冠心病細(xì)胞焦亡的分子機(jī)制及其新藥靶點(diǎn)的研究進(jìn)展

劉超，高嘉良，王階

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100053； 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

冠心病是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，其發(fā)病率高、致死風(fēng)險(xiǎn)大，已成為全球重要的公共衛(wèi)生問題[1]。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病發(fā)生的基本病理表現(xiàn)，既往研究證實(shí)，炎癥反應(yīng)在斑塊形成、破裂、血管堵塞所致急性心血管事件中起重要作用[2-3]。細(xì)胞焦亡是由多種病原體或非感染因素刺激產(chǎn)生的一種固有免疫反應(yīng)，是依賴胱天蛋白酶(caspase)1、4、5、11、炎癥小體以及GSDMD(Gasdermin D)蛋白的一種伴有炎癥反應(yīng)的程序性細(xì)胞死亡模式[4-5]。細(xì)胞焦亡一詞最早來自希臘語“Pyroptosis”“pyro”意為“火”“ptosis”表示“下降”，pyroptosis表示細(xì)胞焦亡[6]。與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞焦亡既能表現(xiàn)出與細(xì)胞凋亡相似的細(xì)胞核皺縮、外吐小泡、DNA斷裂、Annexin V及原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法染色陽性[7]，又能表現(xiàn)出與細(xì)胞壞死類似的細(xì)胞腫脹破裂、炎癥內(nèi)容物釋放的特征[8]。細(xì)胞焦亡在炎癥反應(yīng)中占據(jù)重要地位，并在冠心病相關(guān)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[9-10]。部分研究證實(shí)，細(xì)胞焦亡會(huì)導(dǎo)致冠心病患者血液中炎癥因子的高表達(dá)[11-12]，并加速動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[13]；抑制細(xì)胞焦亡途徑的各個(gè)環(huán)節(jié)可有效抑制炎癥因子的釋放，延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[14]，縮小心肌梗死面積，改善心功能[15]；同時(shí)針對(duì)冠心病細(xì)胞焦亡中的各靶點(diǎn)，相應(yīng)特異性抑制劑的研發(fā)也已取得一定成果[16]?，F(xiàn)就細(xì)胞焦亡在冠心病中的作用機(jī)制以及作為藥物靶點(diǎn)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 細(xì)胞焦亡相關(guān)信號(hào)通路

1.1經(jīng)典信號(hào)通路 經(jīng)典的細(xì)胞焦亡信號(hào)通路是依賴caspase-1介導(dǎo)的信號(hào)通路[17]。細(xì)胞通過病原體相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式識(shí)別危險(xiǎn)信號(hào)，激活細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的模式識(shí)別受體[18]。模式識(shí)別受體被激活后，其熱蛋白結(jié)構(gòu)域可以募集細(xì)胞質(zhì)中的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白，并與之結(jié)合，從而形成一個(gè)多蛋白復(fù)合物炎癥小體[19-21]。激活后的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白結(jié)構(gòu)域可以募集caspase-1前體，并將其水解成具有活性的caspase-1[8]，活化的caspase-1一方面可以切割GSDMD，使其N端結(jié)構(gòu)(GSDMD-NT)暴露，進(jìn)而特異性地與細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷酸酰肌醇磷酸鹽、磷脂酰絲氨酸以及細(xì)胞膜內(nèi)外側(cè)的心磷脂結(jié)合[22]，進(jìn)而在細(xì)胞膜上打孔，使細(xì)胞膜表面形成10～14 nm蜂窩狀的孔洞結(jié)構(gòu)，改變細(xì)胞通透性，造成細(xì)胞腫脹破裂，發(fā)生焦亡[17]。另一方面，caspase-1還可以切割未成熟的白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β前體和IL-18前體，從而形成IL-1β和IL-18，當(dāng)細(xì)胞焦亡發(fā)生時(shí)，兩種炎癥因子大量釋放，促進(jìn)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生[22-23]。經(jīng)典細(xì)胞焦亡信號(hào)通路的研究較為深入，是目前炎癥疾病研究的熱點(diǎn)。

