作用去除皂角米提取液中的糖、酸和某些極性基質(zhì)，減少基質(zhì)對進樣系統(tǒng)的污染。實驗中當(dāng)GCB為50 mg時，將PSA用量從50 mg增加至250 mg，73種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率基本無影響。所以通過實驗優(yōu)化，在不同極性目標(biāo)物的回收率滿足方法要求的情況下最終確定純化管內(nèi)填料的規(guī)格為（150 mg MgSO4、50 mg PSA、50 mg GCB、50 mg C18）。在優(yōu)化好的實驗條件下，皂角米樣品加標(biāo)后的MRM總離子流圖如圖3所示。

同時，本研究中為進一步探究dSPE法的凈化效果，分別稱取兩份同一皂角米樣品，其中一份樣品加入10 mL乙腈后超聲提取10 min，上清液過0.22 μm濾膜后直接進樣分析，另一份樣品按照1.4.1樣品前處理過程進行操作，分別在Full Scan模式條件下分析，樣品未凈化及經(jīng)dSPE凈化后的全掃譜圖如圖4所示，根據(jù)全掃譜圖可以看出，針對皂角米基質(zhì)經(jīng)dSPE凈化后的效果較好，能夠去除大部分雜質(zhì)，可滿足準確定量的要求。

圖3 皂角米基質(zhì)加標(biāo)樣品在MRM模式下的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram in MRM mode of a seeds of Gleditsia sinensis matrix spiked sample

圖4 未凈化與dSPE凈化后在全掃描模式下的總離子流圖Fig.4 Total ion chromatogram in full scan mode of unpurified and dSPE cleaned

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

質(zhì)譜檢測中首要考慮的就是基質(zhì)效應(yīng)問題，它會造成增強或抑制組分的信號響應(yīng)，進而影響定量的準確性[20,21]，而且不同的濃度水平產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)程度也不同，通?；|(zhì)效應(yīng)的相對強度（ME）=（基質(zhì)標(biāo)準溶液的峰面積/溶劑標(biāo)準溶液的峰面積）×100%，當(dāng)ME的值為100%～120%，基質(zhì)效應(yīng)可忽略不計，當(dāng)ME＞120%，表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應(yīng)，最有效的辦法就是使用基質(zhì)標(biāo)準曲線進行定量。本研究考察了73種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)，分別按照1.4.1進行前處理操作，皂角米中目標(biāo)農(nóng)藥的基質(zhì)效果如圖5所示。結(jié)果顯示：dSPE法的ME范圍為112%～173%，其中41種農(nóng)藥的ME＞120%，由此可見與液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用不同的是，氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的基質(zhì)效應(yīng)大多數(shù)以增強為主[22,23]。所以本研究為了減少基質(zhì)效應(yīng)對定量的影響而采用基質(zhì)匹配標(biāo)準曲線內(nèi)標(biāo)法定量。

圖5 皂角米中目標(biāo)農(nóng)藥的基質(zhì)效果（MEs）Fig.5 Matrix effect (MEs) of target pesticides in seeds ofGleditsia sinensis

2.4 線性范圍、檢出限、定量限及加標(biāo)回收率

在GC-MS/MS確證的實驗條件下，取皂角米空白樣品按樣品制備處理后，得到空白提取液，分別加入6個不同濃度的混合標(biāo)準溶液，在優(yōu)化好的色譜條件和質(zhì)譜條件下進行測定，以內(nèi)標(biāo)法定量。以待測物的定量離子對峰面積與內(nèi)標(biāo)物定量離子對峰面積之比為縱坐標(biāo)，樣品中待測物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準曲線。同時，采用皂角米空白樣品中添加目標(biāo)物的方法，以10倍信噪比（S/N）對應(yīng)的質(zhì)量濃度確定定量限（LOQ）。其次，取數(shù)份經(jīng)GC-MS/MS驗證無目標(biāo)物的皂角米空白樣品，分別添加100 μL不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準溶液，按照上述優(yōu)化后的方法進行樣品前處理，并上機分析，平行測定6次，其回收率和相對標(biāo)準偏差（relative standard deviations，RSD）如表2所示。

通過表2可以看出，73種目標(biāo)物線性關(guān)系良好（R2＞0.99）。采用加標(biāo)回收的方法確定方法定量限（LOQ，S/N=10）分在2.5～20.0 μg/kg，73種化合物加標(biāo)回收率范圍在68.6%～110.7%之間，RSD（n=6）在2.1%～9.7%之間，表明本方法重復(fù)性良好，可滿足實際檢測的需要。

表2 73種化合物線性方程、相關(guān)系數(shù)、方法定量限和加標(biāo)回收率Table 2 Linear equations, correlation coefficients, limit of quantification (LOQ) and recovery of the 73 pesticides

續(xù)表2

圖6 陽性樣品中氯氟氰菊酯的MRM總離子流圖Fig.6 MRM total ion chromatogram of cyhalothrin in positive sample

2.5 實際樣品分析

采用本研究建立的方法對貴州織金縣、納雍縣、余慶縣、修文縣采集的共80份樣品中的73種目標(biāo)農(nóng)藥進行監(jiān)測，其中1份樣品中檢出氯氟氰菊酯殘留，檢出率為1.25%，檢出的農(nóng)藥含量為0.021 mg/kg，其殘留量均未超過國家標(biāo)準及地方標(biāo)準規(guī)定的最大殘留限量值。這可能由于皂角本身有一定的生物活性[24,25]，如皂莢、莢果及枝刺具有除濕毒、殺蟲功效，所以皂角也常用作綠色殺蟲劑。圖6為陽性樣品中氯氟氰菊酯的MRM總離子流圖。

3 結(jié)論

本研究針對現(xiàn)行國家標(biāo)準中對皂角米特殊基質(zhì)中凈化條件的不足，以QuEChERS法為基礎(chǔ)，建立并優(yōu)化dSPE法結(jié)合GC-MS/MS快速測定皂角米中多種農(nóng)藥殘留的快速篩查方法，該方法的前處理步驟簡便，無需特殊設(shè)備，方法適用性強，凈化效果較好，適合糧食基質(zhì)中多組分農(nóng)藥殘留的篩查和確證，方法的定量限也能夠滿足國內(nèi)對農(nóng)藥殘留的檢測要求。