骨肉瘤生物標志物研究進展

朱昱潤 張春林

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性高度惡性骨腫瘤，以增殖的腫瘤細胞直接產(chǎn)生骨或骨樣組織為特點，局部侵襲性強且早期即可出現(xiàn)遠處轉移，5年生存率為50%～60%[1]。該病好發(fā)于15～25歲或青少年長骨干骺端，發(fā)生在脊柱和骨盆部位者預后通常不佳。腫瘤早期診斷是確保治療效果的關鍵，但因骨肉瘤早期缺乏特異性癥狀，發(fā)現(xiàn)時病情往往已經(jīng)進一步發(fā)展。延誤治療時機、早期轉移和化療耐藥等是骨肉瘤患者生存期短、預后不佳的主要原因。

盡快尋找到骨肉瘤生物標志物不僅可以協(xié)助其早期篩查和診斷，而且可以為判斷其化療敏感性和預后提供依據(jù)，對提升骨肉瘤的臨床治療效果具有重要意義。

1 RNA標志物

1.1 微小RNA

微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性、非編碼且高度保守的核糖核酸分子，長度較短，由20～25個核苷酸組成，可在調節(jié)轉錄后的基因表達方面發(fā)揮關鍵作用。miRNA表達失調可影響惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，如血清miR-21高表達與腫瘤分期、化療耐藥性和不良預后均顯著相關[2]。另有研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤患者血清miR-375水平明顯低于健康人，且血清miR-375水平越低，骨肉瘤患者總生存期越短[3]，這可能與miR-375對骨肉瘤細胞增殖具有抑制作用有關。Shi等[4]研究發(fā)現(xiàn)，miR-375可通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(Akt)途徑抑制骨肉瘤生長。在骨肉瘤組織中miR-214表達顯著上調，這可能與骨肉瘤轉移和預后不良有關，miR-214高表達患者腫瘤更大，化療效果也更差，故其可以作為預測骨肉瘤預后的潛在因素[5]。此外，骨肉瘤患者血清miR-194水平明顯降低，且在不同組織學亞型之間并無顯著差異。手術治療后骨肉瘤患者miR-194表達可上調，而miR-194高表達患者預后較好[6]。

1.2 環(huán)狀RNA

環(huán)狀RNA(circRNA)具有閉環(huán)結構，可穩(wěn)定存在于細胞質中而不被降解，故其可作為腫瘤早期篩查和評價預后的標志物以及新的有效治療靶點，對闡明腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體機制具有重要意義。

circRNA-0008717是一種在骨肉瘤組織中表達顯著上調的環(huán)狀核糖核酸，其在骨肉瘤中過表達可提高Bmi-1的表達，從而促進骨肉瘤細胞的增殖和侵襲，骨肉瘤患者生存期因此縮短[7]。在骨肉瘤中過表達的還有circRNA-100876，其高表達患者腫瘤體積更大，分化程度較低，生存期較短。敲除circRNA-100876基因可抑制體外細胞增殖和體內(nèi)腫瘤生長。miR-136作為circRNA-100876的下游基因，兩者表達呈負相關[8]，而miR-136可作為腫瘤抑制基因發(fā)揮作用，這也證實了circRNA-100876下調可抑制腫瘤生長。Zhu等[9]發(fā)現(xiàn)，hsa_circ RNA_0081001在化療耐藥和肺轉移患者血清和組織中高表達，而其在化療期間無明顯升高且術后維持在較低水平則提示患者預后較好。由此可見，hsa_circRNA_0081001可以動態(tài)、準確地反映骨肉瘤患者的病情變化，尤其在轉移和化療耐受方面具有預測骨肉瘤進展和預后的臨床價值。

