潘氏細(xì)胞及其與急性胰腺炎關(guān)系的研究進(jìn)展

伏 揚(yáng) 曾 悅

急性胰腺炎(AP)患者常伴有腸黏膜屏障功能障礙，小腸細(xì)菌移位會(huì)加重全身炎性反應(yīng)。AP患者的腸黏膜屏障功能障礙被認(rèn)為與腸黏膜的缺血-再灌注損傷、嚴(yán)重的氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡有關(guān)。潘氏細(xì)胞可分泌多種抗菌肽構(gòu)成先天免疫的一部分，小腸隱窩中高水平的抗菌肽可抵御病原體入侵。研究發(fā)現(xiàn)，潘氏細(xì)胞損傷可能在AP全身炎性反應(yīng)的進(jìn)展中起著重要作用。本文就潘氏細(xì)胞及其與AP關(guān)系的研究進(jìn)展作一綜述，以期為AP的治療拓展思路。

1 潘氏細(xì)胞概述

1.1 潘氏細(xì)胞的形態(tài)

1872年Schwalbel首次描述了存在于利氏腸腺隱窩底部的細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。約16年后，Paneth用光學(xué)顯微鏡重新觀察了這些細(xì)胞，并以其名字命名。潘氏細(xì)胞呈截短的錐體形狀，頂端有刷狀緣(即微絨毛)突出到隱窩腔中，位于基底的細(xì)胞核形狀不規(guī)則，核仁發(fā)育良好，其特征是位于細(xì)胞頂端豐富的嗜酸性顆粒。由于潘氏細(xì)胞具有廣泛的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和發(fā)育良好的高爾基體，故其具有強(qiáng)大的分泌蛋白質(zhì)的功能，分泌的物質(zhì)包括α-防御素、溶菌酶、磷脂酶A2和C型凝集素等，其中以α-防御素最為豐富。

1.2 潘氏細(xì)胞的產(chǎn)生

潘氏細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞和腸道內(nèi)分泌細(xì)胞由隱窩中的腸道干細(xì)胞群不斷分化而來(lái)。譜系追蹤研究已證明，位于小腸隱窩底部的富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體(LGR5)的細(xì)胞是可分化為小腸上皮所有類型細(xì)胞(包括潘氏細(xì)胞)的干細(xì)胞。小腸上皮細(xì)胞的壽命較短(3～5 d)，而潘氏細(xì)胞的壽命則較長(zhǎng)(約30 d)。研究表明Wnt信號(hào)通路對(duì)于維持腸上皮細(xì)胞快速更新非常重要。Wnt信號(hào)蛋白激活該通路后，β-連環(huán)蛋白(β-catenin)累積并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與T細(xì)胞因子4(TCF4)結(jié)合形成復(fù)合物來(lái)介導(dǎo)關(guān)鍵靶基因的轉(zhuǎn)錄激活。Wnt信號(hào)通路不僅對(duì)維持腸道干細(xì)胞的功能、控制上皮細(xì)胞沿隱窩-絨毛軸的遷移和定位、引導(dǎo)分泌性細(xì)胞譜系的早期發(fā)展十分關(guān)鍵，而且指導(dǎo)著潘氏細(xì)胞的終末分化[1-2]。Wnt信號(hào)通路激動(dòng)劑R-Spondin-1可刺激腸道干細(xì)胞分化為潘氏細(xì)胞，促進(jìn)潘氏細(xì)胞分泌α-防御素[3]。

Wnt信號(hào)通路激活的TCF4靶基因包括一些在潘氏細(xì)胞發(fā)生過(guò)程中起重要作用的基因，如SOX9、EPHB2和EPHB3等。Bastide等[4]對(duì)腸上皮特異性敲除SOX9基因的小鼠的小腸隱窩細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和溶菌酶染色，結(jié)果表明幾乎所有的隱窩都沒有潘氏細(xì)胞，證明SOX9基因是潘氏細(xì)胞分化所必需的。此外，細(xì)胞受體酪氨酸激酶EphB2和EphB3對(duì)潘氏細(xì)胞在隱窩中的定位起著重要作用，缺乏EphB3的小鼠中，潘氏細(xì)胞散布在整個(gè)隱窩和絨毛基底部[5]。除此以外，在缺少FZD5(一種在潘氏細(xì)胞中表達(dá)的Wnt配體受體)的情況下，未成熟的潘氏細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)定位異常[6]。

