外泌體源性miRNA在眼部疾病中的研究進展

朱 妍，姚牧笛，孟祥瑞，蔣 沁

0引言

外泌體被定義為直徑30～200nm的細胞外泌性囊泡，它可由多種細胞產(chǎn)生并釋放入細胞外空間，廣泛存在于尿液、血液、唾液等生物體液中[1]。外泌體內(nèi)含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及mRNA、miRNA、circRNA等多種核酸，通過傳遞功能性物質(zhì)調(diào)節(jié)炎癥反應、免疫應答、組織修復等重要病理生理過程[2]。其中，miRNA是一類長度約為22nt的短鏈非編碼RNA，通過與靶mRNA的非翻譯區(qū)或開放閱讀框結合，介導轉(zhuǎn)錄后基因沉默[3]。miRNA可于外泌體中穩(wěn)定存在，隨外泌體循環(huán)并被鄰近或遠處的細胞攝取，參與受體細胞的增殖、分化、遷移等活動，調(diào)控疾病的發(fā)生和進展[4-6]。

鑒于囊泡的可運輸性，外泌體源性miRNA的作用受到了極大的關注。近年來的研究證實外泌體源性miRNA與諸多眼部疾病的發(fā)生發(fā)展有密切的聯(lián)系，是極具潛力的診斷標志物及新型治療靶點。本文就外泌體源性miRNA的基本概況及其在眼部疾病中的相關研究進行系統(tǒng)綜述。

1外泌體源性miRNA的基本概況

1.1外泌體源性miRNA的發(fā)現(xiàn)及研究現(xiàn)狀miRNA是短鏈非編碼RNA的主要亞型，通過序列特異性方式結合靶RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達，參與機體的各種生命活動，因此一直是研究的熱點[3]。1983年，Pan等[7]首次發(fā)現(xiàn)了外泌體，此后大量研究證實，外泌體及其內(nèi)容物在細胞通訊中發(fā)揮至關重要的作用[8]。2007年，Valadi等[9]首先證實了miRNA存在于外泌體中，并可被輸送到受體細胞內(nèi)。后又有研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可保護miRNA免受體液中RNA酶的降解，使其穩(wěn)定存在[10]。自此，外泌體源性miRNA引起了廣泛關注，各類研究層出不窮。目前發(fā)現(xiàn)的外泌體源性特異性miRNA已高達2 838種[11]，其研究范圍涵蓋免疫、腫瘤、神經(jīng)等各個領域，對多種疾病的診斷、預后評估、治療都具有不可估量的價值[12-14]。

1.2外泌體源性miRNA的分選機制在外泌體所包含的全部RNA中，成熟miRNA的比例高達41.7%[15]。2014年，Goldie等[16]證實外泌體中miRNA的比例高于其母細胞。此后多項研究表明，母細胞可能具有一種或幾種特殊的機制，將特定種類的miRNA引導入外泌體。盡管仍需更深一步的探索，但目前學者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了四種可能的途徑。(1)神經(jīng)鞘磷脂酶2(nSMase2)依賴途徑：Kosaka等[17]發(fā)現(xiàn)過表達nSMase2會使外泌體中miRNA的數(shù)量增多，而抑制nSMase2表達則能起到相反的作用。(2)miRNA基序及SUMO化核不均一核糖核蛋白(hnRNPs)依賴途徑：Villarroya-Beltri等[18]研究表明，SUMO化hnRNPA2B1可識別miRNA序列3’端的GGAG基序，使特定的miRNA進入外泌體。(3)miRNA 3’末端序列依賴途徑：Koppers-Lalic等[19]發(fā)現(xiàn)，尿苷化內(nèi)源性miRNA的3’末端主要出現(xiàn)在B細胞或尿液來源的外泌體中，而腺苷化內(nèi)源性miRNA的3’末端主要出現(xiàn)在B細胞中。(4)miRNA誘導沉默復合物(miRISC)相關途徑：Guduric-Fuchs等[20]的研究證實，敲除miRISC主要成分之一AGO2可減少HEK293T細胞來源的外泌體中優(yōu)先輸出的miRNA的類型或豐度。綜上所述，miRNA的特異性序列對其與外泌體的結合至關重要，某些酶或蛋白質(zhì)也能以一種獨立于miRNA序列的方式指導外泌體源性miRNA的分選。

1.3外泌體源性miRNA的功能及應用外泌體源性miRNA可循環(huán)至鄰近或遠處的細胞，并進入受體細胞發(fā)揮作用。其功能大致可分為兩種：一種是常規(guī)功能，即負向調(diào)控基因表達；另一種是作為配體與Toll樣受體結合并激活免疫細胞，但此功能僅存在于部分外泌體源性miRNA[21]。

