支氣管哮喘的全基因組關(guān)聯(lián)分析研究進展*

李海麗，孫 艷，鄧靜敏△

（1.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，南寧 530021；2.貴州省貴陽市第一人民醫(yī)院，貴陽 550002）

支氣管哮喘（Asthma，簡稱哮喘）是多基因遺傳的復雜疾病。到目前為止，已有大量的文獻報道與哮喘發(fā)病相關(guān)的人類染色體區(qū)域及哮喘易感基因。全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association studies，GWAS）是以單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphisms，SNP）為標記、鑒定與復雜人類性狀和疾病風險相關(guān)的遺傳變異、探究疾病遺傳機制的方法。GWAS 已鑒定出與數(shù)百種復雜疾病和特征相關(guān)的數(shù)千個基因座，并且在闡明這些關(guān)聯(lián)的因果變體和基因方面正在取得進展[1]。其在哮喘遺傳機制研究中的應用也越來越廣泛。

GWAS 問世前，連鎖分析方法最常被用于鑒定疾病的易感基因，而后隨著“人類基因組計劃”和“人類基因組單體型圖計劃”的完成以及基因分型技術(shù)的廣泛應用，GWAS 已逐步取代傳統(tǒng)的遺傳學研究方法成為研究復雜遺傳性疾病的主流。GWAS 的優(yōu)勢在于無需對特定基因預先進行假設，且基因變異檢測效率高，其不便之處在于，它們需要大樣本量和用于處理大量數(shù)據(jù)的工具，在處理如此大量的數(shù)據(jù)過程中需要使用極其嚴格的檢驗水準以防止出現(xiàn)假陽或假陰性結(jié)果。

哮喘GWAS 研究大部分為基于無關(guān)個體的關(guān)聯(lián)分析且多采用病例對照研究設計，部分研究采用基于家系的關(guān)聯(lián)研究。全球首個針對哮喘的GWAS 研究發(fā)現(xiàn)，17q12-q21 染色體上ORMDL3 基因rs7216389 位點與兒童哮喘存在強相關(guān)性，這一發(fā)現(xiàn)在歐洲獨立人群以及其他種族中也得到了一致的重復。因此，可以認為17q21 號染色體是一個真正的哮喘易感性位點。迄今為止，全球范圍內(nèi)已經(jīng)進行了許多關(guān)于哮喘的GWAS 研究，不同地域、種族、年齡、性別的易感基因及陽性位點相繼被報道出來，現(xiàn)將近年來該領(lǐng)域的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)綜述如下。

1 哮喘GWAS 陽性位點在基因中的分布概況

GWAS陽性位點多位于基因編碼區(qū)。如17q12-q21 染色體上ORMDL3 基因rs12603332、rs4378650位點，GSDMB基因rs7216389位點等是位于基因編碼區(qū)中與哮喘相關(guān)的SNP陽性位點。然而，越來越多的研究證實，GWAS 陽性位點亦可出現(xiàn)在側(cè)翼序列、基因間等非編碼區(qū)。如AGT、DPP10、IKBKAP以及IL12RB1 等基因的編碼區(qū)與哮喘發(fā)病幾乎無關(guān)聯(lián)，而側(cè)翼非編碼區(qū)的罕見位點突變與非裔美國人群哮喘易感性顯著相關(guān)，其中IL12RB1基因側(cè)翼非編碼區(qū)的非同義突變與非、歐裔美國人群哮喘易感性均顯著相關(guān)。Th17 細胞系中IL-17A 基因間SNP rs1892280 和rs10807439 是過敏性鼻炎患者的保護或風險因素，白介素（IL）-17F 基因間SNP rs13192563是過敏性鼻炎合并哮喘患者的保護或風險因素。

2 目前哮喘易感基因GWAS 陽性位點研究進展

以“genome-wide association studies或GWAS或polymorphism”并“asthma”為條件在PubMed 外文數(shù)據(jù)庫中檢索與哮喘相關(guān)的GWAS 研究，共獲得2233 條結(jié)果，同時，以“全基因組關(guān)聯(lián)性分析或GWAS或基因多態(tài)性”并“哮喘”為篩選條件在中國知網(wǎng)上檢索相關(guān)研究共獲得504條結(jié)果，包括HLADRB1（6p21.32）、ORMDL3（17q12-q21）、ADAM33（20p13）、IL-13（5q31.1）等在內(nèi)的多個易感基因及SNP 位點相繼在不同人群中得到復制。筆者將從以下4個方面來闡述哮喘易感基因GWAS陽性位點研究進展。

