E3 泛素連接酶CUL2 在宮頸癌中的研究進展

張宏蕾，趙衛(wèi)紅

泛素化是蛋白質(zhì)在翻譯后的重要修飾之一，是蛋白質(zhì)被降解前的信號，即需要被降解的蛋白質(zhì)會先被泛素化標(biāo)記，形成泛素-蛋白質(zhì)復(fù)合體，之后再被26S 蛋白酶體降解[1]。在這個生物過程中需要E1泛素激活酶、E2 泛素轉(zhuǎn)移酶和E3 泛素連接酶來完成。泛素連接酶復(fù)合體（cullin-ring ligase，CRL）是體內(nèi)最大的E3 泛素連接酶家族成員，蛋白通過識別受體底物形成復(fù)合物，發(fā)揮泛素化蛋白質(zhì)降解作用[2-3]。在大多數(shù)癌癥中下調(diào)的腫瘤抑制因子希佩爾-林道（von Hippel-Lindau，VHL）因子是一個在缺氧信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與致癌途徑中重要的分子，通過與E3 泛素連接酶復(fù)合體形成復(fù)合物調(diào)節(jié)其底物，CUL2 蛋白因主要識別VHL 受體底物，參與形成E3 泛素連接酶復(fù)合體，曾被學(xué)者們預(yù)測為腫瘤抑制蛋白。然而近年研究顯示，CUL2 在宮頸癌、腎透明細(xì)胞癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、食管癌等惡性腫瘤中以發(fā)揮促癌作用為主，現(xiàn)對CUL2在惡性腫瘤尤其是宮頸癌中的作用及其機制進行綜述。

1 CUL2 概述

現(xiàn)已知，Cullin 家族有7 個成員，分別為CUL1、CUL2、CUL3、CUL4A、CUL4B、CUL5 和CUL7[4]。而在人類、狗、牛、小鼠、大鼠、斑馬魚、果蠅和秀麗隱桿線蟲中表現(xiàn)出保守性的CUL2 基因是Cullin 家族中不容忽視的一員。CUL2 是由745 個氨基酸組成Cullin家族中的成員之一，由Cullin2 基因編碼，位于人類第10 號染色體（10p11.21），分子質(zhì)量約87 ku，等電點為6.46。Cullin 參與泛素復(fù)合體的組成，為泛素連接酶E3 提供疏水蛋白骨架，具有高度保守性，并幾乎存在于所有真核生物。在CRL 中表型最好的泛素連接酶是SCF（Skp-Cul1-F-box）和ECS（EloCCUL2/5-SOCS-box），因CUL2 有與環(huán)指蛋白1（Ringbox 1，RBX1）相互作用的羧基（C）末端，RBX1 會招募E2 泛素轉(zhuǎn)移酶，發(fā)揮連接Cullin 與E2 的作用；另一端氨基（N）末端則會與延長蛋白（ElonginB/C）相互作用，起到接頭蛋白的作用，使CUL2 與底物受體結(jié)合[5]。這些可以與ElonginB/C 連接的底物受體都含有一個特殊的結(jié)構(gòu)域——VHL 盒，有趣的是，起初VHL 被認(rèn)為是SOCS 盒蛋白，但后來發(fā)現(xiàn)VHL缺乏SOCS 盒中的C 末端[6]。VHL 盒由BC 盒（負(fù)責(zé)與ElonginB 和C 結(jié)合）和CUL2 盒（負(fù)責(zé)與CUL2 結(jié)合）構(gòu)成，隨著對VHL 盒研究的深入，發(fā)現(xiàn)含有這個同源性結(jié)構(gòu)域的蛋白很多，如VHL、富含亮氨酸重復(fù)蛋白1（leucine-rich repeat protein 1，LRR-1）和性別決定蛋白FEM1，除此之外的更多底物識別位點被發(fā)現(xiàn)，底物識別的更多方面被闡明，深入了解CUL2 與其底物之間的關(guān)系為癌癥研究開辟了一個新的領(lǐng)域。

