口腔白念珠菌病動物模型的研究進(jìn)展

張立芳 王好公 谷 悅 劉 昆 劉 娜 劉 慶

作者單位：050017 石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院，河北省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，河北省口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心

口腔念珠菌病是發(fā)生在口腔黏膜的機(jī)會性真菌感染，白念珠菌是主要致病菌[1]，人類在飲食、社會習(xí)慣及免疫狀況等方面的顯著差異會影響疾病的病因?qū)W和發(fā)病機(jī)制[2]，因此需要合適動物模型來研究宿主－病原體的相互作用及開發(fā)新的抗真菌藥物或替代療法。早期研究者曾用猴子誘導(dǎo)義齒性口炎，在生物學(xué)上猴子雖然是最接近人類的生物，然而，它們維持昂貴，難以操縱；兔子和豚鼠進(jìn)行口腔操作也相對具有挑戰(zhàn)性；倉鼠頰囊并不是非常類似于人類的口腔黏膜，這使得它們不太適合作為實驗對象[3]。大鼠和小鼠在進(jìn)化上與人類較接近，而且可以通過特定的接種途徑進(jìn)行精確接種[4]，許多研究者利用這兩種動物開發(fā)的口腔念珠菌模型都真實模擬了人類口腔念珠菌感染，已成為研究黏膜白念珠菌感染的標(biāo)準(zhǔn)工具[5]。

口腔念珠菌病臨床類型主要包括假膜性念珠菌?。Z口瘡）、紅斑性念珠菌病（義齒性口炎）以及增殖性念珠菌病[6]。本文主要就鵝口瘡和義齒性口炎的小鼠和大鼠模型及其實用性進(jìn)行綜述。

一、鵝口瘡模型

鵝口瘡是由白念珠菌引起的以白色凝乳狀物為特征的口腔黏膜病，常見于長期使用廣譜抗生素、口干癥和免疫力低下患者[5，7]。

1.小鼠

（1）造模方法：早期曾有研究者[6～9]通過切除涎腺、使用雌激素或輻射方法誘導(dǎo)小鼠口腔念珠菌感染，由于缺乏典型鵝口瘡病損和定量評價，這些動物模型仍有局限性，應(yīng)用較少，現(xiàn)如今大多數(shù)研究者都是在免疫抑制小鼠中進(jìn)行。

Takakura 等[10]較早利用免疫抑制劑模擬人類口腔自然感染，該模型在感染前1 天和感染后第3 天皮下注射免疫抑制劑潑尼松龍（100mg/kg），感染前1 天在小鼠飲水中加入濃度為0.83mg/ml 的鹽酸四環(huán)素直至實驗結(jié)束，并以用蘸有白念珠菌懸濁液（TITT2640，2.5×107個 /ml）的棉簽擦拭頰、舌、軟腭等口腔黏膜的接種方式產(chǎn)生感染。然而，李成蹊等[11]將注射免疫抑制劑的方式改為肌肉注射，建立的模型比Takakura 等較早出現(xiàn)明顯偽膜和較高的菌量，因此作者推測肌注法免疫抑制作用更強(qiáng)。有學(xué)者[12，13]認(rèn)為少量念珠菌可通過繁殖到較高數(shù)量誘導(dǎo)感染，念珠菌濃度不重要，因此推測菌種SC5314 致病性強(qiáng)于TITT2640。

口咽念珠菌病多見于免疫力低下患者，在艾滋病毒感染過程中，高達(dá)80%的患者會出現(xiàn)這種疾病[14]。誘導(dǎo)口咽念珠菌病方法[15～17]是小鼠分別于接種前1 天，接種后1、3 天皮下注射醋酸可的松進(jìn)行免疫抑制，將浸有白念珠菌懸浮液的棉球置于口腔或舌下75min～2h，誘導(dǎo)長時間感染，有學(xué)者[5]認(rèn)為該模型是研究口咽念珠菌病的標(biāo)準(zhǔn)動物模型。也有研究者[18]等將此模型和體內(nèi)成像技術(shù)結(jié)合，接種基因工程生物熒光白念珠菌，開發(fā)可實時監(jiān)測口咽念珠菌病發(fā)展的模型，與傳統(tǒng)舌組織菌落形成單位（colony-forming units，CFU）測定相比，通過測量光子發(fā)射所檢測真菌負(fù)荷更能快速且準(zhǔn)確反映整個口腔真實真菌負(fù)荷，這個模型還可以識別白念珠菌在特定器官的靶部位，可以作為一種新的方式探索白念珠菌從局部向系統(tǒng)傳播機(jī)制。

