ORFV誘導(dǎo)HaCaT細胞CK1等分子mRNA轉(zhuǎn)錄波動

劉圓圓，張帆，于永忠

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

羊口瘡病毒（orf virus，ORFV）是痘病毒科副痘病毒屬的代表成員[1]，其基因組為兩端閉合的雙鏈DNA，大小約為138 kb，主要由兩端反向重復(fù)序列（inverted terminal reapt，ITR）[2]和中央核心區(qū)（central core region，CCR）組成[3]。病毒基因組共編碼134個基因，其中中央核心區(qū)編碼100個左右的基因能夠維持遺傳穩(wěn)定性，主要負責病毒的復(fù)制與裝配；而兩側(cè)反向重復(fù)序列呈共價閉合的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，主要包含一些與病毒毒力因子強弱有關(guān)和致病機理有關(guān)的基因，但兩側(cè)反向重復(fù)序列的基因常常有突變的情況發(fā)生，進而呈現(xiàn)出種屬間差異顯著的現(xiàn)象，不僅如此該區(qū)域在感染性宿主時還發(fā)揮著免疫調(diào)控作用。盡管ORFV感染只是在宿主口唇等部位形成局部上皮病變，但極易造成宿主嚴重的持續(xù)性感染以及繼發(fā)性感染[4-5]。在臨床學(xué)上，ORFV主要引起羊傳染性膿皰皮炎俗稱羊口瘡（Orf），即在患病羊只的口唇等部位皮膚或黏膜上皮形成增生性病變，以丘疹、膿皰、潰瘍和炎癥滲出以及桑葚狀厚結(jié)痂為主要特點[6-7]。羊口瘡常群發(fā)于開放性牧場，尤其是羔羊和免疫力低下的羊群中，雖然單純病毒感染的成年動物的死亡率在5%以下，但由于其它病原微生物的繼發(fā)感染或混合感染，往往致使病畜的死亡率會達到30%[8]，在一些防疫欠佳的牧場偶爾也會因爆發(fā)羊口瘡而會造成嚴重的經(jīng)濟損失，因此，該病在國內(nèi)外養(yǎng)羊國家受到普遍重視，在我國也被列為三類動物疫病。值得關(guān)注的是，羊口瘡也是一種人獸共患病[9]，常引起與患病動物密切接觸人群如農(nóng)場主或屠宰場工人和獸醫(yī)的體表關(guān)節(jié)部位形成丘疹膿皰，也有少部分人群會在口鼻處產(chǎn)生一些典型的臨床癥狀，針對羊口瘡疫情的防控和ORFV感染機制的研究成為全球研究的熱點。

角質(zhì)細胞又稱為表皮細胞是一種主要由角質(zhì)形成細胞組成的動態(tài)組織，也可以說是由四層鱗狀分層上皮細胞組成的，分別為基底層、棘層、顆粒層和角質(zhì)層，增殖只發(fā)生在與基底膜相鄰的基底層，而表皮細胞的分化及向表面移動都經(jīng)過棘層、顆粒層和角質(zhì)層，且分化往往伴隨著特異性標記物的（如中間絲形成蛋白、細胞角蛋白和橋粒鈣粘著蛋白家族、橋粒芯蛋白）表達量變化。經(jīng)研究證明角質(zhì)形成細胞都需經(jīng)歷從基底層向基底上層移動的一個嚴格控制的分化程序，而角質(zhì)形成細胞的增殖、分化和復(fù)制衰老之間的平衡對于防止表皮的病理改變起到重要作用。