外泌體源性miRNA有潛力作為非侵入性生物標志物以指示疾病狀態(tài)。一方面，外泌體的膜結構可減少體液中RNA酶對miRNA的降解作用，增強miRNA分子的穩(wěn)定性，使其在樣本中保存更長時間[6]。另一方面，外泌體存在于人體大多數(shù)體液中，且外泌體miRNA的數(shù)量和組成在生理及病理情況下存在明顯差異。諸多研究已經(jīng)對不同樣本的外泌體源性miRNA進行了分析，明確其可用于臨床診斷和預后評估[22-23]。此外，外泌體良好的生物相容性及穿越生物屏障的能力保證了內(nèi)容物的完整性和活性[24]。而除內(nèi)源性miRNA外，外源性miRNA及其他小RNA也能以相似的分子機制被外泌體轉(zhuǎn)運。如人腫瘤病毒可利用外泌體作為傳遞載體，將外源性miRNA轉(zhuǎn)移到其他未感染的細胞中[25]。這一重要發(fā)現(xiàn)也為目前備受關注的基因治療提供了新的途徑。

2外泌體源性miRNA在眼部疾病中的相關研究

在眼睛的不同部位，如視網(wǎng)膜、角膜、房水、玻璃體及淚液中，都有外泌體的存在，且多種眼科疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸均與外泌體有關[26]。近年來的研究表明，外泌體對眼科疾病的調(diào)控作用很大程度上依賴于外泌體源性miRNA的種類與功能。

2.1角膜疾病近年來的研究證實，外泌體源性miRNA對修復角膜損傷，抑制角膜纖維化具有極其重要的作用。角膜是重要的屈光介質(zhì)，而損傷、感染和手術引起的傷口愈合過程會降低角膜的透明度，引起視力下降。Shojaati等[27]的研究顯示間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell, MSC)來源的外泌體可阻斷角膜瘢痕形成，恢復瘢痕角膜的透明度，但當外泌體源性miRNA減少時，該作用減弱。這揭示了外泌體源性miRNA在角膜透明組織再生過程中的重要作用。機制研究證實，在基質(zhì)創(chuàng)傷愈合過程中，角膜細胞分化為成纖維細胞和肌成纖維細胞細胞，導致細胞外基質(zhì)沉積，角膜細胞晶狀體蛋白表達減少，最終造成角膜瘢痕形成，透明度降低[28]。因此，抑制角膜基質(zhì)細胞的分化是治療的關鍵。Shen等[29]發(fā)現(xiàn)，脂肪干細胞來源外泌體中的miR-19a下調(diào)了HIPK2的表達，導致促纖維化蛋白如α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、Ⅲ型膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶9和纖維連接蛋白減少，抑制了角膜細胞向肌成纖維細胞的分化，表明外泌體源性miRNA在修復受損角膜基質(zhì)及治療角膜纖維化中具有巨大潛力。此外，全身性疾病例如糖尿病等也會造成角膜的損傷。Leszczynska等[30]對正常及糖尿病患者角膜緣間質(zhì)細胞來源的外泌體進行了miRNA分析，確定了10個差異表達的miRNA。其中，miR-184已被證實參與維持角膜上皮穩(wěn)態(tài)，而miR-200b-3p及miR-200c-3p已被證明在抑制生長和活動方面發(fā)揮重要作用，很可能導致了糖尿病病程中上皮的遷移和愈合能力減弱，GO分析結果也支持外泌體源性miRNA與糖尿病角膜病變密切相關。以上結果表明，外泌體源性miRNA很可能對角膜緣微環(huán)境有重要的調(diào)節(jié)作用，或可作為糖尿病角膜病變的新型治療工具。

2.2視網(wǎng)膜疾病外泌體源性miRNA的調(diào)節(jié)作用在糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)中也扮演重要角色。DR是致盲的主要原因之一。在疾病進展過程中，高糖水平可影響視網(wǎng)膜神經(jīng)血管單元，導致視網(wǎng)膜炎癥，新生血管生成及神經(jīng)退行性病變等病理過程，最終造成纖維化[31]。Zhang等[31]發(fā)現(xiàn)，外泌體源性miR-126能夠靶向HMGB1通路，降低視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞中NLRP3炎癥小體的活性，從而抑制高糖誘導的視網(wǎng)膜炎癥。更重要的是，異種MSC分泌的外泌體也能夠有效減輕大鼠的視網(wǎng)膜炎癥。Kamalden等[32]的研究則顯示在高糖環(huán)境下，胰腺β細胞產(chǎn)生的miR-15a通過外泌體被運輸至視網(wǎng)膜微血管床，靶向Akt3誘導氧化應激，引起細胞凋亡，表明其可在DR的進展中發(fā)揮一定作用。內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與DR的病理性纖維化過程。Gu等[33]證實在高糖刺激下，視網(wǎng)膜色素上皮細胞分泌的外泌體通過轉(zhuǎn)移miR-202-5p作用于TGF/Smad信號通路，調(diào)控HUVEC細胞的生長，遷移和成管，抑制內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。