（2）模型評估：一般從口腔病損、真菌載量、組織病理學(xué)方面進(jìn)行評估。

口腔病損評價：成模后口腔病損一般表現(xiàn)為偽膜或白斑。研究者[10，13]對小鼠舌背表面?zhèn)文せ虬装呙娣e及厚薄評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0 分：正常；1 分：少量薄偽膜或白斑，覆蓋舌表面＜20%；2 分：薄偽膜或中量白斑，覆蓋舌表面積≤90%且＞21%；3 分：薄偽膜或大量白斑，覆蓋舌表面積＞91%；4 分：厚偽膜或大量白斑，覆蓋舌表面積＞91%，口腔黏糊，流涎明顯。研究者對成模持續(xù)時間研究發(fā)現(xiàn)潑尼松龍模型至少持續(xù) 7 天[10，11]，若發(fā)生系統(tǒng)感染死亡率增加，模型持續(xù)時間縮短[13]。口咽念珠菌模型至少持續(xù)9 天[15]。

真菌載量測定：感染后小鼠舌部菌量一般呈遞增－平穩(wěn)－下降趨勢，潑尼松龍模型[10，11]穩(wěn)定期一般為感染后3～5 天，菌量維持在105～106CFU，若黏膜感染蔓延至系統(tǒng)感染，舌部菌量從感染后第3天開始遞減[13]?？谘誓钪榫姿峥傻乃赡Ｐ蚚15]穩(wěn)定期為感染后5～9 天，菌量維持在105～106CFU。

組織病理學(xué)：鵝口瘡模型組織學(xué)可觀察到大量菌絲覆蓋于舌背上皮，并已侵入上皮組織，上皮層結(jié)構(gòu)被破壞，同時伴有炎性浸潤。另外，口咽念珠菌模型PAS 染色顯示白念珠菌細(xì)胞已侵入食道黏膜的淺表上皮層[10，11，13，15]。

（3）模型應(yīng)用：抗真菌藥物或抗真菌光動力療法療效評價：小鼠免疫抑制劑-念珠菌感染模型相對來說既有穩(wěn)定感染期，又有典型鵝口瘡局部癥狀，許多研究者借鑒此種模型評價抗真菌藥物或抗真菌光動力療法的療效。Jiang 等[19]利用Takakura 等開發(fā)的模型評估氟西汀聯(lián)合卡泊芬凈對口腔念珠菌病的抗真菌活性；Carmello 等[20]也通過此模型檢測陽離子納米乳包封氯酞菁鋁（CLALP-NE）介導(dǎo)的光動力療法在體內(nèi)治療口腔念珠菌病的效果。另外，也有學(xué)者[21，22]利用口咽念珠菌模型證明唾液中天然存在的趨化因子CCL28、組蛋白-5 生物黏附性水凝膠等是治療口咽念珠菌病的候選藥物。

毒力因子和易感因素研究：Nobile 等[23]構(gòu)建口咽念珠菌模型時發(fā)現(xiàn)缺乏轉(zhuǎn)錄因子Rim101 白念珠菌對黏膜上皮細(xì)胞損傷較野生型小，說明Rim101是白念珠菌重要毒力因子；此外，Bichele 等[24]也通過該模型發(fā)現(xiàn)缺失免疫細(xì)胞因子IL-22 的小鼠真菌清除率降低，證實IL-22 缺失在導(dǎo)致宿主對念珠菌感染易感性方面發(fā)揮重要作用。

