一氧化氮與蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷所致腦微循環(huán)變化的相關性研究

秦 雷,汪亞男,謝宗玉,朱廣輝,郭 飛,馬宜傳

蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)是嚴重威脅人類生命的疾病，病死率及致殘率很高，約40%的病人出血后48 h內死亡[1]，已廣泛引起人們的關注與重視。近年來研究[2]顯示，改善大血管痙攣并不能明顯改善SAH病人的預后，早期腦損傷(EBI)可能是導致SAH病人死亡風險較高和決定預后的首要原因，而且其發(fā)生機制復雜，涉及腦細胞及腦血管一系列的病理生理改變。全腦CT灌注成像可以動態(tài)觀察全腦不同時間段的微循環(huán)狀況，通過血流量(CBF)、血容量(CBV)、平均通過時間(MTT)和達峰時間(TTP)多參數(shù)定量分析，間接反映EBI的進展程度。一氧化氮(NO)是重要的血管活性物質，能夠介導腦血管的舒縮反應，影響EBI的進展。本研究擬通過兔SAH模型的建立，研究EBI狀態(tài)下腦微循環(huán)的變化規(guī)律及與血清NO的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 新西蘭大白兔購自蚌埠醫(yī)學院實驗動物中心，動物合格證號SCXK(蘇)2017-0001，雌雄不限，體質量2.5～3.5 kg，適應性喂養(yǎng)一周后進行實驗。分為手術組和假手術組，2組再分為術后1 h、6 h、24 h、72 h 4個亞組，各10只，共80只。

1.2 動物模型的建立 采用枕大池注血法制備兔SAH模型。(1)30 g/L戊巴比妥經(jīng)兔耳緣靜脈注射麻醉，麻醉劑量為1 mL/kg。(2)動物麻醉后取俯臥位，兔頸部剃毛并固定四肢軀干，觸摸到枕大孔邊緣后作手術切口約2.5 cm，逐層鈍性分離頸部肌肉至可觸摸到枕大孔骨緣和第二頸椎棘突。用18G穿刺針經(jīng)環(huán)枕筋膜穿刺枕大池，為模擬真實SAH，盡量不放出腦脊液。(3)在耳正中動脈用注射器抽取約5 mL血液。(4)迅速將血以0.5 mL/s的速度注入枕大池內，以1.5 mL/kg的量注入，注血后迅速拔針，用紗布按壓局部1 min，并觀察周圍肌肉間隙內無滲血后將青霉素粉末撒在傷口局部，分層縫合肌肉和皮膚。(5)術畢按頭低30°位放置約30 min，以利于血液分布在基底動脈周圍。假手術組動物模型的操作與SAH模型組相同，僅以等量的37 ℃ 0.9%氯化鈉溶液替代自體血。

造模成功判斷指征：注血實驗兔會出現(xiàn)如心率加快、急促呼吸甚至呼吸驟停、四肢強直樣改變或大小便失禁等；以及表現(xiàn)出不同程度的神經(jīng)功能障礙，如嗜睡、拒食、活動減少等輕度神經(jīng)功能障礙，跛行、單癱等中度障礙，劃圈運動、行走困難、四肢癱瘓等重度障礙。本研究實驗兔術后大體標本均發(fā)現(xiàn)不同程度的血凝塊可以證實SAH造模成功。

1.3 CT灌注成像 使用GE revolution CT，兔麻醉后俯臥位頭先進固定于特制的掃描架內。選擇矩陣1 024×1 024，掃描范圍8 cm，腦灌注成像操作程序，間隔1 s曝光1次，共40次。掃描前經(jīng)耳緣靜脈以1.5 mL/s流速注入非離子造影劑5 mL，注入3 s后開始掃描。圖像后處理：將掃描數(shù)據(jù)導入工作站，沿著額、顳、頂、枕葉邊緣畫感興趣區(qū)(ROI)(見圖1),隨機軟件自動得出CBF、CBV、MTT和TTP參數(shù)數(shù)值及相應的偽彩圖。各灌注參數(shù)為額、顳、頂、枕各腦葉CT灌注結果的均值。

1.4 實驗標本收集及測定

1.4.1 血液標本 于動物模型建立后1、6、24、72 h，CT掃描前自兔耳緣靜脈采血2 mL；不抗凝室溫下3 000 r/min離心10 min，取上清液于-20 ℃保存待測。用酶聯(lián)法按試劑盒說明書測定兔血清NO含量，兔血清一氧化氮(NO)試劑盒購于廈門慧嘉生物有限公司。

1.4.2 腦組織標本 實驗動物于建模后1、6、24、72 h，用30 g/L戊巴比妥麻醉，CT掃描后取仰臥位，剪開胸腔，暴露心臟。剪開左心室，將點滴管通過左心室插入主動脈，打開點滴管，將0.9%氯化鈉溶液快速滴注，待右心耳膨脹后剪開，右心耳流出液變淡時，改用4%甲醛灌注，先快后慢，動物四肢抽搐、震顫，表示灌注成功。然后開顱，分別取兩側額葉、顳葉、枕葉、頂葉腦皮質部分各一塊，于甲醛溶液中保存。對組織進行常規(guī)蘇木素-伊紅染色，觀察腦組織細胞形態(tài)及炎性細胞浸潤情況。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用t檢驗、方差分析、q檢驗和直線相關分析。