外泌體源性miRNA還有望為年齡相關性視網(wǎng)膜病變提供新的診斷及治療策略。年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)是老年人群視力喪失主要的原因之一。在其發(fā)病機制中，視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞發(fā)揮關鍵調(diào)節(jié)作用。它可表達血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，誘導脈絡膜新生血管生成[34]。Yoon等[35]的研究顯示，Raji外泌體富含miR-155，誘導ARPE-19細胞中VEGF-A的表達上調(diào)，且經(jīng)Raji外泌體處理后的ARPE-19細胞條件培養(yǎng)基增強了內(nèi)皮細胞成管能力。將miR-155抑制劑導入Raji外泌體后則逆轉(zhuǎn)了這些作用，表明外泌體源性miRNA的傳遞可調(diào)節(jié)細胞微環(huán)境，促進新生血管生成。高半胱氨酸(hyperhomocysteinemia，HHcy)可破壞血-視網(wǎng)膜屏障，標志ARMD等多種視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生發(fā)展[36]。Elmasry等[37]發(fā)現(xiàn)HHcy改變了RPE細胞來源外泌體中miRNA的含量，同時確定了88個差異表達的miRNA。此外，針對ARMD及其他年齡相關性視網(wǎng)膜病變的危險因素，Morris等[38]鑒定了外泌體中表達水平隨年齡變化的miRNA，發(fā)現(xiàn)外泌體介導的miR-21轉(zhuǎn)移可使p53信號通路下游的基因表達上調(diào)，從而調(diào)節(jié)老化視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞的功能。以上結果表明，外泌體源性miRNA或可作為ARMD及其他年齡相關性視網(wǎng)膜退行性病變診斷的生物標志物和治療靶點。

此外，外泌體源性miRNA還參與調(diào)節(jié)多種視網(wǎng)膜疾病中光感受器進行性退化的病理過程。Bian等[39]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠及人神經(jīng)前體細胞源性外泌體均含有一組miRNA，能夠靶向活化小膠質(zhì)細胞中的TNF-α、IL-1β及COX-2，使炎癥性信號通路明顯受到抑制，從而減少光感受器的凋亡。Xu等[40]則發(fā)現(xiàn)外泌體可將miR-24-3p轉(zhuǎn)移至光感受器，并通過下調(diào)IRE1α的蛋白水平，降低光感受器凋亡率，從而緩解缺氧誘導的視功能減退。

2.3青光眼及視神經(jīng)損傷隨著對外泌體研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)外泌體源性miRNA有望成為青光眼及視神經(jīng)損傷的新型治療靶標。青光眼及視神經(jīng)損傷可導致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cell，RGC)丟失，造成失明。目前的治療方法主要用于減緩疾病的發(fā)展，不能從根本上逆轉(zhuǎn)神經(jīng)網(wǎng)絡的損傷。干細胞移植及基因療法雖已取得一定的進展，但其限制條件多，實施不易，臨床普及困難。因此，外泌體源性miRNA的發(fā)現(xiàn)及其在青光眼和視神經(jīng)損傷中的研究進展具有重要的臨床意義。Liu等[41]分離檢測發(fā)現(xiàn)，miR-182在高眼壓性青光眼患者房水及人小梁網(wǎng)衍生的外泌體中高表達，揭示了其通過調(diào)節(jié)房水動力學及眼壓而在原發(fā)性開角型青光眼發(fā)病機制中的潛在作用。Mead等[42]也證實骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)來源的外泌體可將其內(nèi)含物運輸至視網(wǎng)膜內(nèi)部，并通過miRNA依賴機制產(chǎn)生神經(jīng)保護及軸突生成作用。此后Mead等[43]挑選了6個在BMSC小細胞外囊泡中差異表達的miRNA，組合后用腺相關病毒作為載體注射至視神經(jīng)擠壓傷大鼠玻璃體腔內(nèi)。結果顯示在5種miRNA組合中，有3種可使大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層厚度較PBS對照組及空載體組顯著增加，證實了它們對神經(jīng)節(jié)細胞及其軸突的保護作用。而Pan等[44]則在研究中發(fā)現(xiàn)臍帶間充質(zhì)干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cell，UMSC)外泌體雖然可促進視神經(jīng)夾傷后RGC的存活，但并無軸突生成作用。鑒于BMSC外泌體與UMSC外泌體中miRNA的組成不同，他們推測，是外泌體源性miRNA的不同種類和含量導致了不同的效應。