口腔微生物學(xué)研究：有學(xué)者[25]將口咽念珠菌模型用于研究白念珠菌生物膜結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)共生菌參與生物膜組成，提示口腔共生菌群在白念珠菌感染中發(fā)揮重要作用。之后，研究人員[26～29]還構(gòu)建白念珠菌和鏈球菌聯(lián)合感染模型，發(fā)現(xiàn)鏈球菌可以通過增強(qiáng)感染的炎癥反應(yīng)來增加白念珠菌毒力。kong 等[30]也用相同的方法探究在口腔念珠菌病的發(fā)展過程中金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的相互作用關(guān)系。

2.大鼠

（1）造模方法：在20 世紀(jì)50 年代后期，與使用四環(huán)素等廣譜抗生素相關(guān)淺表感染的報告數(shù)量逐步增加，70 年代初，許多研究者[2]大多以喂食四環(huán)素的方法誘導(dǎo)大鼠口腔感染，建模所需時間長，病變主要表現(xiàn)為局限性乳頭萎縮，雖沒有鵝口瘡典型癥狀，近些年來也有學(xué)者應(yīng)用此模型研究口腔念珠菌病病因?qū)W及治療策略[31]。然而，呂秋菊團(tuán)隊[32]將大鼠飲水中四環(huán)素改為青霉素，并在右頰黏膜接種白念珠菌后，在不劃破黏膜情況下每周用無菌探針輕劃黏膜3次成功誘導(dǎo)建模。此外，免疫抑制劑地塞米松聯(lián)合四環(huán)素的大鼠實驗性口腔念珠菌感染模型[33]也已開發(fā)，實驗大鼠從接種第1 天一直到實驗結(jié)束，飲食含0.5mg/L 免疫抑制劑地塞米松飲用水和0.1%鹽酸四環(huán)素水溶液。每隔48 小時，大鼠口服含白念珠菌的生理鹽水懸浮液0.1ml，一共接種3 次。

（2）模型評估：一般從口腔病損、真菌載量、組織病理學(xué)方面進(jìn)行評估，與小鼠鵝口瘡模型相似。

（3）模型應(yīng)用：上述兩種模型建模成功后，可用于抗真菌藥物療效評估。Chami 等[34]利用地塞米松聯(lián)合四環(huán)素的模型比較了植物源物質(zhì)（香芹酚和丁香酚）和制霉菌素對口腔念珠菌病的影響。

白念珠菌是大鼠口腔中一種低水平的共生體，當(dāng)需要考慮先天免疫反應(yīng)對疾病過程的影響時，在人工接種之前，需要排除念珠菌的自然口腔定植。與大鼠不同，白念珠菌不是常規(guī)實驗小鼠口腔內(nèi)的常駐微生物，此外，健康小鼠口腔黏膜的免疫生物學(xué)特征也被許多學(xué)者很好地描述，使其成為闡明黏膜組織對念珠菌感染的適應(yīng)性免疫反應(yīng)的理想材料，并且小鼠相對成本低，相對容易管理，因此免疫抑制劑聯(lián)合四環(huán)素的小鼠鵝口瘡模型更加廣泛應(yīng)用[6]。

二、義齒性口炎模型

義齒性口炎是一種由粘附或定植在義齒材料上的念珠菌引起腭部黏膜以紅斑為主要特征的黏膜炎癥，病原體主要以白色念珠菌為主。表現(xiàn)為口腔疼痛，影響進(jìn)食和說話，徹底清除義齒材料上的真菌是治療成功的關(guān)鍵[5，35]。

1.造模方法：早期的義齒性口炎體內(nèi)模型將丙烯酸假牙安裝在猴子口腔腭部模擬人類假牙口炎的組織病理學(xué)，然而，由于倫理和成本問題阻礙這種模型的廣泛使用。大鼠尺寸相對較小，但口腔較大，可以容納假牙放置，而且成本較低、容易飼養(yǎng)，因此大鼠模型已成為研究義齒性口炎的金標(biāo)準(zhǔn)[5]。

