骨肉瘤基因治療進(jìn)展

李哲宏 甘新天 白磊鵬 呂家興 曹海營 徐 瑩金 宇

( 1 承德醫(yī)學(xué)院研究生院2019級(jí) ， 河北 承德 067000 ； 2 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科 )

骨肉瘤(Osteosarcoma OS)是20歲以下兒童、青少年好發(fā)的骨原發(fā)性惡性腫瘤，惡性度高、預(yù)后差。目前骨肉瘤治療主要以大劑量個(gè)體化新輔助化療(在術(shù)前化療)和手術(shù)治療為主，但治療后仍具有病情進(jìn)展快、病灶轉(zhuǎn)移早、腫瘤易復(fù)發(fā)、治療困難等特點(diǎn)[1]。對(duì)抗骨肉瘤需要新的策略，而基因治療技術(shù)為攻克骨肉瘤提供了新的可能?；蛑委熓侵笇⑼庠凑；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償缺陷和異?；蛞鸬募膊?，以達(dá)到治療目的[2]。20世紀(jì) 60 年代美國分子生物學(xué)家Lederberg J首次提出基因治療的初步概念，為基因治療的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)[3]。近20年來人類基因組學(xué)的進(jìn)展表明，骨肉瘤是由宿主體細(xì)胞基因組異常介導(dǎo)而產(chǎn)生的[4]。自1990年開始，數(shù)據(jù)顯示在過去20年時(shí)間內(nèi)全球范圍內(nèi)進(jìn)行了近2600個(gè)各種基因療法臨床試驗(yàn)，直到近10年才體現(xiàn)出基因治療顯著的臨床益處，尤其是免疫缺陷病、血液系統(tǒng)疾病以及腫瘤領(lǐng)域[5-6]。目前研究骨肉瘤的基因治療在基礎(chǔ)與臨床均取得了巨大進(jìn)展，現(xiàn)對(duì)骨腫瘤的基因治療最新進(jìn)展綜述如下。

1自殺基因治療：自殺基因治療又稱為基內(nèi)導(dǎo)向性酶前體藥物治療，其原理為將腫瘤細(xì)胞或其附近的細(xì)胞修飾，使其表達(dá)自殺基因，通過使用腫瘤特異性調(diào)控元件(啟動(dòng)子)使藥物僅在腫瘤細(xì)胞中被激活，使得腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性物質(zhì)，從而導(dǎo)致攜帶該基因的受體細(xì)胞被殺死[7]。自殺基因介導(dǎo)的腫瘤基因治療還具有“旁觀者效應(yīng)”，即導(dǎo)入有自殺基因的腫瘤細(xì)胞對(duì)鄰近的未導(dǎo)入自殺基因的腫瘤細(xì)胞也有殺傷作用[8]?，F(xiàn)階段，胞嘧啶脫氨酶/5-氟胞嘧啶系統(tǒng)(CD/5-FC)、單純皰疹病毒-胸腺曉啶激酶/無環(huán)鳥苷系統(tǒng)(HSV-TK/GCV)已經(jīng)運(yùn)用到骨肉瘤試驗(yàn)性治療且取得一定進(jìn)展[9]。Wang Y等[8]發(fā)現(xiàn)由激素受體酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的反義血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)與缺氧相結(jié)合，可以抑制人骨肉瘤細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，從而提高HSV-TK / GCV系統(tǒng)的選擇性殺傷作用和旁觀者效應(yīng)。Zhang D 等[10]發(fā)現(xiàn)泛素相關(guān)修飾物拓?fù)涿窾bc9蛋白(Ubc9)在骨肉瘤中的過表達(dá)，通過小干擾RNA(siRNA)沉默Ubc9可以抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移，并顯著提高細(xì)胞對(duì)HSV-TK的敏感性。NguyenThai QA等[11]檢測發(fā)現(xiàn)表達(dá)胞嘧啶脫氨酶/5-氟胞嘧啶前藥(CD/5-FC MSCs)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞系Cal72的靶向性。隨著更轉(zhuǎn)染技術(shù)的提高、有效自殺基因的發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤的自殺基因治療有著更加廣闊的前景。