2 CUL2 與宮頸癌

眾所周知，高危型人乳頭瘤病毒（HPV）感染是宮頸癌發(fā)生的必要因素，以HPV16 最為多見，保守的E7 癌蛋白是HPV16 致癌的關(guān)鍵，E7 癌蛋白靶向視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（pRb）使宿主細(xì)胞順利進入S 期，并促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）和細(xì)胞遷移[7-8]。最近的研究表明，CUL2 參與了E7 介導(dǎo)HPV16 感染的宮頸癌細(xì)胞中pRb 的降解，CUL2 在HPV16 基因型的感染中可能扮演著不同于其他高危型HPV 的角色。HPV16 E7和CUL2 結(jié)合通過泛素蛋白酶體依賴的機制使pRb的穩(wěn)定性和穩(wěn)態(tài)下調(diào)[9]，而細(xì)胞周期的G1/S 調(diào)控點正是pRb 發(fā)揮作用的時間點，若pRb 被病毒干擾不能與轉(zhuǎn)錄因子（E2F transcription factor 1，E2F1）結(jié)合，細(xì)胞則會順利進入S 期進行增殖，病毒也就可以利用這個時機進行DNA 復(fù)制，從而促進宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[10]。研究表明利用RNA 干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)敲除CUL2 基因會使pRb 呈穩(wěn)定的高表達(dá)，因此CUL2 被反向證明是宮頸癌變過程的關(guān)鍵分子[11]。近年研究發(fā)現(xiàn)在HPV16 陽性的宮頸癌細(xì)胞中，CUL2 受微小RNA-424（miR-424）和miR-154調(diào)控，從而參與HPV16 誘導(dǎo)的宮頸癌變[12-13]。

此外，高危型HPV 癌蛋白E7 有延長人角質(zhì)形成細(xì)胞和載脂蛋白B mRNA 編輯酶催化多肽樣蛋白3（apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide-like 3，APOBEC3）半衰期的作用，APOBEC3 蛋白是一種淋巴免疫細(xì)胞的蛋白質(zhì)，具有廣譜的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒作用[14]。其中APOBEC3 家族中的A3A 是一種專門針對和限制外來DNA 分子的蛋白，可促進外源DNA 分子的分解和代謝[15]，也正是由于A3A 的穩(wěn)定是CUL2 與E7 蛋白結(jié)合基序中的某些殘基所介導(dǎo)，因而做出了E7-CUL2 復(fù)合物可能調(diào)節(jié)A3A 水平的假設(shè)，結(jié)果如預(yù)計的那樣，HPV16 E7 的表達(dá)阻止蛋白酶體依賴的A3A 蛋白降解來穩(wěn)定人角質(zhì)形成細(xì)胞中A3A 蛋白的水平。因為一些在HPV16 E7 的影響下穩(wěn)定的蛋白質(zhì)都是通過CRL2自然降解的，說明A3A 蛋白的異常穩(wěn)定是由于CUL2的功能結(jié)構(gòu)域被E7 蛋白所占據(jù)而導(dǎo)致A3A 不能如期降解，這種異常的A3A 蛋白穩(wěn)定活性可以激活DNA損傷反應(yīng)[16]，HPV 的DNA 復(fù)制又依賴于宿主細(xì)胞的DNA 損傷反應(yīng)，這也是HPV 從該機制中獲得的另一有利生存的條件。