1.2非經(jīng)典信號(hào)通路 非經(jīng)典的細(xì)胞焦亡信號(hào)通路由人源caspase-4、5和鼠源caspase-11所介導(dǎo)[24-25]。與復(fù)雜的經(jīng)典通路不同，革蘭陰性菌的內(nèi)毒素脂多糖可直接激活caspase-4、5、11，進(jìn)而切割GSDMD，使其N端結(jié)構(gòu)域暴露，誘發(fā)GSDMD-NT在細(xì)胞膜上打孔，導(dǎo)致細(xì)胞通透性改變，進(jìn)而發(fā)生細(xì)胞焦亡[26]。同時(shí)，激活的caspase-4、5、11也可以活化核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein，NLRP)3炎癥小體，進(jìn)而激活經(jīng)典的焦亡信號(hào)通路[27]。活化的caspase-4、5、11可以激活細(xì)胞膜表面控制小分子物質(zhì)進(jìn)出的Pannexin-1通道釋放ATP，進(jìn)而激活細(xì)胞膜表面對(duì)ATP敏感的嘌呤能離子通道型受體7，導(dǎo)致細(xì)胞膜表面形成小孔，誘導(dǎo)焦亡發(fā)生[28]。此外，激活的Pannexin-1通道還可通過釋放K+激活NLRP3炎癥小體，活化caspase-1，從而激活經(jīng)典的細(xì)胞焦亡通路[29]。目前對(duì)細(xì)胞焦亡非經(jīng)典信號(hào)通路的研究尚不全面，其與經(jīng)典信號(hào)通路之間的聯(lián)系還有待深入研究。

1.3信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白 GSDMD是Gasdermin蛋白家族中的一種重要蛋白，具有Gasdermin結(jié)構(gòu)域，是所有caspase的共同底物，其能夠在細(xì)胞膜上形成孔洞結(jié)構(gòu)，促進(jìn)細(xì)胞焦亡發(fā)生，是細(xì)胞焦亡經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑發(fā)生的最后執(zhí)行蛋白[26,30]。人源GSDMD由487個(gè)氨基酸和2個(gè)結(jié)構(gòu)域[N端(Gasdermin-NT)和C端(Gasdermin-CT)]組成[31]。正常狀態(tài)下，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域相互結(jié)合，處于無活性的抑制狀態(tài)，caspace活化后可特異性地切割GSDMD中兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的連接區(qū)，進(jìn)而暴露N端結(jié)構(gòu)域，從而使其可以特異性地識(shí)別細(xì)胞膜上的磷脂類分子，并在細(xì)胞膜表面打孔，導(dǎo)致細(xì)胞滲透壓改變，細(xì)胞腫脹破裂，引發(fā)細(xì)胞焦亡[32]。當(dāng)敲除GSDMD基因時(shí)可阻止細(xì)胞釋放IL-1β以及炎癥小體和脂多糖引發(fā)的細(xì)胞焦亡，證實(shí)了GSDMD在細(xì)胞焦亡中的關(guān)鍵作用[33]。此外，Gasdermin蛋白家族中的另一種蛋白GSDME(Gasdermin E)可被caspase-3切割，暴露GSDME的N端結(jié)構(gòu)域，與GSDMD-NT類似，GSDME-NT可特異性地與細(xì)胞膜表面脂質(zhì)體結(jié)合，在細(xì)胞膜表面形成孔洞結(jié)構(gòu)，誘發(fā)細(xì)胞焦亡[34-35]。多年來caspase-3一直被認(rèn)為是誘發(fā)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子，而其對(duì)GSDME的特異性切割、誘發(fā)細(xì)胞焦亡的現(xiàn)象建立起細(xì)胞凋亡向細(xì)胞焦亡轉(zhuǎn)變的新途徑[36]。

2 冠心病細(xì)胞焦亡過程與新藥作用靶點(diǎn)