潘氏細(xì)胞分化過(guò)程對(duì)Wnt信號(hào)通路的依賴性可被其他信號(hào)通路(如Notch信號(hào)通路)降低。隱窩底部柱狀細(xì)胞表達(dá)Notch受體，同時(shí)潘氏細(xì)胞表達(dá)相應(yīng)配體[7]。對(duì)Math1基因敲除鼠和GFI1基因敲除鼠的研究表明，分泌性腸上皮細(xì)胞的分化依賴于兩條Notch信號(hào)通路的下游靶基因Math1和GFI1[8]。另有研究采用苯二氮卓(DBZ)抑制野生型B6小鼠的γ-分泌酶來(lái)抑制Notch信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)全小腸隱窩中分泌性細(xì)胞的分化顯著增多，小腸隱窩布滿原位潘氏細(xì)胞和轉(zhuǎn)分化細(xì)胞，這些轉(zhuǎn)分化細(xì)胞兼具潘氏細(xì)胞和分泌黏液細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征[9]。

2 潘氏細(xì)胞抗菌肽的分泌與功能

2.1 抗菌肽的分泌

潘氏細(xì)胞抗菌肽(AMP)的生物學(xué)功能在一定程度上與受到調(diào)控的分泌顆粒有關(guān)。顆粒的釋放是對(duì)各種刺激的反應(yīng)，包括膽堿能激動(dòng)劑、革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌，以及各種細(xì)菌產(chǎn)物(脂多糖和脂磷壁酸)，但不包括真菌和原生動(dòng)物產(chǎn)物。由于小腸內(nèi)含有豐富的細(xì)菌及其產(chǎn)物，因此潘氏細(xì)胞可能以基線速率持續(xù)分泌顆粒。

潘氏細(xì)胞對(duì)細(xì)菌入侵的反應(yīng)是通過(guò)一種基于自噬的替代性分泌系統(tǒng)釋放溶菌酶，稱為分泌性自噬，其可由細(xì)胞內(nèi)在機(jī)制觸發(fā)，沙門氏菌引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致DDIT3/CHOP表達(dá)和eIF2AK3/PERK磷酸化，從而磷酸化eIF2A/eIF2，最終溶菌酶被包裝成微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)標(biāo)記的雙膜顆粒分泌到腸腔；此外，分泌性自噬也可由細(xì)胞外在機(jī)制觸發(fā)，細(xì)菌被樹突狀細(xì)胞(DC)通過(guò)Toll樣受體(TLR)識(shí)別，隨后MYD88信號(hào)激活3型天然淋巴細(xì)胞(ILC3)，ILC3可分泌IL-22并作用于潘氏細(xì)胞，使其通過(guò)分泌性自噬分泌溶菌酶[10]。

細(xì)菌性和藥物性激動(dòng)劑所引起的顆粒分泌伴隨著細(xì)胞質(zhì)Ca2+水平升高，由KCNN4編碼的鈣激活鉀通道KCa3.1維持該分泌功能的Ca2+通量[11]。由于顆粒分泌可直接影響小腸腔內(nèi)AMP的數(shù)量和水平，因此對(duì)于顆粒分泌的調(diào)節(jié)最終也會(huì)影響潘氏細(xì)胞的功能。

2.2 AMP的生物學(xué)功能

AMP是免疫系統(tǒng)的重要組成成分，在宿主防御中起著不可或缺的作用。不同于傳統(tǒng)的抗生素(如青霉素等微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物)，由基因編碼并由核糖體合成是AMP的主要特征。潘氏細(xì)胞是腸道中分泌AMP的主要細(xì)胞。

哺乳動(dòng)物中，防御素是一類重要的AMP，根據(jù)半胱氨酸殘基的排序可分為α-防御素和β-防御素兩種，兩者對(duì)革蘭陰性菌和革蘭陽(yáng)性菌均有殺菌活性。大鼠和人類的潘氏細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及多種上皮細(xì)胞均表達(dá)防御素；而在小鼠中，防御素僅在潘氏細(xì)胞表達(dá)，故又稱為隱窩素，其前體被潘氏細(xì)胞所表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶7(MMP7)等蛋白酶切割成為成熟的活性肽[12]。人類潘氏細(xì)胞中只表達(dá)兩種α-防御素HD5和HD6，并且兩者在腸道中差異降解為不同的活性抗菌片段[13]。HD51-9是極具活性的AMP，其對(duì)所有被測(cè)試的細(xì)菌都有抗菌活性；而HD6的功能與HD5存在顯著差異，其被描述為由納米網(wǎng)形成的防御素，這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可作為黏膜防御的一部分，在宿主抵抗細(xì)菌滲透黏液層的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[13]。給予小鼠人重組HD5灌胃可減輕乙醇和結(jié)腸炎引起的小鼠營(yíng)養(yǎng)不良和黏膜炎性反應(yīng)，保護(hù)小腸和結(jié)腸的上皮完整性，并可防止內(nèi)毒素移位[14]。2020年的一項(xiàng)研究構(gòu)建了表達(dá)重組HD5的乳酸乳球菌，給予葡萄糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型小鼠該益生菌灌胃，結(jié)果顯示其可減輕結(jié)腸損傷，并可降低炎性細(xì)胞因子水平和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度[15]。防御素還具有其他活性，如HBD1和HBD2對(duì)表達(dá)趨化因子受體CCR6的細(xì)胞(如DC)具有吸引作用[16]。

