食管癌預(yù)后相關(guān)的miRNAs研究進展*

蘭會華，曾江輝，黃雪梅

（1.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院精準(zhǔn)聯(lián)合檢驗中心，南寧 530021；2.廣西南寧市第二人民醫(yī)院檢驗科，南寧 530031；3.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院藥物臨床試驗機構(gòu)辦公室，南寧 530021）

食管癌是人類常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率高居第6位，死亡率居第7位，我國男性食管癌的預(yù)計發(fā)病例數(shù)占全球所有男性食管癌的53.6%[1]。目前食管癌臨床治療仍以手術(shù)、放療及化療等綜合治療為主，5年生存率不到10%[2]，該疾病的高死亡率是患者面臨的主要挑戰(zhàn)，如何提高治療效果是臨床工作的當(dāng)務(wù)之急，隨著DNA測序和藥物基因組學(xué)等方面的研究進展，基于生物標(biāo)志物檢測的個體化治療逐漸成為一種趨勢。

MicroRNAs(miRNAs)存在于真核生物中，是一類可調(diào)控基因表達的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，研究證實miRNAs在癌癥的發(fā)生、進展和治療中起著重要的作用，可作為多種腫瘤患者特異性生物標(biāo)志物[3]。與食管癌相關(guān)的miRNAs 標(biāo)志物研究逐年增多，本綜述基于大量文獻突出具有前瞻性的研究，根據(jù)食管癌中miRNA的表達差異與生存期的關(guān)系，分析其作為預(yù)后生物標(biāo)志物和確定新的藥物靶點的潛力。

1 miRNAs 的基本生物學(xué)特性

miRNAs 是一種內(nèi)源性的非編碼RNA，其長度約為22～24個核苷酸[4]。許多生理過程和疾病的發(fā)生發(fā)展，包括癌癥、心血管和代謝性疾病，都高度依賴于miRNAs 的調(diào)控。miRNAs 主要通過抑制信使RNA（mRNA）翻譯或促進mRNA降解，從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后水平的表達，多數(shù)miRNAs 以不完全互補方式與其靶向mRNA 的3’UTR 區(qū)（3’untranslated region）結(jié)合，從而阻礙對該mRNA的翻譯來調(diào)控基因表達，但不影響mRNA 的穩(wěn)定性。此外，還存在其他的調(diào)節(jié)機制，包括遺傳多態(tài)性、miRNA 啟動子的甲基化、不對稱miRNA鏈選擇、與RNA結(jié)合蛋白（RBPs）或其他編碼/非編碼RNA 的相互作用等，多種調(diào)節(jié)機制不僅調(diào)控它們的表達，還影響它們的活性和/或生物利用度[5]。

miRNA 通過作用于靶向mRNA 促使其降解或抑制其翻譯，從而調(diào)節(jié)原癌基因、癌基因或腫瘤抑制因子等靶基因的表達，如具有抑制癌基因功能的miRNA表達降低可導(dǎo)致癌基因的過表達，而具有抑制抑癌基因功能的miRNA 過表達可導(dǎo)致抑癌基因表達降低，致癌基因的過表達或抑癌基因表達降低均可促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

2 食管癌中調(diào)控異常的miRNAs 及其有效靶點

食管癌主要有兩種類型：食管鱗狀細胞癌（ESCC）和腺癌（EAC），目前臨床上ESCC 占據(jù)95%，因此大量研究的主要組織學(xué)類型為ESCC。隨著DNA測序的發(fā)展，在過去的十年中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了成千上萬的miRNAs，而miRNA與其靶基因之間的互補性不完全，每個miRNA 可以靶向數(shù)百個靶基因，并且特定的基因可以被多個miRNA 靶向。當(dāng)前面臨最具挑戰(zhàn)性的問題是miRNA靶標(biāo)的識別和實驗驗證，在此，我們總結(jié)了在食管癌中調(diào)控異常并被驗證具備有效靶點的miRNAs，見表1。調(diào)控異常的miRNAs可下調(diào)或上調(diào)靶基因的表達水平，進而影響細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡來促進癌變，到目前為止，已發(fā)現(xiàn)大量miRNAs 的表達發(fā)生了顯著的改變，其中一些miRNAs 通過抑制抑癌靶基因發(fā)揮致癌的作用，另一些miRNAs 通過下調(diào)致癌靶基因表現(xiàn)出腫瘤抑制特性。miRNAs通過各種途徑對腫瘤細胞的增殖與凋亡，生長與遷移等生物學(xué)行為進行調(diào)控，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，從而影響腫瘤患者的預(yù)后。