2 結果

2.1 兔神經(jīng)系統(tǒng)損害情況 手術組術后20只兔表現(xiàn)為異常興奮、上躥下跳，13只表現(xiàn)為淡漠、萎靡、活動減少，4只出現(xiàn)活動障礙或癱瘓；假手術組3只出現(xiàn)上述癥狀；其余兔未見明顯異常。

2.2 2組CT灌注參數(shù)比較 手術組CBV與CBF在術后1、6、24、72 h均明顯低于假手術組(P<0.01)，MTT高于假手術組(P<0.05～P<0.01)；手術組TTP在術后24 h和72 h高于假手術組間(P<0.01和P<0.05)，2組術后1 h和6 h差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表1)。

表1 2組CT灌注參數(shù)比較

2.3 2組血清NO含量比較 假手術組在術后1、6、24、72 h NO含量無明顯變化(P>0.05),手術組兔在術后24 h和72 h NO含量有所回升(P<0.01)；術后1、6、24、72 h手術組NO含量均明顯低于相應假手術組(P<0.01)(見表2)。

表2 2組血清NO含量比較

2.4 手術組NO與CBV、CBF、MTT、TTP相關性分析 直線相關分析顯示，手術組NO與MTT呈負相關關系(r=-0.854,P<0.05),與CBF呈正相關關系(r=0.786,P<0.05)，與CBV(r=0.208,P>0.05)、TTP(r=0.311,P>0.05)間無明顯相關性。

2.5 病理結果 大體觀察：術后1 h注血組，枕大池區(qū)域、延髓腹側面可見血液集聚，大腦半球表面無明顯血凝塊。術后6 h注血組，少量血液集聚于枕大池區(qū)域，延髓腹側面可見較多血凝塊。術后24 h注血組，枕大池區(qū)及大腦半球表面較多陳舊的血凝塊。術后72 h注血組，枕大池內未見明顯的血凝塊，而大腦半球腹側面可見少量血凝塊。假手術組大腦半球表面無明顯血凝塊(見圖2)。

鏡下觀察：1 h手術組，顳葉及枕葉部分小血管略狹窄，血管周圍出現(xiàn)少量炎性細胞的浸潤；6 h手術組，額、顳、枕葉出現(xiàn)較明顯炎癥反應，血管管腔狹窄，管壁增厚，周圍淋巴細胞增多聚集；24 h手術組，額、頂葉局部出現(xiàn)無結構的均質紅染的壞死區(qū)，周圍有大量炎性細胞浸潤，顳、枕葉小血管明顯狹窄，細胞腫脹；72 h手術組，額、枕、顳葉腦組織細胞增大，水腫，胞質增多。假手術組病理切片示腦組織結構清晰，細胞大小形態(tài)分布正常，未見明顯炎癥反應和壞死灶(見圖3)。

3 討論

EBI是SAH后72 h內腦作為一個整體發(fā)生的直接損傷，涉及到遲發(fā)性腦血管痙攣出現(xiàn)之前腦組織內所發(fā)生的病理生理事件，包括腦組織細胞死亡、血腦屏障破壞、腦水腫、顱內壓增高、急性腦血管痙攣、微血管功能障礙腦血流下降等多種病理生理事件[3-4]，這些都會造成腦缺血，引起腦細胞的凋亡及壞死，最終造成EBI。因此，了解EBI的進展過程、機制及全腦微循環(huán)的變化規(guī)律是治療及預防的關鍵。

對于SAH后EBI的影像學檢查，常規(guī)的TCD、CTA、DSA只能反映大血管的痙攣，無法顯示微血管以及腦組織的功能情況[5]?，F(xiàn)代影像醫(yī)學已經(jīng)從單純形態(tài)學檢查向以形態(tài)學和分子水平、微循環(huán)及代謝產物為特點的功能學檢查方向發(fā)展[6]。CT灌注成像正是這樣一種功能成像，它是在靜脈團注對比劑的同時，對選定層面進行快速動態(tài)CT掃描，追蹤分析對比劑首次通過受檢組織過程中每個像素的密度變化，獲得CBF、CBV、MTT和TTP定量數(shù)據(jù)及偽彩圖，可以活體評價腦內血流的灌注狀態(tài)，能夠反映腦組織的微循環(huán)改變,是無創(chuàng)顯示腦組織缺血的最準確、最敏感的方法[7]。近年來，CT灌注成像在臨床中也得到了廣泛的應用[8]。