3 CUL2 促腫瘤發(fā)生的可能作用機制

3.1 促進腫瘤血管生成 VHL 綜合征表現(xiàn)為一系列病變，包括腎細(xì)胞癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)或視網(wǎng)膜的血管母細(xì)胞瘤和嗜鉻細(xì)胞瘤[17]，多因為VHL 腫瘤抑制蛋白的BC 盒發(fā)生了突變或表達(dá)缺失所引起[18]。Cai等[19]在研究miR-21-5p 在宮頸癌中的過表達(dá)時，發(fā)現(xiàn)了VHL 的mRNA 序列上3′非翻譯區(qū)是miR-21-5p的直接靶點，miR-21-5p 通過下調(diào)VHL 促進宮頸癌的轉(zhuǎn)移。CUL2 是VHL 抑癌復(fù)合物的組成成分，而大多數(shù)致病性突變的VHL 會抑制ElonginB/C-CUL2-VHL抑癌復(fù)合物的形成，因此探索CUL2 在該復(fù)合物中的作用與其生物效應(yīng)顯得尤為重要。VHL 在正常氧氣量的生理狀態(tài)下靶向缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α），HIF-1α 是一種可介導(dǎo)缺氧敏感基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在機體缺氧反應(yīng)時發(fā)揮作用，經(jīng)典途徑是介導(dǎo)缺氧敏感基因血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)上調(diào)，促使血管的生成。Guo 等[20]發(fā)現(xiàn)HPV E6 癌蛋白可以阻斷VHL 與HIF-1α 結(jié)合，阻礙HIF-1α 的降解，穩(wěn)定堆積的HIF-1α 誘發(fā)瓦伯格效應(yīng)（Warburg effect），葡萄糖更多地轉(zhuǎn)運到腫瘤細(xì)胞，形成了適宜的腫瘤微環(huán)境，HIF-1α 被認(rèn)為是調(diào)節(jié)多種腫瘤發(fā)生的信號分子和轉(zhuǎn)錄因子活性的信號樞紐。此外，CUL2 小干擾RNA（siRNA）會抑制芳香烴受體核轉(zhuǎn)運體的表達(dá)來調(diào)節(jié)HIF，該轉(zhuǎn)運體可與內(nèi)源性HIF-1α 形成異源二聚體。而異位表達(dá)的芳香烴受體核轉(zhuǎn)運體在內(nèi)皮生長因子的啟動子中可逆轉(zhuǎn)CUL2 siRNA 對HIF 活性的抑制。盡管在VHL 與CUL2 組成的泛素連接酶復(fù)合體中，CUL2 的N 末端延伸可與VHL-ElonginB/C相互作用，但是研究發(fā)現(xiàn)在缺乏VHL 的786-O 細(xì)胞中，CUL2 siRNA 同時抑制了芳香烴受體核轉(zhuǎn)運體和內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，表明CUL2 可以獨立于VHL 調(diào)節(jié)HIF 活性，證明CUL2 對于正常血管生成的驅(qū)動過程是必不可少的生物分子。由此看來，VHL 可招募CUL2 E3 泛素連接酶泛素化并降解HIF-1α，HIF-1α有激活血管和紅細(xì)胞生成過程的基因轉(zhuǎn)錄作用，所以有學(xué)者指出若是可以抑制HIF-1α 的降解以增加促紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)生，則可作為治療缺血和慢性貧血的新療法。CUL2 之所以被預(yù)測為腫瘤抑制蛋白，是因為其與VHL 基因和HIF-1α 的泛素化降解有關(guān)，且CRL2 VHL 的底物多樣性使得E3 泛素連接酶復(fù)合體具有了功能多樣性[21]。

3.2 調(diào)節(jié)細(xì)胞動力 根據(jù)氨基酸序列分析，不同蛋白質(zhì)中的VHL 盒不但相似而且高度保守，擁有這種結(jié)構(gòu)域的富含亮氨酸重復(fù)蛋白1（LRR-1）是CRL2復(fù)合體（CRL2LRR-1）的核底物識別亞單位[21]，其結(jié)構(gòu)域中同樣含有BC 盒和CUL2 盒，這樣獨特的結(jié)合基序在體內(nèi)與體外都被證明發(fā)揮了與CUL2 結(jié)合的功能。CUL2LRR-1 是細(xì)胞動力的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，人類CUL2LRR-1 通過阻止細(xì)胞質(zhì)中的p21 抑制Rho/ROCK/LIMK 通路以促進細(xì)胞靜止?fàn)顟B(tài)，是細(xì)胞運動的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。且人類LRR-1 是絲切蛋白的負(fù)向調(diào)節(jié)因子，絲切蛋白是一種肌動蛋白結(jié)合蛋白，介導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)的多種信號通路，絲切蛋白的激活會導(dǎo)致片狀偽足的形成[22]，影響腫瘤細(xì)胞的運動，進而增強或減弱腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲。目前，已在宮頸癌、肝癌、結(jié)腸癌、胃癌及腎癌的浸潤性腫瘤細(xì)胞中檢測到絲切蛋白表達(dá)上調(diào)[23]。