表1 在食管癌中調(diào)控異常的miRNAs及其有效靶點

3 與食管癌預(yù)后相關(guān)的miRNAs

雖然與食管癌相關(guān)的miRNAs標(biāo)志物研究逐年增多，但多處于基礎(chǔ)研究階段，本綜述基于大量文獻突出具有前瞻性的研究，根據(jù)食管癌中miRNA的表達差異與生存期的關(guān)系，分析該miRNA作為判斷食管癌預(yù)后標(biāo)志物的效力。我們歸納總結(jié)了與食管癌預(yù)后相關(guān)的miRNAs 及其預(yù)后判斷指標(biāo)，包括總生存期(overall Survival,OS)，無病生存期（disease free survival,DFS）或無進展生存期（progress Free Survival,PFS），采用多變量分析對比miRNA高表達組和低表達組的生存時間，用優(yōu)勢比（odds ratio,OR）、風(fēng)險比值（hazard ratio,HR）、相對危險度（relative risk,RR）、95%置信區(qū)間（confidence interval,95%CI）和P值等進行描述，見表2。

表2 與食管癌預(yù)后相關(guān)的miRNAs

3.1 miRNAs作為食管癌的獨立預(yù)后因素

3.1.1 miR-146a的上調(diào)預(yù)示ESCC預(yù)后良好

miR-146a被證明能夠直接調(diào)控腫瘤的關(guān)鍵致癌靶點，如VEGF、Notch 或其他基因位點[16]。有研究采用侵襲實驗表明miR-146a-抑制劑可使食管癌細胞侵襲能力增加，在食管癌中miR-146a低表達會導(dǎo)致細胞增殖的增加和細胞凋亡的減少。分析miR-146a 在組織或血清樣本中的表達水平與臨床病理因素之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)血清miR-146a水平具有較高的敏感性和特異性，可以作為ESCC 診斷的一種良好的非侵入性生物標(biāo)志物。此外，通過比較腫瘤組織與正常組織中miR-146a 的表達差異及患者的生存時間，分析miR-146a在判斷食管癌患者預(yù)后中的價值，Kaplan-Meier 曲線顯示，其下調(diào)水平與OS 和PFS 呈負相關(guān)關(guān)系，進一步的單變量和多變量分析發(fā)現(xiàn)miR-146a 是ESCC 中OS 和PFS 的獨立預(yù)后因子，T期、N期和適當(dāng)?shù)闹委熞才cOS或PFS有關(guān)[31]。

3.1.2 miR-655的上調(diào)預(yù)示ESCC預(yù)后良好 ZEB1和TGFBR2 是TGF-b 信號通路的重要組成部分，被認為是miR-655 的直接靶標(biāo)，這表明通過對miR-655的異常下調(diào)激活TGF-b-ZEB1-e-cadherin軸可能會加速癌癥的進展。研究結(jié)果顯示，上皮細胞間質(zhì)化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）的抑制劑通過miR-655 靶向作用于ZEB1 和TGFBR2 可能是癌癥的預(yù)后良好的標(biāo)志和治療有效的預(yù)兆[38]。Kiuchi 等[14]的研究同樣證實，在食管癌中miR-655 的表達水平與較好的預(yù)后有顯著的相關(guān)性，miR-655 表達水平低是淋巴轉(zhuǎn)移的獨立危險因素和預(yù)后較差的因素。

3.1.3 miR-625 的下調(diào)預(yù)示ESCC 預(yù)后不良 Li等[17]發(fā)現(xiàn)miR-625與食管癌的腫瘤深度、分期、轉(zhuǎn)移有關(guān)，通過qRT-PCR 檢測169 對ESCC 和癌旁組織的miR-625表達水平，發(fā)現(xiàn)在ESCC組織中miR-625的表達水平明顯低于癌旁組織；通過K-M生存曲線和log-rank 檢驗進行比較，發(fā)現(xiàn)miR-625 低表達的ESCC 患者總生存率低于miR-625 高表達的患者。低表達組5年總體生存率低于高表達組(P=0.001)，提示miR-625下調(diào)可能是預(yù)測ESCC患者腫瘤進展和預(yù)后不良的新型分子標(biāo)記物。