2基因沉默治療：基因沉默是特定基因的表達(dá)量下調(diào)或表達(dá)受到抑制，指的是在腫瘤治療中由雙鏈RNA誘導(dǎo)的識(shí)別和清除細(xì)胞非正常RNA，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、降低其侵襲能力的一種手段。目前研究表明，基因沉默主要有2種，轉(zhuǎn)錄水平上的基因沉默和轉(zhuǎn)錄后基因沉默。前者主要通過基因甲基化、位置效應(yīng)、同源基因的反式失活、后成修飾作用以及重復(fù)序列使得腫瘤細(xì)胞基因沉默；后者主要通過共抑制和RNA干擾使得腫瘤細(xì)胞基因沉默。目前基因沉默在骨肉瘤治療中有著長足的進(jìn)展，Han Y等[12]研究發(fā)現(xiàn)，沉默F(xiàn)OS樣抗原-1基因、Xi LC 等[13]研究發(fā)現(xiàn)皮膚橋蛋白(DPT)均可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，F(xiàn)OS樣抗原-1基因同時(shí)可以下調(diào)ERK / AP-1信號(hào)通路而下調(diào)了骨肉瘤相關(guān)基因的表達(dá)。Jin PY[14]等研究57例骨肉瘤患者的骨肉瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)DNA依賴性蛋白激酶復(fù)合催化亞基(DNA-PKcs)對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡，增殖，遷移和侵襲起抑制作用。Chen D 等[15]人研究發(fā)現(xiàn)SOx4基因沉默后，骨肉瘤細(xì)胞中Bax，Caspase-3和P53的蛋白表達(dá)水平明顯升高，而Bcl-2，MMP2和MMP9的蛋白表達(dá)水平明顯降低。實(shí)驗(yàn)裸鼠體內(nèi)分析進(jìn)一步證實(shí)，敲除SOx4可抑制骨肉瘤的生長。Liu J等[16]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制泛素特異性蛋白酶1可下調(diào)多種蛋白的表達(dá)，尤其是SIK2，緊接著SIK2的RNAi顯著降低SIK2蛋白的表達(dá)，抑制集落形成能力，誘導(dǎo)凋亡，降低骨肉瘤細(xì)胞的侵襲力。目前基因沉默技術(shù)具有特異性、高效性、靶點(diǎn)的多樣性與選擇性等特點(diǎn)，有望給腫瘤的治療帶來革命性的進(jìn)展。