2.1 高Th2型免疫通路相關(guān)基因

高Th2免疫通路涉及IL-4、IL-5等細胞因子，其中IL-4 作為經(jīng)典的細胞因子在哮喘的發(fā)病中發(fā)揮著不可忽視的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在白人和非裔美國人中，IL-4基因啟動子區(qū)的C-589T位點的T等位基因頻率存在顯著差異（分別為0.183 和0.544），且T等位基因的數(shù)量與FEV1值顯著負相關(guān)（P=0.035），結(jié)果表明，非裔美國人（47.2%受試者的FEV1＜50%的預測值））哮喘嚴重程度高于白人（36.4%受試者FEV1＜50%的預測值）。另有研究證實，IL-4R 基因突變位點Q576R 與I75V 共存時可上調(diào)IL-4R 的表達，增加IL-4R 對IL-4 的敏感性，加重氣道炎癥。而在對日本成年女性進行的一項病例—對照研究顯示，IL-4 基因rs2243290 位點的AC 基因型可降低哮喘的發(fā)病風險，是哮喘的一個保護因素[2]。

IL-33與生長刺激表達基因2蛋白（ST2）結(jié)合可活化MAPKs 和NF-KB，并且誘導Th2 效應細胞因子IL-13、IL-4、IL-5 等的釋放，在哮喘的Th2 型炎癥反應過程中起關(guān)鍵作用，IL-33 與ST2 分別由IL-33基因、IL1RL1 基因編碼。Gudbjartsson 等[3]對9 392名冰島人血液DNA 進行全基因組關(guān)聯(lián)掃描，并對SNP 進行分型，篩選出顯著差異的位點，并對這些位點在來自不同國家的人群（美國、瑞典、澳大利亞、德國、意大利、荷蘭、英國、韓國）中進行復制，結(jié)果顯示，在這些人群中IL1RL1 上的rs1420101 為哮喘風險等位基因（P=5.3×10-14），且與血液嗜酸性粒細胞計數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系。此外，該位點與IL1RL1上的另外兩個SNP位點rs1921622、rs17026974在日本人群中均被證實與穩(wěn)定期成人哮喘呼出氣一氧化氮及嗜酸性粒細胞水平升高相關(guān)[4]。而針對4～8歲荷蘭兒童的GWAS 研究表明，IL1RL1 上的rs1420101僅與嗜酸性粒細胞水平升高相關(guān)[5]。另一項以歐洲人群為研究對象的GWAS 研究證實，IL1RL1 上另一個位點rs13408661 為哮喘相關(guān)陽性位點（P=1.1×10-9)，而rs1420101（P=9.9×10-5）未能達到檢驗標準（P＜5×10-8）[6]。rs928413 是在丹麥兒童病例—對照研究中發(fā)現(xiàn)的IL-33基因另一個哮喘陽性位點，在中國人群中亦得到復制[7]，而在美洲印第安人群兒童（6～17 歲）中被證實與哮喘發(fā)病風險不存在相關(guān)性[8]。綜上，不同種族人群、性別、年齡中同一個位點的重復結(jié)果不盡相同，因此對不同的人群進行同一位點的驗證十分必要。

IL-13 是IL-33 的下游因子，參與高Th2 型免疫通路介導的氣道炎癥反應，不僅與嗜酸細胞等的募集、肥大細胞的活化有關(guān)還可以誘導氣道高反應、參與氣道重構(gòu)，是哮喘發(fā)病的重要炎癥因子。IL-13基因上的rs1295686 為哮喘風險位點但與血清IgE水平無關(guān)聯(lián)，而該基因上的另一位點rs20541 則相反，僅與IgE 水平相關(guān)，與患哮喘風險無關(guān)聯(lián)，可見同一基因上不同SNP 對表型的調(diào)控作用可能有所不同。隨后rs1295686和rs20541在亞洲和沙特阿拉伯人群中也得到復制，均被證實為哮喘發(fā)病的高風險因素[9]。rs20541在芬蘭人群中也得到驗證[10]。

胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）在由Th2 細胞介導的與哮喘相關(guān)的病理生理中起重要作用。早在2009年TSLP基因上的rs1837253 位點已被證實為哮喘和氣道高反應性的保護因素。然而，針對日本人群進行該位點的復制研究顯示，rs1837253 為哮喘患病的風險因素，同年，Torgerson 等[11]的研究也表明，rs1837253 為歐洲、西班牙、非洲這3 個人群的哮喘易感位點。此外，國內(nèi)的一項病例對照研究也證實了該位點是中國廣西壯族人群哮喘發(fā)病的高風險因素。另一個位于TSLP 基因上與哮喘風險相關(guān)的陽性位點為rs3806933，該位點可通過加強（AP）-1 與基因調(diào)控元件之間的連接以調(diào)控TSLP 基因的表達，從而增強人支氣管上皮細胞中TSLP 對聚肌胞苷酸poly(I:C)的反應，誘導過敏性炎癥的產(chǎn)生增加哮喘患病風險。

2.2 人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）相關(guān)基因

HLA 基因具有高度多態(tài)性，其中HLA-II 類基因參與機體過敏反應的抗原遞呈過程，其多態(tài)性與花粉、塵螨等特異性IgE 的產(chǎn)生相關(guān)。目前GWAS Catalog中與HLA基因相關(guān)的陽性位點共111個，其中rs9500927（P=4×10-9）、rs9275698（P=5×10-12）、rs7775228（P=5×10-12）、rs3129890（P=5×10-13）4 個位點已被證實為日本人群的哮喘發(fā)作風險因素，而rs9273349（P=7×10-14）是唯一在成人和兒童中都得到驗證的位點[12]。此外，位于HLA-DPA1 和HLADPB1之間的SNP rs987870與日本和韓國兩個人群的小兒哮喘發(fā)病率升高密切相關(guān)[P（合并）=2.3×10-10]，而與屋塵螨特異性IgE 水平無關(guān)聯(lián)。rs9273373 是位于HLA 附近的另一個陽性位點，對歐洲人群進行的一項病例對照研究證實，該位點為哮喘合并過敏性鼻炎發(fā)病的高風險因素，而與單個表型發(fā)病的相關(guān)性較低[13]。此外，位于HLA-DPB1基因上的rs1042151（Met105Val）位點在韓國人群中被證實與阿司匹林哮喘易感性相關(guān)性最高（P=5.11×10-7），并且該陽性位點可上調(diào)HLA-DPB1的表達量，其與阿司匹林刺激后的FEV1 呈負相關(guān)關(guān)系，為韓國人群阿司匹林哮喘的一個風險因素[14]。

嗜乳脂蛋白樣-2（Butyrophilin-like 2，BTNL2）是近年發(fā)現(xiàn)的與B7 家族同源的分子，位于6p21 上HLA-Ⅱ和HLA-Ⅲ區(qū)域交界處，是一種T 細胞抑制分子，可向T細胞提供抑制信號，并在多種炎癥和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[15]。在日本人群中進行的一項GWAS和復制研究，結(jié)果鑒定了幾個與成人哮喘易感性相關(guān)候選位點，其中3 個GWAS 陽性突變位點rs404860（風險等位基因A）、rs3117098（風險等位基因G）和rs7775228（風險等位基因A），分別位于NOTCH4 基因、BTNL2 基因、HLA-DQA2 基因，均為炎癥相關(guān)基因。而國內(nèi)對廣西壯族人群進行的復制研究僅證實rs3117098 可能是中國壯族哮喘的危險因素，未能重復GWAS確定的rs404860和rs7775228與壯族人群哮喘的關(guān)聯(lián)[16]。