3.3 誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸 黑色素瘤特異性抗原（preferentially expressed antigen of melanoma，PRAME）也是擁有特異VHL 盒的蛋白質(zhì)，其是在1例黑色素瘤患者體內(nèi)被鑒定為發(fā)生自體抗腫瘤免疫反應(yīng)的特異性抗原，目前PRAME 被認(rèn)為在人體正常組織中不表達(dá)，在血液系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌和腎癌等惡性腫瘤中過度表達(dá)，并且被證明與黑色素瘤病變分期有關(guān)，與神經(jīng)母細(xì)胞瘤、漿液性卵巢瘤患者的預(yù)后有關(guān)，在臨床上高水平的PRAME mRNA 是乳腺癌患者預(yù)后不良的因素[24-25]。值得注意的是，這種腫瘤抗原上亦存在VHL 盒，VHL 盒在PRAME 蛋白的N-末端，成為PRAME 與CUL2 的中間媒介，提示PRAME 在發(fā)揮生物效應(yīng)時很可能就是借助了E3 泛素連接酶中重要的組成成分CUL2，也就是說這種癌蛋白的致癌性與泛素化存在著功能性聯(lián)系。染色質(zhì)免疫共沉淀-高通量測序（ChIP-Seq）顯示PRAME經(jīng)常占據(jù)轉(zhuǎn)錄活性啟動子區(qū)域，該區(qū)域也被核轉(zhuǎn)錄因子Y（nuclear factor Y，NFY）結(jié)合，包括NFY A和NFY B，NFY 是促進早期胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖的重要轉(zhuǎn)錄因子[25]。而且具有降解性的NFY A 突變體可以促進細(xì)胞增殖，這與惡性腫瘤的發(fā)生有著一定的因果關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，PRAME 被特異性地招募到具有轉(zhuǎn)錄活性的NFY 啟動子中，PRAME 的結(jié)合可預(yù)測NFY 基因座是否具有活性，因此PRAME 在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用不容小覷[25]。PRAME 的其他潛在底物仍有待確定，隨著未來更多底物的揭示，PRAME 與CUL2 的合作關(guān)系及其在多種類型的人類癌癥中作為潛在癌基因的分子機制也將會被揭曉。

3.4 調(diào)控細(xì)胞增殖 可對CUL2 起修飾作用的類泛素蛋白NEDD8 修飾Cullin 亞基中單個保守的賴氨酸殘基，改變C 末端環(huán)結(jié)合域的構(gòu)象結(jié)構(gòu)，由此決定了相應(yīng)CRL 的激活與否，構(gòu)象開放的CRL 方便了與底物的結(jié)合[26-27]，CRL 的識別底物是一些調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的關(guān)鍵分子，CRL 被認(rèn)為是潛在的抗癌靶點，因此NEDD8 激活酶作為NEDD8 結(jié)合途徑的重要組成部分極其重要。目前發(fā)現(xiàn)，NEDD8 激活酶抑制劑可解除其對細(xì)胞周期S 期DNA 合成的調(diào)控，值得慶幸的是，一種NEDD8 激活酶抑制劑MLN4924 可使CRL失活，表現(xiàn)其抗癌活性[28]，NEDD8 激活酶抑制劑可阻斷Cullin 環(huán)類泛素化修飾，導(dǎo)致CRL 底物的積累并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。由于泛素-蛋白酶系統(tǒng)的抑制劑對治療癌癥有所幫助，且抑制NEDD8 激活酶通路比抑制蛋白酶體活性能更有選擇性地破壞癌細(xì)胞蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)，從臨床療效的角度講，這種療法具有更高的可行性[29]。