1.3 長鏈非編碼RNA

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，在染色質重塑、轉錄及轉錄后調控、干細胞全能性和神經(jīng)生長分化等方面具有重要作用。與正常骨細胞系相比，骨肉瘤細胞系lncRNA HNF1A-AS1、lncRNA CRNDE和lncRNA Linc00511表達均上調。lncRNA CRNDE介導的骨肉瘤進展可能與notch1信號和上皮間質轉換失調有關[10],而lncRNA HNF1A-AS1則通過激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號轉導通路促進細胞周期進程和抑制細胞凋亡，最終促進腫瘤細胞增殖[11]。lncRNA Linc00511高表達可抑制miR-765表達，從而促進腫瘤細胞增殖、集落形成和遷移[12]。上述lncRNA對判斷骨肉瘤預后和尋找治療靶點均具有潛在價值。

lncRNA MEG3對多種腫瘤均有抑制作用，因此低水平lncRNA MEG3是骨肉瘤患者預后不良的標志，患者生存時間會明顯縮短，且可能發(fā)生腫瘤遠處轉移[13]。張鴻程等[14]發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOXA11-AS在骨肉瘤中表達明顯下調，而其過表達可抑制裸鼠體內(nèi)骨肉瘤生長，因此有望成為生物治療靶點。但目前該作用的分子機制尚不明確，lncRNA HOXA11-AS可能通過影響表觀調控因子活性發(fā)揮腫瘤抑制作用。

化療耐藥一直是骨肉瘤治療的難點。lncRNA LUCAT1在甲氨蝶呤耐藥的骨肉瘤細胞中表達異常上調，提示其可能是影響耐藥的關鍵分子。體內(nèi)和體外實驗研究均發(fā)現(xiàn)，敲除LUCAT1基因可抑制腫瘤細胞對甲氨蝶呤的抗藥性，作用機制可能是通過miR-200c上調相關多藥耐藥蛋白表達[15]。Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素耐藥骨肉瘤細胞lncRNA FOXC2-AS1表達水平明顯高于阿霉素敏感骨肉瘤細胞，lncRNA FOXC2-AS1可能參與耐藥機制，且與預后不良相關。

2 骨肉瘤相關基因異常

p53是一種抑癌基因，可對細胞周期、DNA修復和合成及細胞凋亡發(fā)揮重要調節(jié)作用。一項薈萃分析結果顯示，p53上調與骨肉瘤患者3年總生存率降低有關[17]。相關耐藥性研究發(fā)現(xiàn)，p53高表達可提升多藥耐藥的骨肉瘤細胞系對紫杉醇、順鉑和阿霉素的化療敏感性，其作用方式可能是通過抑制胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)表達或增加促凋亡蛋白p21和Bcl-2相關X蛋白(Bax)表達實現(xiàn)[18]。

Rb基因對控制細胞周期至關重要，其發(fā)生遺傳突變不僅可能導致視網(wǎng)膜母細胞瘤綜合征，也可使患者更易患骨肉瘤，散發(fā)性骨肉瘤患者常存在Rb基因改變[19]。Rb基因可通過結合轉錄因子E2F調節(jié)細胞周期，Rb缺失或無功能表型骨肉瘤患者可因Rb基因不能與轉錄因子E2F形成穩(wěn)定復合物導致預后較差[20]。研究報道，Rb基因雜合性缺失是骨肉瘤患者預后不良的危險因素[21]。

先天性血管萎縮性皮膚異色癥(RTS)是一種常染色體隱性遺傳疾病，這種染色體突變疾病與骨肉瘤易感性增加有關，攜帶RECQL4基因節(jié)段突變的RTS患者患骨肉瘤風險明顯增加[22]。RECQL4可編碼修復DNA損傷和維持基因組穩(wěn)定性所需的解旋酶，因此RECQL4在骨肉瘤中過表達可能與基因組不穩(wěn)定有關，從而導致骨肉瘤化療耐藥及預后不良[23]。Martin等[24]發(fā)現(xiàn)，在化療不敏感的骨肉瘤病例中RECQL4表達上調，提示RECQL4差異表達可能與化療反應有關，有待進一步研究。