3抑癌基因治療：抑癌基因是一類存在于正常細(xì)胞內(nèi)可抑制細(xì)胞生長并具有潛在抑癌作用的基因。抑癌基因在控制細(xì)胞生長、增殖及分化過程中起著十分重要的負(fù)調(diào)節(jié)作用，它與原癌基因相互制約，維持正負(fù)調(diào)節(jié)信號(hào)的相對(duì)穩(wěn)定。而骨肉瘤最常見的特征是基因組紊亂，染色體改變的非整倍體，腫瘤抑制基因和細(xì)胞周期的放松調(diào)控，以及缺乏DNA修復(fù)[17]。骨肉瘤的發(fā)生與成骨過程中參與抑癌基因甲基化失活導(dǎo)致監(jiān)視失敗、缺乏DNA修復(fù)或抑制凋亡有關(guān)[18]。p53基因全長約20kb，定位于人染色體17p13，轉(zhuǎn)錄成2.5kb mRNA，編碼393個(gè)氨基酸組成的蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約為53KD。p53基因由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子組成，外顯子2、4、5、7、8分別編碼5個(gè)進(jìn)化上高度保守的結(jié)構(gòu)域。p53基因自發(fā)現(xiàn)以來，一直都是備受關(guān)注的熱點(diǎn)抑癌基因，作為對(duì)各種細(xì)胞信號(hào)的響應(yīng)，腫瘤抑制蛋白p53激活了一系列基因，這些下游的microRNAs促進(jìn)了基因組完整性的維持、細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞衰老和凋亡[19]。有報(bào)道稱[18]，在骨肉瘤來源的細(xì)胞系中，p53靶基因以及活性受p53調(diào)控的基因，由于其啟動(dòng)子的高甲基化而被沉默，而導(dǎo)致的基因組紊亂，誘導(dǎo)骨肉瘤的發(fā)生。最新研究發(fā)現(xiàn),Jun激活結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白1(Jun1)在體內(nèi)的過表達(dá)，以p53依賴的方式加速自發(fā)腫瘤的形成，故Jun1可以成為治療骨肉瘤的靶點(diǎn)之一[20]。Yang J等[21]實(shí)驗(yàn)證明熱休克蛋白90(HSP90)被烯丙基氨基17-去甲氧基格爾德霉素(17-AAG)抑制，其可通過β-catenin/ runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)信號(hào)傳導(dǎo)抑制骨肉瘤細(xì)胞生長。Lin JT等[22]利用殼聚糖接枝聚修飾人類免疫缺陷病毒-1轉(zhuǎn)錄反式激活因子，可同時(shí)將p53和阿霉素共轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞核，從而在體內(nèi)外有效地消除癌細(xì)胞，發(fā)揮其抗腫瘤作用。Rb基因全長約200kb，定位于人染色體13q14，轉(zhuǎn)錄成4757bpm RNA，編碼928個(gè)氨基酸組成的蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約為110KD。Rb基因由有27個(gè)外顯子和26個(gè)內(nèi)含子組成，外顯子與內(nèi)含子交界處是保守的GT-AT序列。RB基因是人類癌癥中最常見的突變基因之一。經(jīng)典途徑：RB通過調(diào)節(jié)E2F轉(zhuǎn)錄因子的活性，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程中的G1 / S期過渡發(fā)揮其腫瘤抑制活性。然而，當(dāng)腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移、增殖、耐藥時(shí)，最容易檢測到的就屬RB基因的畸變[23]。Kashuba E等[24]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RB結(jié)合蛋白MRPS18-2(S18-2)在原代成纖維細(xì)胞中的過表達(dá)導(dǎo)致其永生化，并伴隨著胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物的誘導(dǎo)和最終的惡性轉(zhuǎn)化，抑制S18-2可以達(dá)到抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖生長。同時(shí)臨床研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(RB)-E2F通路的激活與否與臨床預(yù)后較差的分子亞型之間存在顯著的關(guān)聯(lián)，即該通路定義了骨肉瘤的分子表型，為臨床篩選敏感藥物、治療提供了靶向支持[25]。Wang TX等[26]用RNA22程序預(yù)測，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，并用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化。鑒定出47個(gè)下調(diào)的高甲基化基因和3個(gè)上調(diào)的低甲基化基因，這些基因可能參與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，為潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。Kreahling JM等[27]臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，MK1775作為單一治療藥物時(shí)，所有被測試的骨肉瘤中都會(huì)進(jìn)入有絲分裂和啟動(dòng)凋亡細(xì)胞死亡。MK1775可以抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶導(dǎo)致顯著的骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。

4免疫基因治療：免疫基因治療是通過增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的識(shí)別能力、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的機(jī)能，從而達(dá)到抑制腫瘤的增長、侵襲轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)。先天性和適應(yīng)性免疫在抑制腫瘤生長中起著至關(guān)重要的作用，先天性免疫細(xì)胞通過直接識(shí)別和殺死或通過自我激活觸發(fā)強(qiáng)烈的適應(yīng)性免疫反應(yīng)2種機(jī)制來實(shí)行腫瘤抑制[28]。針對(duì)骨肉瘤的免疫基因治療，Tellez-Gabriel M等[29]認(rèn)為，骨肉瘤的特征之一為免疫細(xì)胞浸潤，包括T和B淋巴細(xì)胞，NK細(xì)胞，多核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。Lussier DM 等[30]發(fā)現(xiàn)，a-CTLA-4和ax-PD-L1抗體在轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的K7M2小鼠模型中具有阻斷作用，阻斷可以通過增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤的清除率而改善K7M2小鼠的生存率。血管內(nèi)皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(VEGFR-TKI)是小分子抗腫瘤血管生成的藥物，免疫檢查點(diǎn)則是防止免疫系統(tǒng)過度激活的一致性通路，能夠在免疫反應(yīng)過度時(shí)對(duì)信號(hào)通路進(jìn)行關(guān)閉。Duan XL等[31]發(fā)現(xiàn)，使用VEGFR-TKI和免疫檢查點(diǎn)抑制劑的聯(lián)合治療骨肉瘤荷瘤小鼠，其聯(lián)合療法抑制信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3的活化來降低PD-L1的表達(dá)，并抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，減少了荷瘤小鼠的肺轉(zhuǎn)移，腫瘤生長，改善了生存率并逆轉(zhuǎn)了腫瘤微環(huán)境。免疫基因理想的治療方式應(yīng)具備安全、價(jià)廉、性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)。免疫基因治療通過影響基因表達(dá)改變了體內(nèi)腫瘤微環(huán)境，激活自身的免疫功能殺傷腫瘤細(xì)胞，有著廣闊的臨床前景。

