血漿腎素水平評價方法的研究進(jìn)展

秦飛，祝珊珊，陳丹，許莉

(廈門醫(yī)學(xué)院，福建 廈門 361023)

高血壓是一個全球性的公共衛(wèi)生問題。我國高血壓患者約2.45 億，目前患病率仍呈上升趨勢，知曉率、治療率、控制率卻較低[1]。高血壓如不及時治療會導(dǎo)致腦血管疾病、心臟疾病、腎臟疾病、糖尿病等。因此，早期發(fā)現(xiàn)與治療對預(yù)防相關(guān)慢性疾病至關(guān)重要。腎素-血管緊張素-醛固酮(RAAS)系統(tǒng)是調(diào)節(jié)人體水、電解質(zhì)平衡以及血容量、血管張力和血壓的激素鏈之一，RAAS系統(tǒng)失調(diào)將導(dǎo)致腎性高血壓、內(nèi)分泌型高血壓，其主要調(diào)控因素腎素的檢測，在高血壓的診斷中發(fā)揮著重要作用。腎素是腎臟球旁復(fù)合體的球旁細(xì)胞釋放的一種蛋白水解酶，分子量為37 kD，腎素分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜以及低豐度的特征，使其檢測變得困難，目前尚沒有標(biāo)準(zhǔn)化的檢測方法。因此建立與完善一種易于操作、耗時較短、結(jié)果可比的標(biāo)準(zhǔn)化方法在腎素的臨床檢測中具有重要意義。

1 腎素水平評價的臨床意義

腎素是RAAS系統(tǒng)的主要調(diào)控因素，當(dāng)血壓降低時，腎臟分泌腎素釋放到血液中，腎素催化肝臟分泌的血管緊張素原水解產(chǎn)生血管緊張素Ⅰ(Ang-Ⅰ)，Ang-Ⅰ經(jīng)過肺、腎等臟器時，經(jīng)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶剪切C-末端兩個氨基酸殘基生成血管緊張素Ⅱ(Ang-Ⅱ)。Ang-Ⅱ具有高效的收縮血管作用，使血壓升高；Ang-Ⅱ也能刺激腎上腺皮質(zhì)分泌醛固酮，醛固酮能促進(jìn)腎臟對水和鈉離子的重吸收，繼而增加體液容量，升高血壓。因此血漿腎素活性測定對于明確高血壓的發(fā)病機(jī)制、指導(dǎo)治療和評價預(yù)后有參考價值。崔淑嫻等[2]比較了高血壓合并焦慮抑郁患者和原發(fā)性高血壓患者的血漿腎素活性、醛固酮水平及血壓變異性，發(fā)現(xiàn)高血壓并焦慮抑郁患者臥位、立位血漿腎素活性及醛固酮水平明顯高于原發(fā)性高血壓患者，提示RAAS激活參與了焦慮抑郁患者的高血壓發(fā)病過程，為降壓藥物的選擇提供了理論依據(jù)，降壓藥物選用長效RAAS抑制劑為最佳。吳冰等[3]研究了血漿醛固酮/腎素濃度比值(ADRR)對原發(fā)性醛固酮增多癥(PA)的診斷價值，結(jié)果表明，ADRR可作為篩查PA的一種有效指標(biāo)，并建議用25作為立位ADRR初篩的臨界值。李寧等[4]研究了尿醛固酮/血漿腎素活性比值(UARR)在PA篩查中的價值，立位UAPP的最佳臨界點為5.1 ng·mL-1·h-1，靈敏度為92.13%，特異度為91.18%，結(jié)果表明，立位UARR也是一種有效的PA篩查指標(biāo)。2016年的中國《原發(fā)性醛固酮增多癥診斷治療的專家共識》[5]以及同年美國內(nèi)分泌協(xié)會更新的原發(fā)性醛固酮增多癥臨床實踐指南[6]均建議用醛固酮/腎素比值來進(jìn)行PA的初篩和診斷，其中腎素的檢測包括兩種方法，腎素活性(PRA)以及腎素濃度(PRC)，前者通過測定Ang-Ⅰ的產(chǎn)生速率來反映腎素活性，后者則是直接測定血漿腎素濃度。