Nett 等[36]利用正畸金屬絲將非定制義齒固定于經(jīng)可的松免疫抑制的大鼠口腔兩側(cè)磨牙之間腭黏膜處，不過，可能由于非定制義齒與上腭無法貼合，腭部黏膜沒有出現(xiàn)炎癥。Tobouti 等[37]對上述模型加以修改成功構(gòu)建模型，主要不同在于：一是通過在大鼠口腔取印膜為每只大鼠定制獨立丙烯酸義齒基托實現(xiàn)假牙與上腭最佳接觸；二是誘導(dǎo)念珠菌感染時未使用免疫抑制劑，因為目前沒有科學(xué)證據(jù)表明義齒性口炎與免疫力有關(guān)；三是將義齒放入含菌懸浮液（107個/ml）中孵育90min，以獲得高通量定植。然而Sultan 等[38]對免疫抑制劑的使用持有不同意見，作者認(rèn)為若不使用免疫抑制劑，為了確保白念珠菌定植成功需接種高通量念珠菌，這不能反映人類口腔的正常情況。同時作者把義齒固定方式改為復(fù)合材料粘接固定，與正畸絲固定法相比，這樣可以更好保持裝置并達(dá)到緊密貼合的目的。此外，作者還開發(fā)了一種三維打印數(shù)字化設(shè)計的大鼠口腔內(nèi)裝置，該裝置僅對一只大鼠進(jìn)行一次印模，對生成的模具進(jìn)行光學(xué)掃描從而創(chuàng)造一個數(shù)字模型，進(jìn)而對模型進(jìn)行數(shù)字化調(diào)整，為大鼠制作一種通用匹配的口腔內(nèi)裝置，節(jié)約成本，省時省力，這種通過正常濃度菌液（108或109個/ml）建立的模型在相同時間出現(xiàn)的癥狀比Tobouti 的模型嚴(yán)重。Johnson 等[39]利用個體印膜鑄造技術(shù)在免疫活性大鼠口腔中開發(fā)了一種新型由固定和可拆卸部分組成的定制義齒系統(tǒng)模型，固定部分嵌有磁鐵，通過正畸絲固定在后磨牙上，安裝在前腭的可拆卸部分通過嵌入的金屬棒磁性地連接到固定部分，可拆卸部分更容易更換和重復(fù)取樣，允許進(jìn)行縱向分析。

2.模型評估：一般從口腔病損、真菌載量、組織病理學(xué)方面進(jìn)行評估與鑒定。

（1）口腔病損評價：成模后口腔病損輕者表現(xiàn)為點狀紅斑，重者表現(xiàn)為彌漫性紅斑或水腫。有學(xué)者對大鼠腭部組織病損和炎癥程度進(jìn)行評分：0：無炎癥；1：點狀紅斑；2：彌漫性紅斑和水腫；3：彌漫性紅斑/水腫和乳頭狀增生[39]。

Tobouti 等高濃度感染模型和Sultan 等免疫抑制劑模型在感染后第4 天出現(xiàn)癥狀，屬于急性義齒性口炎模型。Johnson 等開發(fā)的新型嚙齒動物義齒系統(tǒng)由于未使用免疫制制劑，感染后第4 周出現(xiàn)癥狀，屬于慢性義齒性口炎模型[37～39]。

（2）真菌載量測定：真菌載量一般隨時間遞增，慢性義齒性口炎模型菌量一般在2～8 周內(nèi)維持較高水平[39]。

（3）組織病理學(xué)：腭黏膜組織病理學(xué)特征一般表現(xiàn)為腭皺襞過度角化，伴有微膿腫，組織被菌絲侵襲[37～39]。

3.模型應(yīng)用：研究者除了利用模型研究義齒性口炎相關(guān)治療[38]外，還可以通過模擬義齒生物膜形成來測試特定基因?qū)ι锬び绊慬40]。

近年來，有關(guān)白念珠菌和鏈球菌、金黃色葡萄球菌等口腔共生菌聯(lián)合感染模型亦見諸多報道[41，42]，因此，與白念珠菌單一模型相比，混合感染模型更接近于疾病的真實狀態(tài)，混合感染造成病理生理改變及相應(yīng)的有效治療方法或許是未來的一個研究方向。