細胞角蛋白（cytokeratin，CKs）是上皮細胞特征性標記物，在人表皮中是由Ⅰ型酸性和Ⅱ型堿性-中性角蛋白多肽雜聚物形成的一個大的蛋白質(zhì)家族，根據(jù)細胞角蛋白的分子質(zhì)量的不同將其分為20種，而細胞角蛋白表達含量的檢測往往有助于鑒別皮膚不同的上皮性結(jié)構(gòu)，也作為鑒別診斷腫瘤的方法之一，其在角化分層鱗狀上皮的基底層則會過量表達CK5（Ⅱ型）/CK14（Ⅰ型）[10]，最上面的表皮層（在棘層和顆粒層的上部）差異化的角化細胞表達CK2[11]，兩者中間的則是隨著基底層細胞會向上移動分化的棘層和顆粒層，往往會抑制CK5/CK14的表達取而代之的是表達細胞角蛋白1和10〔CK1（Ⅱ型）/CK10（Ⅰ型）〕[12-13]，與細胞角蛋白結(jié)合的蛋白如外聚蛋白，可以共同形成細胞內(nèi)角蛋白網(wǎng)絡(luò)用來提供抵抗機械應(yīng)力[14]。

研究表明，人類永生化表皮細胞系（HaCaT）是自發(fā)轉(zhuǎn)化的細胞系，有良好的表皮分化能力，且無致癌性，作為模式細胞目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于相關(guān)領(lǐng)域的研究[15-18]。研究利用ORFV-HaCaT感染模型，通過RT-PCR等方法監(jiān)測病毒感染對細胞CK1/CK10等Marker分子的實時影響，為闡明ORFV感染引起宿主黏膜上皮增生與分化的誘因，以及未來抗病毒藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

羊口瘡病毒（ORFV）OV-HLJ/05株，由實驗室分離于黑龍江省大慶市某私營牧場，保存于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命技術(shù)學(xué)院細胞生物學(xué)與分子病毒試驗室；人類永生化表皮細胞（HaCaT），由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院韓英浩老師惠贈，凍存于實驗室。

1.2 細胞傳代培養(yǎng)與處理

HaCaT細胞從液氮中取出，于37℃水浴鍋中復(fù)蘇后，置于添加了10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基中，放入含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當培養(yǎng)細胞長至培養(yǎng)皿底部60%～70%融合度時通過細胞計數(shù)進行傳代、凍存。試驗使用病毒感染處理一定時間，然后收集細胞，裂解、提取RNA，進行后續(xù)試驗。

1.3 TCID50檢測

取1×105個HaCaT細胞種植于96孔板內(nèi)，將ORFV病毒液用細胞培養(yǎng)液進行10倍系列稀釋至10-1~10-9接種于96孔板內(nèi)細胞，每個稀釋度接種8孔，每孔100μL病毒稀釋液（設(shè)有未接毒的細胞對照），置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中，每天觀察細胞狀態(tài)。待細胞孔出現(xiàn)50%CPE，運用Reed-Muench算法來計算毒株的TCID50。其中距離比例=（高于50%的百分數(shù)-50%）/（高于50%的百分數(shù)-低于50%的百分數(shù)）；LgTCID50=距離比例×稀釋度對數(shù)之間的差+高于50%的病變率的稀釋度的對數(shù)。

1.4 細胞活性和細胞死亡率的檢測

將細胞傳代至96孔板中，設(shè)置試驗組、對照組和空白組。當傳代細胞數(shù)量達到可鋪滿每孔底部60%～70%時，進行細胞接毒處理，然后在病毒感染不同時間段內(nèi)，按每孔液體總體積的10%加入2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽（CCK-8），再避光移入CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min，然后移至多功能酶標儀上讀取數(shù)值，測定分析細胞活力。

1.5 qRT-PCR分析

采用100μL TCID50病毒感染細胞后，于不同時間段收集細胞，進行細胞計數(shù)，用mRNA快速提取試劑盒（Solarbio，China）提取總RNA，然后用Novodrop 2000測定提取RNA的濃度，并依據(jù)PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（TaKaRa，China）說明進行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA（根據(jù)基因參考序列設(shè)計的特異性引物列于表1中）。使用熒光染料法（NovoStart SYBR qPCR Super Mix Plus，Novoprotein）試劑盒處理得到的cDNA，移入Bio-Rad CFX96的qRT-PCR系統(tǒng)進行RT-PCR檢測。擴增條件為：95℃，作用時間1 min，40個循環(huán)；95℃，主要是20 s；60℃，作用1 min和72℃，作用30 s。數(shù)據(jù)分析采用2-△△CT方法，將所有試驗組目的基因中的mRNA歸一化到內(nèi)參GAPDH標準。整個過程均使用DEPC水處理過的材料及用具，防止RNA降解。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequence for qRT-PCR

