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    現(xiàn)代電子顯微鏡技術在病毒檢測中的應用進展

    2021-11-30 22:29:21丁巳娟韓起陳生林馮東方
    西藏醫(yī)藥 2021年2期
    關鍵詞:病毒檢測電鏡切片

    丁巳娟 韓起 陳生林 馮東方

    西藏軍區(qū)總醫(yī)院 西藏拉薩 850000

    電子顯微鏡技術(Electron—microscopy,EM)已經有近100 年歷史,適應其不同功能需要逐步發(fā)展形成透射電鏡和掃描電鏡技術,分別用于樣品內部結構及自然形貌的分析。電鏡的分辨率不斷提高,目標是超微檢測、動態(tài)觀察和分析計算有機結合。病毒是目前所知結構最為簡單的生命單位,具有特定超微結構特征,但是病毒具有復雜的變異及進化過程。在19 世紀末,人們就已經發(fā)現(xiàn)存在比細菌還小的生物有機體,但是真正觀察到病毒還是在電鏡技術發(fā)展成熟后。因此電鏡技術是推進病毒學發(fā)展的重要手段。

    1 電鏡技術檢測病毒的優(yōu)勢

    電鏡技術檢測病毒的主要優(yōu)點在于無需特異性生物試劑可直接觀察,而分子生物學、血清學檢測方法則需要特異性探針發(fā)現(xiàn)病毒。一般情況下,新發(fā)疾病的致病因素很難確定,但是運用電鏡技術可直接觀察病原體,如病毒。然而分子生物學檢測手段需提前獲取檢測對象的生物特異性。雖然電鏡技術只能觀察到病毒表征不能確定種屬,但其觀察數(shù)據(jù)給其他更具特異性的生物學檢測手段指明了目標。如果病毒的體外培養(yǎng)模型尚未建立,生物學方法研究病毒就顯得非常困難。此時電鏡就顯得格外重要,即使當今分子生物學診斷檢測技術迅猛發(fā)展,也需先通過電鏡技術來檢測一些新的、非常規(guī)的病毒為其做進一步研究鋪墊。電鏡還可以用來研究病毒附著、復制的分子機制,其研究結果有助于開發(fā)抗病毒藥物和疫苗。

    2 電鏡技術病毒發(fā)現(xiàn)史

    Ernst Ruska 和Max Knoll 發(fā)明了電鏡,隨后Ruska、Kausche 和Pflankuch 首次用電鏡觀察到病毒。1952 年,電鏡技術首次揭開了脊髓灰質炎病毒的面紗。20 世紀50 年代中期,采用電鏡技術開始進行對病毒與宿主細胞關系的研究。而早期的病毒學分類主要就是依靠電鏡觀察結果。通過采集糞便標本,用負染色技術,用電鏡還發(fā)現(xiàn)了許多腸道病毒。電鏡技術的運用成功發(fā)現(xiàn)了1976 年大暴發(fā)的埃博拉病毒。1999 年,運用電鏡技術發(fā)現(xiàn)了可以引起皮膚異常病變、免疫抑制的病毒-多瘤病毒。此外,最為著名的是用電鏡技術發(fā)現(xiàn)了SARS 的致病因子-冠狀病毒[1]。使用電鏡觀察病毒并不要求病毒的完整性或致病性,因此成功鑒定出天花病毒。另外,由于電鏡技術檢測速度快,不少國家的CDC 部門常用其監(jiān)測生物(病毒)武器[2]。目前,用來快速檢測新發(fā)病毒的電鏡技術已經越來越成熟和規(guī)范。

    3 病毒檢測的電鏡技術

    3.1 負染色技術

    負染技術 (Negative staining) 是透射電鏡觀察病毒形態(tài)的核心技術之一,其應用很大地促進了病毒形態(tài)學和病毒電鏡檢測的發(fā)展[3]。對于病毒樣品的檢測,需要在銅網(wǎng)上放置一支持膜才能保留這些小顆粒病毒。常用的膜劑有:Formvar,Collodion,Butvar,和Pioloform[4]。這些膜劑可形成超薄膜且具有導電性,在電子束照射下不會融化?,F(xiàn)已有商品化的鋪好膜的銅網(wǎng),但由于膜的有效保存時間很短,因此,其成品銅網(wǎng)商品化受到一定限制。由于要保證樣品在膜上的平整性,這些膜還必須是具有親水性的。

    常用的負染劑有uranyl acetate 和 phosphotungstic acid (PTA)。Uranyl acetate 既是固定劑也是染色劑,可觀察到病毒完整形態(tài)和顆粒表面,但該試劑在磷酸鹽存在下會發(fā)生沉淀且具有放射性。PTA 不具有放射性,在磷酸鹽下不會沉淀,可觀察到有包膜病毒表面刺突,但在幾個小時后會降解病毒[4]。

    為了提高病毒負染樣本檢測敏感度,可以采用提高樣本內病毒濃度的方法和提高載網(wǎng)吸附病毒能力的方法這兩種方法,而提高樣本內病毒濃度的方法包括超速離心法、瓊脂過濾法、凍干法、超濾法、沉淀法、離子交換捕獲法、假復型法、免疫負染法,提高載網(wǎng)吸附病毒能力的方法包括輝光放電、紫外線照射、多聚賴氨酸 (Poly2L2lysine) 增強吸附法、增加載網(wǎng)表面親水性的試劑等方法[5]。