2.3 將哮喘患者分層的GWAS研究

一項國際多中心GWAS 研究首次對哮喘患者進行分層研究，該研究將患者按照不同特征分為兒童哮喘、遲發(fā)型哮喘、職業(yè)性哮喘和嚴重型哮喘亞組，并將不同亞組、血清IgE 水平以及GWAS 位點（分別位于IL1RL1/IL18R1、HLA-DQ、IL33、SMAD3、ORMDL3、GSDMB、GSDMA、IL2RB、SLC22A5、IL13、RORA 基因上或其附近）進行相關(guān)性分析[17]。結(jié)果顯示，rs9273349、rs2284033 位點分別與兒童哮喘亞組、遲發(fā)型哮喘亞組以及兒童聯(lián)合遲發(fā)型哮喘亞組發(fā)病密切相關(guān)，是上述3 種表型發(fā)病的高風險位點，而rs3771166、rs1342326、rs744910、rs2305480、rs3894194 陽性位點僅增加兒童聯(lián)合遲發(fā)型哮喘亞組的哮喘發(fā)病風險（P≤7.2×10-8），達GWAS 檢驗水平。另外，剩余3 個位點rs2073643、rs1295686、rs11071559 雖被證實與哮喘易感性有關(guān)聯(lián)，但未達GWAS 檢驗水平（P＜5×10-7）。該研究亦發(fā)現(xiàn)部分位點，如rs9271300，雖與哮喘發(fā)病無顯著性相關(guān)，但與患者血清IgE水平存在關(guān)聯(lián)，該位點在不同國家、民族均得到重復驗證。此后，研究者們發(fā)現(xiàn)越來越多的與哮喘發(fā)病相關(guān)的新基因和新位點。我們的研究結(jié)果亦表明，TSLP 基因上rs1837253 位點、BTNL2基因上rs3117098位點屬于中國廣西壯族人群哮喘患病的危險因素[11,16]，而ADAM33基因上S2（rs528557）位點屬于保護性因素，與降低壯族人群患哮喘風險相關(guān)[18]。

2.4 哮喘急性加重相關(guān)易感基因

盡管GWAS 已經(jīng)鑒定出了多個與哮喘發(fā)病相關(guān)的易感基因座，但目前對于哮喘急性發(fā)作的遺傳決定因素研究尚有限。2014 年，Bonnelykke 等[19]對丹麥哮喘兒童（2～6歲）進行的一項GWAS研究證實CDHR3 是哮喘惡化的易感性基因。2015 年，Michael 等[20]對兩個非西班牙裔白人哮喘兒童隊列組合進行的GWAS研究證實，CTNNA3基因內(nèi)含子區(qū)域中的rs7915695（P=2.19×10-8）、rs7923078（P=3.02×10-8）、rs7923279（P=3.34×10-8）和rs6480203（P=3.79×10-8）位點與哮喘急性加重顯著相關(guān)是致哮喘急性加重的高風險因素。2020 年，Yan 等[21]針對拉丁裔兒童和青少年進行的一項薈萃分析表明位于14q23.2 號染色體上 的FLJ22447 基因rs2253681 位點與重癥哮喘患者急性發(fā)作顯著相關(guān)（P=6.3×10-9），可顯著增加重癥哮喘惡化的概率。

3 GWAS 的局限性及展望

哮喘是一種復雜的異質(zhì)性疾病，是遺傳和環(huán)境因素交互作用的結(jié)果。關(guān)于哮喘的GWAS 研究涉及不同民族、性別、年齡，通過全基因組掃描，SNP分型已經(jīng)鑒定了大量的易感基因座及陽性位點。然而，現(xiàn)有的GWAS研究大都專注于探索SNP位點與疾病易感性之間的相關(guān)性，而在某種程度上忽視了基因缺失、拷貝數(shù)變異、串聯(lián)重復序列等其他變異。此外，經(jīng)研究鑒定的陽性SNP位點只能解釋疾病復雜遺傳性的小部分，其與疾病的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸不一定存在因果關(guān)系。最后，由于不同人群間等位基因頻率的差別以及連鎖不平衡導致了GWAS 結(jié)果的多樣性，同一個位點需要在不同的人群中重復，而樣本量少常導致重復率低或結(jié)果出現(xiàn)假陽性及假陰性。那么，對于陰性的GWAS結(jié)果是否有必要在不同的人群中進行重復驗證，檢驗水準應該取多大范圍等這些問題均值得我們進一步探索。

盡管GWAS目前還存在一些局限性，但不可否認的是它為探索哮喘遺傳學機制提供了一種新方法，經(jīng)GWAS驗證得到的易感基因及SNP位點也為哮喘遺傳學機制的深入研究提供了新的檢測指標。然而，這些檢測指標的在哮喘診治和評估預后方面的有效性及安全性需要進一步的實驗驗證，這將是未來GWAS領(lǐng)域研究的熱點和難點。