2.1炎癥小體 炎癥小體是固有免疫反應(yīng)的重要組成部分，是調(diào)控細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞焦亡的炎癥小體主要有NLRP3、NLRP1、NLRC4(NLR family,CARD domain containing 4)、黑素瘤缺失基因2炎癥小體、Pyrin[37]，其中NLRP3研究最多，在冠心病的發(fā)生、發(fā)展中占重要地位[38]。研究發(fā)現(xiàn)，急性冠狀動(dòng)脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)和急性心肌梗死患者外周血中存在NLRP3的高表達(dá)，且NLRP3水平會(huì)隨冠狀動(dòng)脈病變以及分叉病變數(shù)量的增加而升高[12,39-40]。NLRP3會(huì)增加冠狀動(dòng)脈壁中IL-1β的積累，并提高caspase-1的活性，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈內(nèi)側(cè)壁增厚，加速冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，故NLRP3很可能成為預(yù)測(cè)冠心病的潛在生物標(biāo)志物[41]。研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，敲除NLRP3基因小鼠的心功能改善更明顯，缺氧損傷較輕，并認(rèn)為NLRP3可能是導(dǎo)致心肌缺血再灌注期間心肌梗死面積增加的重要因素[42]。

自噬是抗炎的重要環(huán)節(jié)，能夠抑制NLRP3所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，通過激活心肌細(xì)胞的自噬途徑增加微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ/Ⅰ的水平，降低p62的表達(dá)水平，抑制NLRP3形成，減少心肌缺血再灌注損傷[43]。針對(duì)NLRP3的特異性抑制劑已有動(dòng)物和細(xì)胞研究證實(shí)，OLT1177[44]、MCC950[45]、Calpain[46]和黃芩苷[47]等可有效抑制NLRP3/ASC/caspase-1軸的激活，下調(diào)IL-1β、IL-18的表達(dá)，抑制早期炎癥反應(yīng)，減輕心肌損害，改善心功能?？梢奛LRP3不僅有潛力成為冠心病的特異性生物標(biāo)志物，也可能成為冠心病治療的重要靶點(diǎn)。

目前，針對(duì)其他炎癥小體的研究相對(duì)較少。有研究發(fā)現(xiàn)，NLRC4在ACS患者中存在遺傳變異，而這種變異會(huì)導(dǎo)致血清IL-18的高表達(dá)和caspase-1前體的激活，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞焦亡[48]。此外，NLRP1炎癥小體介導(dǎo)的心肌缺血再灌注損傷也可由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過核因子κB信號(hào)通路激活[49]。冠心病患者Pyrin等位基因M694V高表達(dá)，增加了其罹患急性心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)[50]。然而并不是所有的NLRC4都會(huì)促進(jìn)細(xì)胞焦亡的發(fā)生，如線粒體中的NLRX1(NLR family member X1)在急性心肌梗死組織和缺氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中顯著減少，并通過抑制線粒體抗病毒信號(hào)蛋白、NLRP3和caspase-1的表達(dá)，減少細(xì)胞焦亡，起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用[51]。

2.2caspase家族 caspase家族主要參與細(xì)胞程序性死亡，其中caspase-1、4、5、11調(diào)控細(xì)胞焦亡[5]，caspase-3、6、7、8、9、10則是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者[52]。參與細(xì)胞焦亡的caspase不僅能促進(jìn)IL-1β、IL-18成熟，還能切割GSDMD，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡發(fā)生，特別是經(jīng)典途徑中caspase-1在冠心病中的研究較為深入。研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者主動(dòng)脈caspase-1水平顯著升高，并與冠狀動(dòng)脈Gensini評(píng)分、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和脂蛋白α呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與高密度脂蛋白膽固醇呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，故認(rèn)為caspase-1有可能成為防治冠心病的潛在靶點(diǎn)[53]。此外，抑制caspase-1的表達(dá)可在上游環(huán)節(jié)調(diào)控炎癥因子的釋放，有效減輕心肌缺血再灌注損傷[54]。進(jìn)一步敲除caspase-1基因，可顯著降低心肌缺血再灌注損傷小鼠血漿中基質(zhì)金屬蛋白酶3的活性和減少IL-18的表達(dá)，提高心肌梗死區(qū)周圍心肌的存活率，降低心室擴(kuò)張率，改善心功能[55]。僅有少數(shù)研究開展了針對(duì)非經(jīng)典途徑中caspase的研究，心肌缺血再灌注損傷可導(dǎo)致caspase-11升高，可通過調(diào)節(jié)p38促分裂原活化的蛋白激酶途徑抑制caspase-11活化、保護(hù)心肌細(xì)胞[56-57]。

