基于時(shí)間分辨免疫熒光法的降鈣素原試劑盒臨床性能評價(jià)

李登紅（通信作者），陸建偉，王洪濤，蔡美玲，農(nóng)麗松，黃光強(qiáng)

1 巴迪泰（廣西）生物科技有限公司 （廣西南寧 530031）；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 （廣西南寧 530022）

新生兒因免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不成熟，肺部易被感染，其中以新生兒肺炎較為多見，其易導(dǎo)致死亡，病死率約為5%～20%[1-2]。新生兒肺炎早期通常不易區(qū)分是由如細(xì)菌、病毒或衣原體等何種病原體感染所致，因此易導(dǎo)致抗生素藥物被廣泛濫用。目前，降鈣素原（procalcitonin，PCT）作為可靠、有效的炎癥標(biāo)志物，在感染的早期診斷中表現(xiàn)出較高的臨床價(jià)值[3]。PCT 為沒有激素活性的降鈣素前肽物質(zhì)，在人體內(nèi)的半衰期較長，可達(dá)到25～30 h，穩(wěn)定性優(yōu)良[4]。

目前，臨床上測定PCT 的常見方法包括酶聯(lián)免疫熒光法、免疫熒光法、電化學(xué)發(fā)光法等[5]，其中普通PCT 即時(shí)檢驗(yàn)（point-of-care testing，POCT）產(chǎn)品的檢測靈敏度較低，大部分在0.1 ng/ml 以上，無法精確判斷感染程度，對于細(xì)菌性肺炎，部分患者的PCT 值會＜0.1 ng/ml[6]，普通PCT POCT 產(chǎn)品易判讀為假陰性，導(dǎo)致患者錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)。超敏PCT（PCT plus）檢測試劑盒是巴迪泰（廣西）生物科技有限公司生產(chǎn)的一種能夠快速進(jìn)行診斷的試劑盒，將層析技術(shù)和時(shí)間分辨免疫熒光技術(shù)進(jìn)行融合，利用生物學(xué)抗體和抗原的特異性反應(yīng)，最低可檢測到0.01 ng/ml 濃度，靈敏度得到較大提高，檢測時(shí)只需與配套的熒光免疫分析儀進(jìn)行簡單的操作，12 min 即可得到結(jié)果，對于新生兒肺炎的診斷效果理想。為證明基于時(shí)間分辨免疫熒光法的PCT plus 檢測試劑盒的臨床性能，以法國生物梅里埃股份有限公司生產(chǎn)的PCT 測定試劑盒（酶聯(lián)免疫熒光法）作為對照，對PCT plus 檢測試劑盒開展性能方面的驗(yàn)證，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年10—12月廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的150例患者的血清樣本作為研究對象，其中男80例，女70例；年齡0～85歲；血清樣本來自輕、重度炎癥患者及健康人，為準(zhǔn)確評估兩種方法的一致性，排除嚴(yán)重溶血樣本或有黃疸樣本或樣本量少的樣本。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑

酶聯(lián)免疫熒光法：PCT 測定試劑盒（酶聯(lián)免疫熒光法）及自配校準(zhǔn)品、質(zhì)控品（法國生物梅里埃股份有限公司），mini-VIDAS 全自動熒光免疫分析儀（法國生物梅里埃股份有限公司）。

時(shí)間分辨免疫熒光法：PCT plus 檢測試劑盒（免疫熒光干式定量法）及自配校準(zhǔn)品、質(zhì)控品[巴迪泰（廣西）生物科技有限公司]，A2000干式熒光免疫分析儀[巴迪泰（廣西）生物科技有限公司] 。

1.2.2 評價(jià)方法

（1）精密度評價(jià)：參考CLSI EP15-A2《用戶確認(rèn)精密度和正確度的性能驗(yàn)證指南-第二版》文件，采用PCT 測定試劑盒（酶聯(lián)免疫熒光法）和PCT plus 檢測試劑盒（時(shí)間分辨免疫熒光法）分別檢測2個(gè)濃度的質(zhì)控血清（S1、S2）及自配質(zhì)控品（Lv.1、Lv.2），4次/d，每次間隔4 h，連續(xù)測定5 d，計(jì)算總變異示數(shù)（coefficient of variation, CV）。（2）準(zhǔn)確度評價(jià)：采用PCT 測定試劑盒（酶聯(lián)免疫熒光法）和PCT plus 檢測試劑盒（時(shí)間分辨免疫熒光法）分別檢測150例患者的血清樣本，其中檢測血清樣本濃度涵蓋試劑盒檢測范圍，使用t檢驗(yàn)進(jìn)行結(jié)果評價(jià)，計(jì)算酶聯(lián)免疫熒光法和時(shí)間分辨免疫熒光法檢驗(yàn)值的偏差。（3）相關(guān)性評價(jià)：采用PCT測定試劑盒（酶聯(lián)免疫熒光法）和PCT plus檢測試劑盒（時(shí)間分辨免疫熒光法）分別檢測150例患者的血清樣本，其中檢測血清樣本濃度涵蓋試劑盒檢測范圍，使用一元線性回歸對結(jié)果進(jìn)行擬合，計(jì)算一元線性方程和相關(guān)系數(shù)。（4）一致性評價(jià)：使用Bland-Altman 法、ROC 曲線分析及Kappa一致性檢驗(yàn)進(jìn)行一致性評價(jià)。