2 腎素活性檢測方法

PRA檢測的常規(guī)步驟是在一定溫度和pH值條件下孵育血漿，使血管緊張素原在腎素作用下轉(zhuǎn)化為Ang-Ⅰ，同時加入血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，抑制Ang-Ⅰ進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為Ang-Ⅱ，而后通過冰浴或化學(xué)方法終止反應(yīng)，測定Ang-Ⅰ的生成量，結(jié)合孵育時間計算PRA，Ang-Ⅰ的產(chǎn)生速率越快則腎素活性越強(qiáng)。其中，Ang-Ⅰ的定量方法主要有免疫學(xué)分析法和質(zhì)譜法。

2.1 免疫學(xué)分析法

1969年Boyd等[7]首先提出將放射免疫法(RIA)用于PRA的評價，經(jīng)過幾十年的改進(jìn)，RIA已成為臨床實驗室常用方法。該方法以125I標(biāo)記的Ang-Ⅰ作為競爭抗原，通過競爭結(jié)合來定量待測樣品中的Ang-Ⅰ。RIA法發(fā)展較早，技術(shù)成熟，但實際應(yīng)用中仍存在明顯的問題。首先RIA檢測Ang-Ⅰ是基于競爭性結(jié)合原則，所使用的抗體同時可以與其他內(nèi)源性血管緊張素進(jìn)行非特異性結(jié)合，這種潛在的交叉反應(yīng)性會高估腎素活性。此外，RIA法還存在難以自動化、線性范圍窄、產(chǎn)生放射性污染等問題，臨床應(yīng)用中有一定的局限性。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測PRA也有報道，但是該方法的靈敏度不如RIA，限制了其實際應(yīng)用[8]。

2.2 質(zhì)譜法

質(zhì)譜法的高特異性、高靈敏度、低檢測限等優(yōu)勢使其在醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，在血液或體液中氨基酸、肽、維生素、激素、血藥濃度、微量元素等微量或恒量物質(zhì)的定性定量檢測中都有應(yīng)用。用于PRA評價的質(zhì)譜方法主要有兩種：電噴霧質(zhì)譜(LC/ESI-MS/MS)和免疫基質(zhì)輔助激光解離質(zhì)譜(iMALDI-MS)。前者在孵育結(jié)束后對Ang-Ⅰ進(jìn)行固相萃取，再通過液相色譜洗脫后直接測定Ang-Ⅰ濃度；后者在孵育結(jié)束后首先用抗體修飾的磁性顆粒捕獲Ang-Ⅰ，通過磁分離后，再用MALDI質(zhì)譜進(jìn)行定量。徐雯等[9]建立了血漿PRA的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測方法，該方法的特異性、重復(fù)性、基質(zhì)效應(yīng)等均在臨床可接受范圍，定量下限為0.084 4 ng·mL-1·h-1，線性范圍為0.084 4～30.000 0 ng/mL，線性相關(guān)系數(shù)r2=0.99，與RIA結(jié)果相比，兩者結(jié)果一致性較好；RIA的診斷特異性(99.4%)優(yōu)于LC-MS/MS(91.0%)，但靈敏度(33.3%)遠(yuǎn)不及LC-MS/MS(96.3%)。該方法目前已在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院臨床應(yīng)用。Camenzind等[10]建立了PRA的iMALDI-MS分析方法，與RIA及LC-MS/MS的檢測結(jié)果均表現(xiàn)出良好的相關(guān)性(iMALDI-MS與RIA，r2=0.941 2；iMALDI-MS與LC-MS/MS，r2=0.947 1)，與RIA法相比，iMALDI-MS的優(yōu)勢是通過抗體富集Ang-Ⅰ，不存在放射性污染；富集后再使用質(zhì)譜對特定目標(biāo)物分子量進(jìn)行篩選檢測，消除了非特異性吸附的影響，克服了RIA的最大不足。與免疫學(xué)分析方法相比，質(zhì)譜檢測的靈敏度更高、分析時間更短，且無需用到放射性核苷酸。但質(zhì)譜儀器價格昂貴并需要專人操作維護(hù)，且測量性能遠(yuǎn)不能滿足國際臨床化學(xué)與檢驗醫(yī)學(xué)聯(lián)合會對參考方法測量性能的要求[11]，在方法標(biāo)準(zhǔn)化方面仍需要進(jìn)行大量探究工作。