2.4其他眼部疾病在其他眼部疾病，如腫瘤、玻璃體疾病、晶狀體疾病及近視中外泌體源性miRNA也很可能發(fā)揮一定作用。但目前這些領域相關的研究較少，故仍需進一步探索。

葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma，UM)于成年人中多見，惡性程度高。臨床對其診斷大多依靠眼底鏡、超聲、FFA等檢查，但易受屈光介質(zhì)混濁，眼內(nèi)出血等因素的影響。Ragusa等[45]發(fā)現(xiàn)，UM患者血清與玻璃體液中的miRNA差異無統(tǒng)計學意義，但原癌性轉(zhuǎn)錄因子miR-146a在玻璃體液、玻璃體外泌體、血清及血清外泌體中皆上調(diào)，表明致癌外泌體可能通過腫瘤血管進入血液，傳遞功能性miRNA，影響腫瘤的發(fā)展，有望作為UM的新型非侵入性診斷標志物及治療靶點。

外泌體源性miRNA在晶狀體及玻璃體疾病領域的研究也取得了一定成果。Gao等[46]的研究顯示與年齡相關性白內(nèi)障相比，糖尿病白內(nèi)障組的外泌體中有433個差異表達的miRNA，其中miR-551b升高最顯著。同時發(fā)現(xiàn)miR-551b下調(diào)了CRYAA的表達，增加人晶狀體上皮細胞的凋亡并減少其活力，證實外泌體源性miRNA的異常表達可能是糖尿病性白內(nèi)障潛在的發(fā)病機制。RPE細胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)被認為是增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)的重要病理過程[47]。Zhang等[48]發(fā)現(xiàn)miR-543在發(fā)生EMT的ARPE-19細胞外泌體中高表達。同時，將miR-543模擬物轉(zhuǎn)染入正常ARPE-19細胞外泌體并作用于受體ARPE-19細胞后，受體細胞miR-543水平增高，α-SMA及纖維結合蛋白表達增多，E-鈣黏蛋白表達減少。這些結果表明外泌體源性miRNA在EMT的誘導中起著關鍵作用。

此外，外泌體源性miRNA在近視的發(fā)展中也具有重要的作用。Chen等[49]通過對近視組及對照組房水樣本進行外泌體miRNA測序及分析，確定了5個近視特異性miRNA(has-miR-582-3p、has-miR-17-5p、has-miR-885-3p、has-miR-19b-3p、has-miR-450b-5p)及1個近視缺失miRNA(has-miR-378a-5p)，并確定了這些miRNA的靶基因；雖仍需通過完善的體內(nèi)外實驗及臨床研究進行驗證，但該成果為近視的研究提供了新的方向。

3總結與展望

外泌體源性miRNA的發(fā)現(xiàn)為眼部疾病的研究提供了新的方向。外泌體可由眼部多種細胞釋放且分布廣泛，獲取容易，且其脂質(zhì)雙層膜結構可顯著增加miRNA的穩(wěn)定性。在生理及病理狀態(tài)下，外泌體源性miRNA的種類及豐度不同。此外，外泌體還具有較好的生物相容性及穿越生物屏障的能力。這些優(yōu)勢提升了外泌體源性miRNA應用于疾病診斷及治療的可行性。然而，外泌體源性miRNA在眼科疾病中的研究尚處于起步階段，在葡萄膜炎、眼眶炎性疾病等亞方向尚無重要研究成果。特異性miRNA的分選、裝載、轉(zhuǎn)運及對受體細胞的調(diào)控機制仍需進一步探究。隨著研究的不斷深入，外泌體源性miRNA有望成為診斷和監(jiān)測眼部疾病的新指標，甚至可能用于基因治療。未來值得探索的研究方向包括：能否在合適的樣本中選取一種或一組標準化的特異性外泌體源性miRNA，以提高對特定疾病的診斷敏感性及準確性；能否構建更詳盡的miRNA-靶基因網(wǎng)絡，揭示外泌體源性miRNA在眼部疾病發(fā)生發(fā)展中的分子機制；能否尋求成熟的技術，利用外泌體作為轉(zhuǎn)運平臺，將特定miRNA或其拮抗劑注入玻璃體腔或前房，精確調(diào)控靶基因的表達，治療內(nèi)眼疾病。