3.1.4 miR-335 低表達提示ESCC 預(yù)后不良 研究顯示，ESCC標(biāo)本中miR-335的表達明顯低于正常食管組織，miR-335的表達水平與組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、和臨床分期有顯著的相關(guān)性，miR-335 可作為一個獨立的預(yù)后因子，其高表達有利于患者生存。經(jīng)過5年的隨訪調(diào)查，結(jié)果顯示miR-335在ESCC 中下調(diào)與患者總生存期密切相關(guān)，在腫瘤組織中miR-335表達較低的患者的總體生存率比高表達的患者更差，證明了在ESCC 中miR-335 表達的減少可能與差的預(yù)后相關(guān)[18]。

3.1.5 miR-506 的上調(diào)提示ESCC 預(yù)后不良 miR-506 是腫瘤發(fā)生的重要調(diào)控因子，研究表明通過綁定目標(biāo)mRNA，miR-506抑制靶基因的表達，參與調(diào)節(jié)和控制凋亡、周期阻滯、分化、EMT、細胞轉(zhuǎn)移以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的過程。Li 等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌中miR-506 高度表達，miR-506 可直接與細胞周期素依賴性激酶4/6(CDK 4/6)結(jié)合，然后與cyclinD 結(jié)合，刺激細胞周期從G1 期到S 期，此外，ets1蛋白是miR-506的重要靶點，ets1和miR-506的結(jié)合可能進一步影響食管癌血管生成，促進ESCC腫瘤細胞的生長、增殖和侵襲。根據(jù)ESCC 患者的長期隨訪顯示，與miR-506 低表達的ESCC 患者相比，miR-506高表達的患者生存率較低，多因素回歸分析顯示，miR-506的高表達是預(yù)測ESCC患者預(yù)后不良的重要獨立指標(biāo)。

3.1.6 miR-16上調(diào)提示ESCC預(yù)后不良 Li等[26]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-16 的過表達與細胞生長、遷移和侵襲、細胞周期調(diào)控的喪失以及細胞凋亡的減少有關(guān)，這一調(diào)控是通過下調(diào)靶基因基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP9)、維甲酸受體β2 (RAR-β2)和含有Kazal 基序的富含半胱氨酸的反轉(zhuǎn)錄蛋白(RECK)來實現(xiàn)的。此外，在ESCC 中，血漿中miR-16 的高表達與明顯減少的PFS 和OS 顯著相關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，miR-16 的血漿水平不僅在早期檢測中表現(xiàn)出令人滿意的診斷性能，而且對于接受放射治療的ESCC患者來說，是一種有用的血液預(yù)后生物標(biāo)志物[7]。

3.1.7 miR-191 上調(diào)預(yù)示ESCC 預(yù)后不良 有報道稱，MDM4作為一種癌蛋白，通過負調(diào)控P53的功能在P53抑癌通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用，定位于MDM4 非翻譯區(qū)的rs4245739 A＞C多態(tài)性作用于miR-191靶位點，導(dǎo)致MDM4表達降低。為了研究這種多態(tài)性與患ESCC的風(fēng)險及其在體內(nèi)的生物學(xué)功能之間的關(guān)系，用食道組織檢測基因多態(tài)性對MDM4表達的影響，對來自中國兩個地區(qū)的1 128例ESCC病例和1 150 例對照的兩組獨立病例-對照進行基因型測定，結(jié)果表明，MDM4 rs4245739 多態(tài)性有助于ESCC 的易感性，并支持了一種假設(shè)，即基因變異，中斷miRNA 介導(dǎo)的基因調(diào)控，可能會改變癌癥的風(fēng)險[23]。另一研究表明，miR-191 可能通過綁定EGR1mRNA 的3’UTR 減少EGR1 表達參與ESCC的進展，作為轉(zhuǎn)錄因子，EGR1參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，并發(fā)揮抑癌作用，進一步研究證實EGR1下調(diào)促進了ESCC 細胞的生長和侵襲[35]。多變量Cox 回歸分析表明，miR-191在ESCC組織中過表達與晚期臨床分期、轉(zhuǎn)移和ESCC 存活率低有關(guān)，miR-191 的上調(diào)是ESCC患者生存率低的獨立預(yù)后因素。為了進一步探討miR-191在ESCC中的預(yù)后價值，采用Kaplan-Meier 分析和log-rank 檢驗觀察miR-191 與總生存率的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在食管癌中，miR-191高表達組較低表達組存活時間短，預(yù)后差。