    3.2 超薄切片技術

    由于組織標本太厚,電子束不能全部穿透,因此就需要使用超薄切片技術對組織標本進行預處理。常規(guī)用于組織的超薄切片技術也適用于病毒檢測。制作超薄切片的過程主要有固定、漂洗、脫水、浸透、環(huán)氧樹脂包埋、超薄切片。超薄切片應用于病毒檢測的主要缺點在于,如果病毒僅存在樣品局部,那么切片時很可能得不到含有病毒的切片[6]。對于體外細胞培養(yǎng)下的病毒研究,電鏡觀察病毒時,可將這些細胞做離心處理,再對沉淀物用戊二醛固定,使它們聚集成團塊,再做后續(xù)的常規(guī)切片處理。

    超薄切片染色作為電鏡生物樣品制備的最后一步,染色好壞直接影響到電鏡照片的質量。文獻報道,超薄切片過程中對樣本采用插入式滴染法、連續(xù)染色方式、微波輔助染色等技術能夠有效提高染色效率,減少染色污染,進而在電鏡下顯示清晰的超微結構[7]。

    3.3 免疫凝集反應

    1941 年,病毒學家通過煙草花葉病毒首次觀察到抗體-病毒凝集反應[8]。Almeida 和Waterson 用電鏡觀察到病毒顆粒凝集現(xiàn)象[9],免疫電鏡應運而生,它可以有效提高病毒檢測的靈敏度。液相免疫電鏡檢測觀察病毒時利用病毒和抗體反應的特異性找到病毒,但如果抗體過量可能導致病毒表面被包裹,不利于病毒的觀察。而對于固相免疫電鏡,抗體首先需粘附在銅網(wǎng)上后再和病毒顆粒發(fā)生作用,使病毒顆粒固定在銅網(wǎng)上進行負染色。免疫電鏡可被用于觀察那些研究較為表淺、不能在體外細胞培養(yǎng)條件下進行孵育的病毒,常常采用抗血清直接處理病毒感染標本,篩選出病毒進行免疫電鏡觀察。而對于那些新發(fā)未知病毒,其抗原抗體特性未知,則可采用廣譜的丙種球蛋白來篩選病毒進行免疫電鏡觀察。

    3.4 免疫共定位

    電鏡技術結合免疫金、免疫金銀標記法對病毒進行觀察,可以發(fā)現(xiàn)不同的病毒蛋白在細胞中的定位特點,比如通過超薄切片技術結合免疫金銀染色發(fā)現(xiàn)了HIV 的反義蛋白及其與宿主細胞膜的定位關系[10]。

    免疫電鏡技術已成為分子細胞生物學研究的重要手段。該技術利用超薄切片和免疫標記能夠準確的定位蛋白質和脂類[11]。

    3.5 冷凍電鏡及斷層成像技術

    快速將病毒懸浮液冷凍后成為玻璃狀樣品,可以保證病毒結構的原始性。樣品通常被迅速放置于液氮中進行處理,然后轉移至電鏡的低溫樣品室進行觀察,再通過數(shù)字成像技術多角度對樣品進行圖片采集,經過計算機三維重構得到病毒完整三維形態(tài)圖片。另外,通過這一技術還可觀察到抗病毒藥物作用于病毒后,病毒形態(tài)結構發(fā)生改變的特征[3]。

    冷凍電子顯微學和電子斷層成像依然是一個年輕的學科,處于發(fā)展和完善階段,要采用更好的樣品制備方法(如高壓冷凍、冷凍替代、冷凍切片等),改進數(shù)據(jù)收集方法、硬件及軟件,發(fā)展更好的電子斷層成像數(shù)據(jù)處理、分析和理解方法,結合電子斷層成像和單顆粒分析技術獲得更多的結構細節(jié),發(fā)展新的電子斷層成像技術,才能更好地促進冷凍電子斷層成像技術在病毒檢測領域的應用[12]。

    4 生物安全技術

    用電鏡觀察那些可感染人類的病毒時要相當小心,樣品處理過程最好在生物二級實驗室進行研究,包括銅網(wǎng)負染色步驟,并且將銅網(wǎng)拿出實驗室放置電鏡進行觀察之前,要保證銅網(wǎng)上的病毒已無感染性。

    綜上所述,電鏡技術在不斷的發(fā)展過程中充分與免疫學、細胞化學等技術相融合,可直接觀察到生物細胞內的病毒粒子及大分子,對于新發(fā)和未知病原體的研究起著重要的診斷作用。本文僅闡述了基于電子顯微鏡研究病毒涉及到的相關技術,隨著電子顯微技術的發(fā)展以及制樣方法的不斷改進和完善,這將極大的發(fā)揮電子顯微鏡技術的優(yōu)勢并克服其局限性,電子顯微鏡技術也會在病毒診斷領域中發(fā)揮更大的作用。

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