3 胰島素樣生長因子-1與IGF-1R

胰島素樣生長因子(IGF)-1可在抑制細胞凋亡、促進細胞周期進程和血管生成以及各種腫瘤發(fā)展和轉移等方面發(fā)揮關鍵作用。Zhang等[25]發(fā)現(xiàn)，IGF-1可與IGF-1R結合，激活PI3K/Akt信號轉導通路，該途徑失調可影響多種病理過程，如骨肉瘤增殖、侵襲和轉移。抑制IGF-1R可降低骨肉瘤增殖與侵襲，并提高骨肉瘤對多西他賽、順鉑或阿霉素的敏感性[26]。另一項多變量Cox回歸分析結果表明，IGF-1R水平是預測骨肉瘤患者預后的獨立因素，IGF-1R過表達與骨肉瘤轉移有關[27]。

4 基質金屬蛋白酶

基質金屬蛋白酶(MMP)家族是依賴鋅離子和鈣離子維持活性的一類蛋白水解酶，MMP-2和MMP-9是該家族的主要成員，通常以酶原的形式分泌。經(jīng)水解活化后，MMP-2和MMP-9可降解基底膜Ⅳ型膠原，使基底膜阻止腫瘤細胞移動的能力下降[28]。大部分腫瘤都會出現(xiàn)1種或幾種MMP上調的情況，且MMP高表達常與患者存活率低有關[29]。MMP通過切割多種底物發(fā)揮作用，最終促進腫瘤細胞遷移、侵襲和血管生成。這些底物既包括細胞外基質的結構成分，也包括生長因子結合蛋白、生長因子前體、受體酪氨酸激酶、細胞粘附分子和其他蛋白酶等。抑制MMP分泌可抑制骨肉瘤細胞生長和轉移[30]。Kunz等[31]研究MMP與化療反應的關系，發(fā)現(xiàn)MMP-9活性降低和MMP-2活性升高均會導致患者對化療反應不良，MMP-2/MMP-9活性的比率可能是對化療反應有價值的預后標志物。

5 蛋白標志物

研究證實，許多蛋白可參與腫瘤調控和表達。對正常和腫瘤組織的蛋白表達圖譜分別進行研究，可進一步發(fā)現(xiàn)并篩選出可靠的生物標志物。

細胞色素(CY)C1在骨肉瘤組織中過表達。研究發(fā)現(xiàn)，沉默CYC1基因可以增強腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)促進骨肉瘤細胞凋亡的作用，這一過程主要由線粒體依賴的細胞凋亡途徑介導[32]。miR-661過表達通過下調CYC1提高骨肉瘤細胞對TRAIL誘導凋亡的敏感性，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[33]。

骨膜素過表達與腫瘤轉移和血管生成有關。骨膜素過表達可使患者血管內(nèi)皮生長因子水平增高，微血管密度變大，不僅與患者存活率呈負相關[34]，還與腫瘤Enneking分期、大小和病理分型有關[35]。

微小染色體維持蛋白(MCM)是細胞周期的重要調節(jié)因子，可在DNA復制啟動和延伸環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用，MCM蛋白表達顯示細胞具有增殖能力。有研究證實，MCM2和MCM3高表達與骨肉瘤不良預后相關，敲除MCM2或MCM3基因可有效抑制腫瘤細胞生長[36]，但其相關機制有待進一步闡明。

6 結語

發(fā)現(xiàn)生物標志物是將分子和基因組數(shù)據(jù)轉化為臨床成果的重要途徑，轉移和化療耐藥是目前骨肉瘤治療面臨的最大挑戰(zhàn)。有關研究可以聚焦于能夠確定化療敏感性及監(jiān)測腫瘤進展和轉移的生物標志物，從而為患者提供個體化治療方案。

目前，雖然某些潛在的生物標志物已得到大量研究證實，但尚無法應用于臨床。其關鍵在于這些生物標志物特異度和敏感度均較低，無法滿足臨床需求[37]。腫瘤的異質性也是問題之一，骨肉瘤的基因組具有多樣性，故少數(shù)腫瘤樣本不能反映疾病整體情況。目前多數(shù)研究對象均為小規(guī)模樣本，其研究結果存在不確定性。經(jīng)濟和商業(yè)因素也是影響因素，在生物標志物影響臨床決策之前，其有效性需要經(jīng)過大規(guī)模、高成本的隨機臨床試驗證實，才能得到監(jiān)管機構的認可和批準，權衡風險與收益則使很多后續(xù)研究難以進一步開展[38]。