5抗血管生成基因治療：在周圍血管的支持下，細(xì)胞毒性藥物雖然可以殺死腫瘤細(xì)胞，但殘存腫瘤細(xì)胞仍可獲得血供而得以繼續(xù)生長。同時(shí)，異常的腫瘤血管使藥物向腫瘤組織內(nèi)部遞送減少，最終導(dǎo)致治療效果受限?？寡苌芍委熞阅[瘤新生血管為作用靶點(diǎn)，切斷腫瘤生長轉(zhuǎn)移所需要的“營養(yǎng)供應(yīng)”從而達(dá)到“餓死”腫瘤的目的。與僅作用于腫瘤細(xì)胞增殖的化療藥物不同，通過與血管內(nèi)皮生長因子特異性結(jié)合，阻止其與受體相互作用，發(fā)揮對(duì)腫瘤血管的多種作用：使現(xiàn)有的腫瘤血管退化，從而切斷腫瘤細(xì)胞生長所需氧氣及其他營養(yǎng)物質(zhì)；抑制腫瘤新生血管生成，從而持續(xù)抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[32]。Li YS等[33]在研究中發(fā)現(xiàn)，在骨肉瘤中，金屬蛋白酶MMPs過度表達(dá)，其過度表達(dá)導(dǎo)致肉瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)處(主要是在肺部)存活，生長并產(chǎn)生轉(zhuǎn)移灶的關(guān)鍵性要素。Hadjimichael AC等[34]發(fā)現(xiàn)，多西環(huán)素通過抑制MMP功能阻止細(xì)胞外基質(zhì)和基本膜降解，使得骨肉瘤細(xì)胞喪失了侵襲和轉(zhuǎn)移能力。此外研究還發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素消除分泌血管內(nèi)皮生長因子的抗血管生成作用，使得腫瘤缺乏營養(yǎng)供給。抗血管生成基因通過抑制骨肉瘤滋養(yǎng)血管，阻斷骨肉瘤營養(yǎng)供給，有效阻斷了腫瘤的生長轉(zhuǎn)移。

問題與展望：基因治療作為一嶄新的治療手段，為腫瘤患者帶來希望，但其運(yùn)用從基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)到臨床應(yīng)用仍有很長的一段路需要走，回順基因治療骨肉瘤的進(jìn)展，其誕生以來所走過的道路，基因治療還面臨很多問題與挑戰(zhàn)，包括基因組編輯發(fā)生脫靶效應(yīng),從而導(dǎo)致不同程度的副作用、毒性或動(dòng)力學(xué)改變，如何提高基因遞送和編輯效率以精確治療骨肉瘤，基因轉(zhuǎn)移效率高導(dǎo)致的嚴(yán)重毒性等。雖然基因治療目前存在一定的問題，但隨著科技發(fā)展，基因治療的關(guān)鍵技術(shù)將會(huì)不斷得到突破和解決。未來幾年是全球腫瘤基因治療技術(shù)突破重點(diǎn)時(shí)，基因治療或?qū)⒊蔀楣侨饬鲋委煵豢苫蛉钡囊徊糠帧?/p>