VX765是caspase-1的特異性抑制劑，通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路減輕心肌缺血再灌注損傷[58]。而另一種特異性抑制劑Ac-YVAD-cmk能顯著抑制caspase-1的活性，減輕高膽固醇血癥對(duì)心肌缺血再灌注損傷的不利影響[59]。秋水仙堿可顯著減少ACS患者casapase-1信使RNA和蛋白的表達(dá)，降低IL-1β水平，抑制炎癥反應(yīng)，改善心功能[60]。另外，盾葉冠心寧片[15]和α-1-抗胰蛋白酶[61]可通過腺苷酸激活蛋白激酶途徑抑制caspase-1的活性，減少IL-1β的釋放，保護(hù)存活心肌，縮小心肌梗死面積，延緩心室重構(gòu)的發(fā)生。caspase-1是冠心病細(xì)胞焦亡發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控因子，特異性抑制可能成為冠心病治療的新途徑。

2.3IL-1β和IL-18 IL-1β和IL-18是重要的致炎因子，會(huì)導(dǎo)致局部劇烈的炎癥反應(yīng)[62]。既往研究已經(jīng)證實(shí)，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成與炎癥反應(yīng)密不可分[63]，而細(xì)胞焦亡釋放的炎癥因子IL-1β和IL-18會(huì)造成局部的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在冠心病的發(fā)生中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生急性血管事件后，ACS患者心臟局部炎癥因子IL-1β和IL-18的水平顯著升高[64]，且這種高水平狀態(tài)會(huì)持續(xù)6個(gè)月；多元回歸分析顯示，IL-1β水平與低密度脂蛋白膽固醇以及IL-18水平呈正相關(guān)，與高密度脂蛋白膽固醇水平呈負(fù)相關(guān)[65]，而IL-18的基線水平可直接反映患者的預(yù)后狀況[66]。一項(xiàng)薈萃分析顯示，IL-18rs187238和IL-18rs1946518是心血管疾病的易感基因，其表達(dá)會(huì)增加人群罹患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)[67]。IL-1β和IL-18水平升高是患者發(fā)生急性心血管事件的特征表現(xiàn)之一，為了抑制此炎癥反應(yīng)的發(fā)生，正在研發(fā)相應(yīng)藥物。

卡納單抗是炎癥因子IL-1β的單克隆抗體。在一項(xiàng)涉及40個(gè)國家10 061例心肌梗死患者的多中心、隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照臨床試驗(yàn)中，特異性IL-1β單抗卡納單抗可以顯著降低心肌梗死患者心血管不良事件的發(fā)生率(HR=0.75，95%CI0.66～0.85，P<0.000 1)[16]。此外，IL-1β能夠誘導(dǎo)可溶性生長(zhǎng)刺激表達(dá)基因2蛋白的表達(dá)，加速急性心肌梗死后的心力衰竭，而依普利酮能夠拮抗這一效應(yīng)，提高左心功能[68]。另外，中藥川芎提取物可通過調(diào)節(jié)Toll樣受體4/核因子κB信號(hào)通路抑制心肌IL-1β的表達(dá)，提高射血分?jǐn)?shù)，縮小心肌梗死面積[69]。IL-18可加重心肌梗死后的心功能障礙，燈盞花素可通過降低體內(nèi)IL-18和細(xì)胞間黏附分子-1的水平，減輕炎癥反應(yīng)，降低IL-18對(duì)心肌梗死后左心室重構(gòu)的不良影響，達(dá)到延緩冠心病進(jìn)展的目的[70-71]。綜上可知，IL-1β和IL-18是冠心病細(xì)胞焦亡發(fā)生炎癥反應(yīng)的重要途徑，是抑制冠心病炎癥反應(yīng)的重要靶點(diǎn)。