1.3 評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

（1）精密度：批內(nèi)總CV＜10%，表示精密度良好。（2）準(zhǔn)確度：酶聯(lián)免疫熒光法和時(shí)間分辨免疫熒光法偏差＜10%，表示準(zhǔn)確度良好。（3）相關(guān)性：一次線性回歸方程，斜率為0.9～1.1，r＞0.975，表示相關(guān)性良好。（4）一致性：Bland-Altman 散點(diǎn)分析超出±1.96 SD 范圍比例＜5%，ROC 曲線下面積≥0.9、Kappa值≥0.75，表示一致性較好。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Origin8 SR4[v8.0951（B951）]和MedCalc（Version 18.2.1）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用一元線性回歸分析法，一致性分析采用Bland-Altman 法和Pearson相關(guān)系數(shù)，采用Kappa檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 精密度

時(shí)間分辨免疫熒光法檢測PCT 的CV＜10%，見表1。

表1 酶聯(lián)免疫熒光法和時(shí)間分辨免疫熒光法檢測結(jié)果比較

2.2 準(zhǔn)確度

使用t檢驗(yàn)分析，在置信限P=0.05條件下，t臨界值為2.05，時(shí)間分辨免疫熒光法檢測結(jié)果均值為4.02 ng/ml，酶聯(lián)免疫熒光法檢測結(jié)果均值為3.87 ng/ml，兩種分析方法的偏差為3.88%。

2.3 相關(guān)性

酶聯(lián)免疫熒光法和時(shí)間分辨免疫熒光法檢測150例患者血清樣本的結(jié)果一元線性回歸方程為y=1.018x+0.0121，r=0.9911＞0.975，P＜0.01，在試劑盒檢測范圍內(nèi)（0.01～50.0 ng/ml），兩種分析方法成線性，如圖1所示。

圖1 兩種分析方法檢測結(jié)果的線性相關(guān)圖

2.4 一致性

基于Bland-Altman 法，對150例患者血清樣本的檢測結(jié)果繪制散點(diǎn)圖，在試劑盒線性檢測范圍內(nèi)，兩種分析方法的差值表現(xiàn)出均勻分布，如圖2所示，僅有4個(gè)點(diǎn)超出±1.96 SD 范圍，占比2.67%，證明兩種分析方法具有良好的一致性。

圖2 兩種分析方法的Bland-Altman 散點(diǎn)圖

在Cut Off值（0.5 ng/ml）下的ROC曲線下面積為0.990，P＜0.01，靈敏度為95.29%，特異度為98.44%，如圖3所示；以Cut Off 值（0.5 ng/ml）作Kappa檢驗(yàn)，Kappa值為0.891，可以認(rèn)為兩種分析方法的診斷結(jié)果無顯著性差異。

圖3 兩種方法檢測PCT 的ROC 曲線

3 討論

新生兒出生時(shí)由于抵抗力差，易被各種病菌感染，且臨床上早期出現(xiàn)感染表現(xiàn)比較隱蔽[7]，部分患兒表現(xiàn)有咳嗽、咳痰、體溫升高等現(xiàn)象，但易被家長忽視，有研究顯示，在中國西部農(nóng)村已確定死亡原因的423例新生兒中，約有34.5%死于肺炎[8]。PCT 作為敏感生物指標(biāo)，與新生兒肺炎病情嚴(yán)重程度及病原菌感染類型有一定關(guān)系，可用于肺炎的早期診斷[9]。

目前，臨床上使用酶聯(lián)免疫熒光法測定PCT 的效果較好，如法國生物梅里埃股份有限公司的PCT 測定試劑盒，其精密度、靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度均得到廣泛認(rèn)可，但最低檢測限只能達(dá)到0.05 mg/ml。PCT plus 檢測試劑盒使用時(shí)間分辨熒光免疫法[10]，將探測物質(zhì)、反應(yīng)緩沖液和血樣混合，緩沖液中的PCT 抗體與血樣中的PCT 抗原結(jié)合形成抗體-抗原復(fù)合物；將混合樣本加入到反應(yīng)板的加樣孔中，通過毛細(xì)血管作用在硝化纖維基質(zhì)的檢測帶上擴(kuò)散被檢測帶上的另一種PCT 抗體所捕獲；血樣中的PCT 抗原越多，檢測帶上形成的抗體-抗原-抗體復(fù)合物積聚也越多。熒光信號的強(qiáng)度反映了被捕獲的PCT 抗原數(shù)量，通過配套免疫熒光分析儀的判斷，能夠定量檢測出血液樣本中的PCT抗原濃度。為提高檢測試劑盒的靈敏度和特異度，采用親和素和熒光素放大系統(tǒng)[11]，將熒光信號進(jìn)行放大，提高了檢測靈敏度和特異度，使最低檢出限達(dá)到0.01 ng/ml，解決了普通POCT 產(chǎn)品靈敏度低的問題。

本研究結(jié)果顯示，時(shí)間分辨免疫熒光法擁有良好的精密度，檢測PCT 的CV＜10%；時(shí)間分辨免疫熒光法和酶聯(lián)免疫熒光法之間存在一定的系統(tǒng)性偏差（3.88%），符合生產(chǎn)廠家的聲明；兩種分析方法擁有良好的相關(guān)性（斜率為1.018，r=0.9911＞0.975，P＜0.01）；在Cut Off值（0.5 ng/ml）下的ROC 曲線下面積為0.990，P＜0.01，靈敏度為95.29%，特異度為98.44%，Kappa值為0.891，說明兩種分析方法一致性較好。

綜上所述，時(shí)間分辨免疫熒光法檢測PCT 的結(jié)果良好，表現(xiàn)在檢測重復(fù)性良好，和酶聯(lián)免疫熒光法偏差小，相關(guān)性高，一致性強(qiáng)，用戶可結(jié)合實(shí)際實(shí)際情況選擇時(shí)間分辨免疫熒光法的PCT plus 檢測試劑盒。