本研究通過分析CT灌注參數(shù)研究SAH出血早期不同時間段腦組織的微循環(huán)變化規(guī)律，從而了解EBI的進展程度。手術組CBV低于對照組，提示由于血液刺激造成的機械性損傷、炎癥因子的釋放等造成了微血管的痙攣性狹窄，局部腦組織繼而出現(xiàn)缺血表現(xiàn)，引起了血容量的減少[9]；手術組間比較無明顯差異，可能由于EBI時腦內微循環(huán)較宏觀血管對于刺激的反應更加靈敏[10]，側枝循環(huán)及血流代償機制還未完全啟動。CBF在SAH后24 h達到了最低值，72 h上升，由此可見，SAH早期全腦即出現(xiàn)明顯的低灌注狀態(tài)，在偽彩圖上也發(fā)現(xiàn)了較多的低灌注區(qū)域，對應的病理切片上我們也可見腫脹的腦細胞、小血管的管腔狹窄等表現(xiàn)。國內外研究[11]發(fā)現(xiàn)，SAH后早期顱內壓的急劇升高、腦灌注壓明顯降低，導致腦血流量下降從而導致早期全腦缺血；亦有實驗[12]表明，SAH發(fā)生后數(shù)分鐘內神經(jīng)元細胞就出現(xiàn)凋亡，微血管通透性增加、血腦屏障作用破壞、炎性細胞侵入，造成了明顯的腦水腫表現(xiàn)。相關研究[13]亦發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血后60 min，大腦皮層即開始有P53表達增加，24～48 h達高峰，與本研究CBF變化規(guī)律基本一致，因此CT灌注發(fā)現(xiàn)的異常能間接反映SAH后腦缺血及腦壞死的程度。MTT在SAH發(fā)生后1 h迅速升高，6 h、24 h達到頂峰，在72 h減低，病理分析也可以發(fā)現(xiàn)血管壁增厚，管腔狹窄，周圍有大量的炎性細胞浸潤，腦組織中還出現(xiàn)了無結構的壞死區(qū)，可以推在第6～24 h階段腦損傷程度達到了高峰。TTP沒有MTT敏感，手術組TTP只在6 h、24 h組高于假手術組，一定程度上反映了腦組織的損傷及缺血狀態(tài)。由此可見，SAH后72 h內腦組織內發(fā)生的各種病理生理變化迅速、復雜，全腦的低灌注、缺血狀態(tài)、腦水腫、微小血管的痙攣及狹窄等會造成病人嚴重的神經(jīng)功能障礙，甚至死亡。

研究[14]發(fā)現(xiàn)NO參與了SAH后遲發(fā)型腦血管痙攣的病理生理進程，影響了腦微循環(huán)的改變，與EBI有著密切的關系。NO是在一氧化氮合成酶作用下產生的內皮細胞松弛因子，是機體重要的氣體活性分子，有舒張血管的作用，通常情況下，由血管內皮細胞產生生理劑量的NO，作用于平滑肌細胞，調節(jié)腦血流及維持神經(jīng)元功能的完整性[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)SAH后1 h、6 h手術組NO含量持續(xù)減低，72 h較24 h有所升高，但較假手術組NO含量依然是減低的，在相關分析中發(fā)現(xiàn)NO與MTT呈負相關關系,與CBF呈正相關關系。CBF為單位時間內流經(jīng)特定區(qū)域腦組織的血液容量，MTT理論上是血液自動脈端流至靜脈端的循環(huán)時間，因通過的血管路徑不同，時間也不同，所以用平均通過時間表示[17],MTT增加及CBF減少意味著循環(huán)減慢，反映了微循環(huán)的障礙及腦組織的缺血狀態(tài)，因此我們推測NO可能早期就介導了SAH后微血管痙攣參與了腦損傷的進程。SAH后血液進入蛛網(wǎng)膜下腔，崩解釋放氧合血紅蛋白，破壞NO釋放神經(jīng)元，引起NO水平在1 h、6 h急劇下降[18]，繼而NO舒張平滑肌的能力減低及抑制內皮素-1能力減弱，進一步促進了血管收縮，導致MTT的升高及CBF的下降。在24～72 h時段檢測到NO濃度有所上升，可能與誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的激活有關[19]，iNOS活化促使膠質細胞和巨噬細胞釋放NO，或者是腦內側枝循環(huán)及代償反應的形成有關。但是手術組各期相NO含量均低于假手術組，說明SAH早期各階段，NO都參與其中，導致了腦微循環(huán)及相應的病理改變，一直影響著EBI的進展。

綜上，CT灌注能夠反映腦組織的血流灌注狀態(tài)，提供組織器官血流動力學信息，能較敏感地反映SAH后腦組織微循環(huán)障礙，其中CBF、MTT能很好地提示EBI的進展程度，NO在SAH后EBI中發(fā)揮的重要作用，這些對于研究EBI的形成機制、指導臨床治療方案的制定和判斷臨床預后有著重要的意義。由于SAH后EBI的發(fā)生是多因素參與的，本研究僅探討了NO對SAH后EBI的影響及與CT灌注參數(shù)間相關關系，未進行多因素的綜合分析，將進一步分析多個因素(如收縮血管因子、某些炎癥因子等)在SAH后EBI中的作用。