2.4GSDMD GSDMD是細(xì)胞焦亡過程中caspase-1、4、5、11的共同底物，其GSDMD-NT在細(xì)胞膜表面可發(fā)揮打孔作用，直接誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡發(fā)生和炎癥因子IL-1β、IL-18釋放，是細(xì)胞焦亡發(fā)生最關(guān)鍵的蛋白質(zhì)。GSDMD基因敲除會(huì)顯著減少焦亡相關(guān)炎癥因子的釋放[72]。因此有學(xué)者主張將細(xì)胞焦亡定義為由GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡[30,33]。GSDMD在多種缺血性疾病的細(xì)胞焦亡中起重要作用[31,73]，并與冠心病密切相關(guān)，但對(duì)GSDMD的研究較少。臨床研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死會(huì)導(dǎo)致焦亡相關(guān)蛋白GSDMD和GSDMD-NT水平升高，進(jìn)而誘發(fā)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞焦亡和下游的炎癥反應(yīng)[74]，而新型蒽醌類化合物琥珀酸Kanglexin能夠阻止這一有害改變，并預(yù)防心臟損害和心功能不全[75]。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血再灌注損傷會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞GSDMD-NT水平升高，大黃素可通過Toll樣受體4/髓樣分化因子88/核因子κB/NLRP3途徑抑制NLRP3介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，提高心肌細(xì)胞存活率，縮小心肌梗死面積，預(yù)防心室重構(gòu)[76-77]。

動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病的基本病理表現(xiàn)，延緩斑塊進(jìn)展是治療冠心病的關(guān)鍵。高脂飲食會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)GSDMD-NT升高，其含量同氧化低密度脂蛋白水平呈濃度依賴關(guān)系[78]。降脂藥阿托伐他汀可通過長(zhǎng)鏈非編碼RNA NEXN-AS1/NEXN途徑降低GSDMD、IL-1β和IL-18的水平，從而抑制細(xì)胞焦亡，起到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[14]。此外，紅景天苷能夠抑制GSDMD的表達(dá)，減少IL-1β釋放，降低細(xì)胞焦亡導(dǎo)致的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，達(dá)到抗炎、延緩斑塊進(jìn)展的目的[79]。目前雖沒有針對(duì)GSDMD的特異性抑制劑，但GSDMD作為細(xì)胞焦亡發(fā)生的共同底物，在治療中展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。

3 小 結(jié)

細(xì)胞焦亡在冠心病炎癥反應(yīng)中占重要地位，能夠加速動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，從細(xì)胞焦亡途徑研究冠心病的發(fā)病機(jī)制及新藥作用靶點(diǎn)有廣泛的應(yīng)用前景。然而，目前細(xì)胞焦亡的機(jī)制尚不清楚，如缺乏對(duì)細(xì)胞焦亡非經(jīng)典途徑的深入研究，經(jīng)典途徑與非經(jīng)典是否存在聯(lián)系，細(xì)胞焦亡與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬之間是否存在拮抗關(guān)系，打孔蛋白GSDMD的核心機(jī)制等均不明確。同時(shí)，臨床患者的病情往往較復(fù)雜，而現(xiàn)有冠心病細(xì)胞焦亡動(dòng)物模型多采用缺血再灌注損傷模型，該模型能否真實(shí)反映臨床實(shí)際情況還有待商榷。此外，針對(duì)細(xì)胞焦亡靶點(diǎn)中特異性抑制劑或基因敲除技術(shù)的研究還相對(duì)較少，無法明確各靶點(diǎn)在冠心病發(fā)生中的地位和作用。中醫(yī)藥具有多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點(diǎn)作用的特點(diǎn)，而目前針對(duì)中藥單體及提取物的研究?jī)H局限于某一特定靶點(diǎn)，從多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)抑制細(xì)胞焦亡還有待研究。因此，未來應(yīng)深入探討冠心病細(xì)胞焦亡的發(fā)病機(jī)制，并針對(duì)細(xì)胞焦亡的各環(huán)節(jié)、各靶點(diǎn)研制新的特異性抑制劑，并進(jìn)行多中心、大樣本隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，以期為冠心病的防治提供新策略。