溶菌酶在潘氏細(xì)胞中高表達(dá)，其還大量存在于器官的表面液體及巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中。溶菌酶是一種可特異性水解肽聚糖的糖苷酶，故表現(xiàn)出對(duì)革蘭陰性菌和革蘭陽(yáng)性菌的殺菌活性。給予小鼠溶菌酶每日灌胃可防止內(nèi)臟超敏反應(yīng)期間大腸桿菌的擴(kuò)增[17]。然而，一些共生菌(如雙歧桿菌)已發(fā)展出對(duì)溶菌酶的抵抗性，提示病原菌可能也會(huì)發(fā)展出類似的抵抗性[18]。ⅡA分泌型磷脂酶A2(sPLA2-ⅡA)在潘氏細(xì)胞中同樣為組成性表達(dá)，并表現(xiàn)出對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌的殺菌活性。C型凝集素是一組能與糖類結(jié)合的蛋白質(zhì)，具有糖類識(shí)別結(jié)構(gòu)域。人類潘氏細(xì)胞中的主要凝集素是REG3α，其小鼠同源物是REG3γ，兩者均能與肽聚糖結(jié)合，表現(xiàn)出對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的殺菌作用。

3 潘氏細(xì)胞與AP

3.1 AP引起腸黏膜屏障功能損傷

與結(jié)腸不同，小腸上皮被一層相對(duì)多孔的黏液層覆蓋，黏液層松散地附著在腸上皮細(xì)胞表面[19]。α-防御素和其他AMP在黏液中富集以增強(qiáng)黏膜屏障功能[20]。AMP和黏液的組合使得腸腔內(nèi)細(xì)菌難以直接作用于腸上皮細(xì)胞。此外，由于分泌AMP的潘氏細(xì)胞主要位于隱窩基底部，故隱窩腔內(nèi)的AMP水平較高。因此，黏液AMP屏障可保護(hù)腸道干細(xì)胞免受細(xì)菌侵襲。

AP是常見的需住院治療的消化系統(tǒng)疾病，任何原因引起的胰腺腺泡內(nèi)胰蛋白酶和其他蛋白水解酶的異常激活都會(huì)引發(fā)AP，導(dǎo)致胰腺腺泡損傷、促炎介質(zhì)和細(xì)胞因子釋放，以及微循環(huán)損傷[21]。研究表明微循環(huán)損傷和低血容量可導(dǎo)致腸黏膜缺血-再灌注損傷，繼而導(dǎo)致腸黏膜屏障完整性喪失和腸道菌群移位，從而引發(fā)繼發(fā)性感染、系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、多器官功能障礙綜合征(MODS)和多器官功能衰竭(MOF)。因此，腸黏膜屏障功能障礙是導(dǎo)致AP并發(fā)癥發(fā)生的主要因素，了解AP時(shí)腸黏膜屏障功能障礙的發(fā)生機(jī)制對(duì)于制定有效的預(yù)防和治療策略具有重要意義。

在動(dòng)物模型中，急性壞死性胰腺炎(ANP)可引起小腸細(xì)菌過(guò)度增殖，其中十二指腸的細(xì)菌過(guò)度增殖與腸道菌群移位及胰腺感染有關(guān)[22]。誘導(dǎo)大鼠發(fā)生ANP后，其腸道促炎因子的釋放增加，遠(yuǎn)端回腸AMP的分泌減少，這些由潘氏細(xì)胞合成分泌的AMP有助于維持腸道菌群的穩(wěn)態(tài)和腸黏膜屏障功能[23-24]。敲除小鼠胰腺腺泡細(xì)胞鈣通道蛋白Orai1可減少Cathelicidin相關(guān)AMP的分泌，導(dǎo)致小腸和結(jié)腸細(xì)菌定植增多，腸道通透性增高，細(xì)菌移位增多，導(dǎo)致感染率和小鼠死亡率升高；使用抗生素、短鏈游離脂肪酸和合成的Cathelicidin相關(guān)AMP可降低腺泡細(xì)胞Orai1敲除鼠的死亡率[25]。在雨蛙肽和脂多糖誘導(dǎo)的重癥急性胰腺炎(SAP)模型小鼠中，高遷移率族蛋白1(HMGB1)的表達(dá)明顯升高，阻斷HMGB1對(duì)腸黏膜屏障功能起到了保護(hù)作用，可降低血清中炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)水平，用抗HMGB1抗體阻斷HMGB1可能是改善SAP時(shí)腸黏膜屏障功能障礙的有效治療策略[26]。