1.6 統(tǒng)計與分析

試驗中，每個試驗均設(shè)置三組平行試驗，每組平行試驗又均設(shè)有三個重復(fù)孔。反復(fù)確定得到的所有數(shù)據(jù)均以平均值±SD表示，對于兩組以上顯著性差異的比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA test），而其他數(shù)據(jù)比較采用GraphPad Prism軟件中非配對t檢驗，其中P<0.05視為顯著（*）；P<0.01視為極顯著（**）。

2 結(jié)果與分析

2.1 TCID50檢測病毒毒價

OV-HLJ05株ORFV分離株來源于東北地區(qū)一起羊傳染性膿皰病暴發(fā)疫情，收集患病動物口唇部的丘疹結(jié)痂，研磨搗碎提取病毒粒子，在用Madin-Darby牛腎細胞（MDBK）進行幾輪細胞擴繁病毒后，用蔗糖梯度超速離心法純化成熟的病毒粒子，接著按照實驗室病毒TCID50操作規(guī)程，驗證了ORFV的TCID50（如表2所示）。采用Reed-Muench法計算距離比例為0.5，LogTCID50等于-7.5，則得出TCID50數(shù)值為10-7.5，即試驗中所使用的ORFV的TCID50為10-7.5·0.1 mL-1，將所有病毒儲存于HaCaT細胞中，滴定保存于-80℃以供進一步使用。

表2 ORFV的TCID50效價Table 2 The TCID50 of ORFV

2.2 ORFV影響HaCaT細胞增殖

通過CCK-8檢測HaCaT細胞存活率結(jié)果如圖1所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ORFV在一定程度上能夠影響細胞的增殖，尤其是在病毒感染24 h后，能較明顯的抑制細胞增殖。但除了凋亡壞死的細胞，病毒對細胞增殖影響具體機制仍需進一步探究，除此之外ORFV是否可以促進細胞分化，需要通過細胞角蛋白（CKs）變化情況加以分析。

2.3 ORFV感染HaCaT細胞后引起的角蛋白變化

根據(jù)圖1結(jié)果顯示的ORFV對HaCaT細胞增殖的影響情況，研究采用ORFV-HaCaT體外感染模型進一步研究了病毒感染后對HaCaT細胞角蛋白表達的影響。如圖2所示，采用RT-PCR方法檢測了HaCaT細胞中各個分化階段表達的標志物及CKs的mRNA水平變化。結(jié)果顯示，在ORFV感染細胞整個過程中，細胞內(nèi)標志物都呈不同的變化趨勢。其中，橋粒芯糖蛋白3（DSG3）作為棘層中細胞間的橋粒，在病毒感染后細胞間橋粒表達量少于對照組，則表明病毒感染減少了細胞間連接，影響細胞增殖；而Ki67是一種存在于除表皮層外的各個角質(zhì)細胞中的核蛋白，可以作為一個細胞增殖的標記物，且Ki67在細胞增殖的各期（G1、S、G2和M）中均有表達，但在細胞靜止期G0期幾乎不表達。由此，可以從基因水平上證明病毒感染細胞后影響細胞增殖。此外，表皮層表達的CK2沒有異常變化。值得關(guān)注的是，基底層表達的CK5/CK14；棘層和顆粒層表達CK1/CK10在病毒感染時變化較為顯著。尤其是棘層、顆粒層表達的CK1與CK10，這對角蛋白的變化趨勢較對照組最為明顯。整體變化呈正向波動影響了細胞正常分化的趨勢，所有檢測分析結(jié)果均列于圖2中。