腫瘤抑制因子Ras 同源物家族成員B（Ras homolog family member B，RhoB）通過調(diào)節(jié)多個下游效應(yīng)器來控制多種與癌癥相關(guān)的重要信號通路，RhoB 在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，且通過蛋白質(zhì)組學(xué)的分析，RhoB 被認(rèn)定為Cullin-RBX1-E3 連接酶的一種底物，被NEDD8 耦聯(lián)激活后的Cullin-RBX1-E3連接酶與RhoB 相互作用，促使這種腫瘤抑制因子的泛素化和降解，RhoB 并不是與任何一個Cullin 家族的蛋白都可發(fā)生上述效應(yīng)，內(nèi)源RhoB 僅與CUL2相互作用。人肝癌組織中過表達(dá)的RBX1 與CUL2一起作用于RhoB 使其降解，可以說CUL2-RBX1-E3連接酶是肝癌中RhoB 的調(diào)節(jié)器，在人肝癌組織中Neddyling-CRL 途徑的過度激活與RhoB 水平呈負(fù)相關(guān)，反過來說明了RhoB 被泛素化降解是部分導(dǎo)致肝癌發(fā)生的原因[30]。目前研究證實了MLN4924 會抑制NEDD8 對CRL2 的耦聯(lián)，使CRL2 失活，從而導(dǎo)致CUL2 對RhoB 的泛素化作用下調(diào)，RhoB 的積聚會觸發(fā)細(xì)胞凋亡，抑制肝癌細(xì)胞的生長。

3.5 調(diào)控EMT Twist 是一種關(guān)鍵的促EMT 的轉(zhuǎn)錄因子，可上調(diào)間充質(zhì)細(xì)胞表型相關(guān)的基因蛋白——波形蛋白（Vimentin）表達(dá)，EMT 是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程。通過結(jié)合位點分析，Twist1 可結(jié)合CUL2的啟動子，啟動其環(huán)狀RNA（circ10720）的轉(zhuǎn)錄[31]，導(dǎo)致了CUL2 circ10720 的異常形成，但不促進mRNA表達(dá)，circ-10720 可以海綿吸附調(diào)控波形蛋白的miRNA，使波形蛋白也異常表達(dá)[31-32]，而波形蛋白正是EMT 間充質(zhì)細(xì)胞的重要標(biāo)志物。Twist1 通過增加可吸收波形蛋白miRNA 的circ10720 來上調(diào)波形蛋白水平這個環(huán)節(jié)，可能就是circ10720 肝癌細(xì)胞中circ10720 與Twist1、預(yù)后不良、腫瘤惡變程度呈正相關(guān)的原因。有研究報道，在體外和患者來源的異種移植瘤和二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的Twist1 轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌模型中，circ10720 基因敲除能消除Twist1 的促瘤活性[31]。此外，還利用熒光素報告系統(tǒng)驗證Twist1 過表達(dá)增加了CUL2 啟動子活性，而Twist1 的基因敲除降低了CUL2 啟動子活性，正反雙向的實驗驗證了Twist1在EMT 過程中調(diào)節(jié)波形蛋白的機制。CUL2 circ10720在轉(zhuǎn)移性肝癌和甲胎蛋白陽性組的肝癌組織中呈顯著性持續(xù)增高，為肝癌的治療提供了潛在的治療靶點，將會是一種新的診斷和治療策略。汪雯雯等[33]在研究中表明Twist 通過誘導(dǎo)EMT 參與了宮頸癌發(fā)生的整個過程，并與宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。Babion 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌中有雙重作用的miR-9-5p 的靶點之一是EMT 的轉(zhuǎn)錄因子Twist1。

4 結(jié)語與展望

CUL2 蛋白在一系列富含VHL 盒受體底物的泛素化過程中起著決定性作用，其中備受關(guān)注的VHL基因在宮頸鱗狀細(xì)胞癌與非癌組織中呈現(xiàn)了不同的狀態(tài)，Choi 等[35]檢測發(fā)現(xiàn)VHL 在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中甲基化，超甲基化的腫瘤抑制基因表達(dá)沉默參與了宮頸癌的發(fā)生。CUL2 與VHL、ElonginB、ElonginC 形成的ElonginB/C-CUL2-VHL 復(fù)合物在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵的抑癌作用，在宮頸癌中又表現(xiàn)出促癌作用，尋找調(diào)控CUL2 的機制成為了阻斷惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵點，如有文獻(xiàn)報道m(xù)iR-574-3p可以通過靶向調(diào)節(jié)CUL2 成為治療胃癌和膀胱癌的新靶點[36-37]。鑒于CUL2 作為HPV16 E7 降解抑癌蛋白pRb 過程中的關(guān)鍵分子，相信未來隨著對CUL2的進一步研究，CUL2 有望成為判斷宮頸癌發(fā)生和預(yù)后的分子標(biāo)志物，并為阻斷宮頸癌的發(fā)生提供新靶點。