3.2 miRNAs聯(lián)合檢測在食管癌預(yù)后評估中的作用

3.2.1 miR-21/miR-375 聯(lián)合檢測在食管癌預(yù)后評估中的作用 一項探討血漿miR-21 在ESCC 患者中的診斷價值的研究發(fā)現(xiàn)，miR-21是食管癌患者的獨立預(yù)后因素，可作為預(yù)測ESCC 放化療療效和3年生存率的有效生物標(biāo)志物[33]。miR-21 上調(diào)提示食管鱗癌預(yù)后不良，使用miRNA-21 在化療的風(fēng)險分層和預(yù)測總生存期方面具有重要的臨床意義[39]。此外，miR-21 過表達患者的復(fù)發(fā)概率也明顯高于miR-21 低表達患者，證明miR-21 作為監(jiān)測食管癌復(fù)發(fā)的敏感標(biāo)志物的有效力[40]。

另一項研究[41]發(fā)現(xiàn)，在食管癌患者的組織和血清樣本中，miR-21表達水平顯著升高，miR-375則下調(diào)，這兩種miRNAs的表達與浸潤深度、TNM分期、血管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移都相關(guān)，表明miR-21和miR-375 在食管癌患者中均異常表達，是影響食管癌預(yù)后的獨立因素。進一步研究發(fā)現(xiàn)血漿中miR-21 高濃度組術(shù)后生存率明顯低于低濃度組，血漿miR-375 高表達組生存率優(yōu)于低表達組，血漿miR-21 高水平和miR-375低水平的患者預(yù)后明顯更差。ROC分析表明聯(lián)合檢測miR-21 和miR-375 的診斷價值高于miR-21或miR-375的單次檢測，聯(lián)合檢測可作為ESCC的診斷以及反映腫瘤的動態(tài)變化及預(yù)后效果的標(biāo)志物。

3.2.2 miR-21/miR-93 聯(lián)合檢測在食管癌預(yù)后評估中的作用 最近的研究表明，miR-93-5p 可能通過PTEN/PI3K/Akt通路影響PTEN下游蛋白p21和cyclin D1 的表達，促進受體細胞增殖。miR-93-5p 在食管癌患者血漿中的表達是對照組的1.39倍，采用logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)血漿miR-93-5p表達上調(diào)顯著增加食管病變的風(fēng)險，miR-93-5p 的過表達與不良的預(yù)后顯著相關(guān)，表明miR-93-5p 可作為食管癌診斷及預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物[42]。

Wang等[37]的研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌患者的血清樣本中，miR-21和miR-93的表達水平顯著升高，兩者的表達均與患者的TNM 分期密切相關(guān)，miR-21 和miR-93在ESCC患者中高表達可能提示由于腫瘤的轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致的更差的預(yù)后。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，放化療后miR-21 和miR-93 的表達明顯降低，提示觀察miR-21和miR-93的變化可用于預(yù)測患者放化療的療效。經(jīng)過對ESCC 患者進行3 年的追蹤回訪，發(fā)現(xiàn)其3年OS為37.50%，miR-21聯(lián)合miR-93檢測的AUC 用于評估ESCC 患者放化療的療效為0.894。Cox回歸分析顯示，患者高T期、N期、M期、高miR-21(＞5.60)和miR-93(＞3.87)的表達增加了死亡風(fēng)險，患者miR-21和miR-93的高表達預(yù)示ESCC 患者治療無效的風(fēng)險增加，表明miR-21 和miR-93聯(lián)合檢測可作為判斷ESCC患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

4 結(jié)語

綜上所述，許多miRNAs 標(biāo)志物與食管癌的預(yù)后密切相關(guān)，miRNAs 對于判斷食管癌預(yù)后生物標(biāo)志物和確定新的藥物靶點可能具有巨大的潛在作用。相信通過進一步的臨床試驗，將有更多的食管癌預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物用于指導(dǎo)臨床，為食管癌的治療及預(yù)后評估提供新的靶標(biāo)，提高臨床療效，以期可實現(xiàn)真正的個體化治療。