圖1 ORFV感染6~66 h內(nèi)對細胞增殖的影響Fig.1 Effect of ORFV infection on cell proliferation within 6-66 h

圖2 ORFV感染HaCaT細胞不同時間段內(nèi)CKs變化情況Fig.2 Changes in CKs of HaCaT cells infected by ORFV at different time periods

3 討論

ORFV是一種人畜共患病毒，臨床上可造成人或動物表皮增生、角質(zhì)化不全或角質(zhì)化過度、角化細胞變性以及炎癥浸潤反應(yīng)等皮膚病變。此外，ORFV還可以反復(fù)感染宿主，宿主再次感染后盡管病變部位面積縮小，恢復(fù)時間縮短，但受到感染的動物仍然存在繼發(fā)和混合感染的風險。在病理學(xué)方面研究表明，ORFV主要感染宿主皮膚的角質(zhì)形成細胞即棘層細胞，因為如果角質(zhì)細胞過度增生、分化，會導(dǎo)致病畜飲食功能障礙，久病難愈。由此，病毒與宿主細胞互作，特別是病毒感染影響細胞增殖、分化的特異性標記物的變化趨勢，是目前國內(nèi)外學(xué)者熱衷于研究的焦點。2019年，Muhsen等[19]采用3D體外感染模型研究ORFV對角質(zhì)形成細胞的CKs和loricrin進行了研究。據(jù)報道，ORFV在上皮組織模型中，會促使CK1和CK10分子的減少，并以此表明角質(zhì)細胞的去分化的趨勢。

在分子機制方面具體研究顯示，CK1表達變化通常反映了角質(zhì)細胞系基底細胞的狀態(tài)[20],而CK10消長也常通過受控于蛋白激酶B（PKB，也稱為Akt）和非典型的PKC通路，從而影響細胞增殖[21]，故角質(zhì)形成細胞的進一步分化（從棘層到顆粒層）往往伴隨著CK1抑制及CK10的轉(zhuǎn)錄表達[22]。因此，CK1與CK10是角質(zhì)細胞增殖分化的首要標志（Marker）分子[23]。在ORFV感染中，上皮組織因細胞病變（cytopathic effect，CPE）而過度角質(zhì)化形成桑葚狀結(jié)痂樣的病灶，期間血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）也促進了上皮細胞增生[24]。盡管這樣，還是懷疑ORFV對這些CKs的影響并不單純，尤其是感染初期階段，與宿主細胞對于CKs的競爭細節(jié)，可能會讓我們更為客觀地描述ORFV侵染細胞行為，從而可以進一步探索病毒與細胞相互作用的分子機制。

試驗中結(jié)果顯示了CK1與CK10受病毒影響表達水平產(chǎn)生了波動，反映出病毒與細胞間競爭的動態(tài)關(guān)系。此現(xiàn)象可能由于病毒與宿主細胞之間相互作用非常復(fù)雜，所以在一個不確定性因素較多的系統(tǒng)中得出的結(jié)論可能不具有統(tǒng)計學(xué)意義。而在相對獨立的體系中，許多類似的研究對于客觀評價數(shù)據(jù)的可靠性還是可取的。而人體永生化表皮細胞系（HaCaT）經(jīng)常被用作角質(zhì)形成細胞功能的研究模型，也為體外研究角質(zhì)形成細胞的生長與分化之間轉(zhuǎn)換提供了一個合適的研究平臺。研究首先利用ORFVHaCaT感染模型，通過CCK-8方法檢測了病毒感染6~66 h期間細胞的存活率與細胞活性。結(jié)果顯示在病毒存在的18 h和60 h區(qū)間內(nèi)細胞活性受到較大影響（如圖1所示）。此結(jié)果或許驗證了病毒復(fù)制和裝配等行為干擾了細胞正常的生理和代謝，同時也存在細胞啟動凋亡這種程序性死亡的機制以抑制病毒復(fù)制的可能性，但具體的調(diào)節(jié)機制還需進一步研究。