3.2 潘氏細(xì)胞在AP中的變化

AP引起的腸黏膜屏障功能損傷和腸道菌群移位越來(lái)越受到學(xué)者們的關(guān)注，潘氏細(xì)胞作為組成腸黏膜屏障的重要環(huán)節(jié)，其損傷或缺陷已被證明在多種疾病發(fā)生中起著關(guān)鍵作用，如克羅恩病(CD)、潰瘍性結(jié)腸炎(UC)、放射性腸病、壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)和移植物抗宿主反應(yīng)(GVHR)等。研究表明潘氏細(xì)胞損傷可能是促進(jìn)AP進(jìn)展及全身感染的重要因素。Chen等[24]的研究顯示，與假手術(shù)組相比，ANP組大鼠胰腺和回腸末端組織的病理?yè)p傷及腸黏膜屏障損傷更嚴(yán)重，血漿和回腸末端組織中的TNF-α、IL-1β和IL-17A表達(dá)升高，潘氏細(xì)胞分泌的AMP減少。另有研究發(fā)現(xiàn)高三酰甘油血癥(HTG)相關(guān)的ANP大鼠的腸黏膜屏障損傷更嚴(yán)重，腸道通透性增高，腸道炎性反應(yīng)更嚴(yán)重，且大鼠腸道菌群改變，潘氏細(xì)胞分泌的AMP減少，提示HTG可能通過(guò)改變腸道微生物群的結(jié)構(gòu)和多樣性，以及潘氏細(xì)胞的AMP分泌加重腸道損傷，導(dǎo)致ANP病情加重[27]。

雙硫腙是一種可以選擇性消融潘氏細(xì)胞的金屬螯合劑，其逐漸被學(xué)者們用于各種研究。Zhang等[28]的研究聯(lián)合應(yīng)用雙硫腙和肺炎克雷伯氏菌誘導(dǎo)出類似于人類NEC的腸道損傷小鼠模型。Liu等[29]的研究顯示，ANP大鼠的潘氏細(xì)胞數(shù)量減少，分泌功能減弱，小腸損傷加重，菌群移位增多；與ANP組相比，注射了雙硫腙的ANP大鼠的胰腺和回腸末端組織病理?yè)p傷更嚴(yán)重，回腸組織中炎性因子表達(dá)升高，腸道通透性增高，感染率升高，生存率降低，表明潘氏細(xì)胞被破壞可能在ANP腸黏膜屏障功能障礙的發(fā)展中起著重要作用；此外，該研究還測(cè)定了BIP和ATF6的蛋白表達(dá)水平，指出ANP時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能參與了腸黏膜屏障功能障礙的發(fā)生機(jī)制，并與潘氏細(xì)胞缺失有關(guān)。Guo等[30]的研究發(fā)現(xiàn)，潘氏細(xì)胞耗竭改變了ANP大鼠的腸道微生物群組成，并降低了腸道微生物的多樣性。腸道微生物多樣性變化與ANP病情加重的關(guān)聯(lián)，以及模型小鼠中上述指標(biāo)的變化，還需更多的相關(guān)研究來(lái)證實(shí)。

4 總結(jié)與展望

潘氏細(xì)胞在腸道干細(xì)胞功能的維持、腸道微生物組成和宿主防御中起著重要的作用。目前的研究表明潘氏細(xì)胞分泌AMP的功能受損和腸道菌群紊亂可能是ANP時(shí)發(fā)生腸黏膜屏障損傷的原因之一。補(bǔ)充潘氏細(xì)胞產(chǎn)物使其功能恢復(fù)是潘氏細(xì)胞相關(guān)研究的常用方法，今后可給予AP小鼠口服或灌胃AMP來(lái)探究潘氏細(xì)胞功能恢復(fù)對(duì)AP的可能的保護(hù)作用，為臨床上治療AP時(shí)的腸道功能紊亂提供新思路，具體分子機(jī)制有待應(yīng)用基因敲除鼠和腸道類器官技術(shù)進(jìn)一步研究闡明。