除了研究病毒對細胞增殖的影響，又進一步采用RT-PCR的方法監(jiān)測病毒感染對細胞CK1/CK10等Marker分子的實時影響，以闡明ORFV感染引起宿主黏膜上皮細胞增生與分化的趨勢。此前曾有文獻報道，橋粒芯糖蛋白3（DSG3）分子作為肺及皮膚等器官的自身免疫性疾?。ㄌ彀挴彛┮环N主要的特異性抗原，一旦基因沉默會導(dǎo)致HaCaT細胞黏附缺陷和細胞增殖能力銳減[25]。而Ki67分子作為細胞增殖的主要標志物，能夠示蹤G和S期細胞增殖情況，可通過檢測Ki67表達水平來輔證細胞增殖情況[26]。試驗運用了RT-PCR檢測DSG3及Ki67的mRNA表達水平，證明ORFV感染HaCaT細胞后一定時間內(nèi)可影響細胞的增殖。除此以外，我們又檢測了其他細胞形態(tài)相關(guān)的CKs，諸如CK2等，但CK2在ORFV感染過程中變化趨勢不明顯。曾有研究表明，CK1和CK10作為棘層細胞分化的標志物，在HaCaT細胞中卻能表現(xiàn)出從無染色到強染色的異質(zhì)性染色形式，即HaCaT細胞可以同時表達CK1和CK10兩種分子，或者CK1和CK10其中之一，或者CK1和CK10都不表達。而在角蛋白表達上，HaCaT細胞也存在異質(zhì)性，即具有基底細胞和棘層細胞的雙重特質(zhì)[27]。試驗正是考慮到該細胞具有的這種雙重特性，著重闡述了ORFV感染HaCaT細胞后在不同時段的CKs的表達量變化，在6 h試驗組中CK5/CK14的轉(zhuǎn)錄水平就高于對照組；而在6~24 h，試驗組中CK1/CK10的轉(zhuǎn)錄水平也高于對照組。由此，推測病毒感染細胞后會影響細胞增殖或者促進細胞異常分化。而且，在6~24 h使得細胞停留在棘層細胞分化狀態(tài)的同時病毒感染細胞也有分化至表皮層的趨勢。盡管如此，病毒對于細胞的上述影響及其內(nèi)部的分子機制，需要從病毒對細胞分子信號通路的影響研究方面得到進一步證實。目前，通過文獻查找與研究發(fā)現(xiàn)有4個主要的細胞信號通路，可能受到ORFV不同程度的干預(yù)，從而造成試驗中細胞CKs的異?，F(xiàn)象。這些通路包括PI3K/Akt通路[28]、MAPK（Raf/MEK/ErK、JNK和p38）通路[29]、Wnt/β-catenin通路[30]和Hippo通路[31]等。當然，也不排除病毒同時干預(yù)IP3-Ca2+和DAGPKC雙信號通路[32]，以及各個信號通路之間交互作用可能性，總之還需進一步通過加入信號通路抑制劑來探究病毒感染細胞后，可能調(diào)控的信號通路影響細胞分化的分子機制。

4 結(jié)論

試驗主要通過CCK-8法檢測病毒對細胞活性以及存活率的影響，結(jié)果顯示在病毒感染24 h后能明顯影響細胞的增殖情況，除此之外又通過qRTPCR方法在mRNA轉(zhuǎn)錄水平，檢測了ORFV感染HaCaT細胞后在不同時間段對DSG3、Ki67及CKs等分子表達變化的影響，結(jié)果表明，病毒感染可以使CK1/CK10等分子表達產(chǎn)生波動，影響了細胞分化趨勢，之后將進一步探索對細胞增殖與分化的具體影響以及相應(yīng)的分子機制研究?？傊?，研究為了解病毒與宿主細胞間“互作”奠定了基礎(chǔ)，也為抗羊口瘡病毒感染的深入研究提供了參考。