3 腎素濃度檢測

化學(xué)發(fā)光免疫法(CLIA)是近年來發(fā)展起來的PRC檢測方法，檢測原理是基于雙抗夾心，抗體一為包被在磁微粒上的能識別腎素的特異性單克隆抗體，抗體二為結(jié)合了發(fā)光底物的腎素特有的單克隆抗體，待測物與兩種抗體同時加入反應(yīng)體系進(jìn)行孵育后沖洗，同時結(jié)合兩種抗體的被測物，在催化劑作用下產(chǎn)生光信號，發(fā)光強(qiáng)度與被測物濃度成正相關(guān)[12]。對CLIA法及傳統(tǒng)RIA法檢測性能的對比研究已有大量報道，黃富亮和高通[13]比較分析了兩種方法的準(zhǔn)確性、精密度及線性范圍的差異。CLIA法回收率(99.1%～102.3%)優(yōu)于RIA法的回收率(94.2%～108.9%)，表明CLIA方法準(zhǔn)確性更高；CLIA法的批間變異系數(shù)小于RIA法(P<0.01)，但批內(nèi)變異系數(shù)大于RIA法(P<0.01)，表明CLIA法的精密度略差；兩種方法檢測的相關(guān)性良好(r=0.996，P<0.01)，CLIA法的線性范圍(25～850 pg/mL)大于RIA法線性范圍(22～700 pg/mL)。黃盼等[14]采用CLIA法檢測血漿PRC，探討了血漿醛固酮/腎素濃度比值在PA篩查中的診斷價值，為臨床診斷PA提供了參考。文獻(xiàn)指出采用CLIA法較傳統(tǒng)RIA法具有靈敏度高、穩(wěn)定、可重復(fù)性、容易操作等優(yōu)點。CLIA法直接測定PRC，無需進(jìn)行血漿孵育，自動化程度高，可進(jìn)行批量檢測，并且無放射性污染。與PRA檢測相比，用該方法直接測定PRC更加簡單易行，但考慮腎素濃度與腎素活性評價在臨床診斷中的相關(guān)性，此方法目前在國內(nèi)未廣泛開展，仍有待于進(jìn)行較全面的評價，為臨床應(yīng)用提供參考[12]。

4 挑戰(zhàn)與展望

腎素在血漿中含量低，分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且臨床中影響腎素檢測的因素較多，如采樣時間、采樣體位等，因此腎素水平評價屬于較復(fù)雜的檢測項目。目前用于腎素水平評價的兩種方法：PRA檢測及PRC檢測，在檢測結(jié)果相關(guān)性方面，不少研究者對其準(zhǔn)確性、精密度、線性范圍、參考值范圍等檢測性能進(jìn)行了對比，但是由于各實驗室間樣本地區(qū)、數(shù)量、實驗室儀器等存在差異，各項目對比結(jié)果不盡相同。濃度檢測結(jié)果雖不能完全優(yōu)于活性檢測，但是可自動化、不產(chǎn)生放射性污染等顯著優(yōu)勢使其有望替代活性檢測，用于臨床高血壓等相關(guān)疾病的診斷。目前國內(nèi)已有北京、上海、廣州等少量醫(yī)院開展了腎素濃度評價。我國目前仍未開展腎素的全國內(nèi)分泌室間質(zhì)量評價(EQA)計劃，缺少各檢測系統(tǒng)內(nèi)和系統(tǒng)間的基線數(shù)據(jù)。在臨床各方面的推動下，國家衛(wèi)生健康委員會臨床檢驗中心同國家高血壓專病醫(yī)聯(lián)體、高血壓認(rèn)證中心于2019年7月在桂林啟動了腎素醛固酮標(biāo)準(zhǔn)化項目。此項目計劃利用WHO國際標(biāo)準(zhǔn)品作為腎素溯源鏈的頂端，研制具有互通性的參考物質(zhì)，開展腎素一致化計劃，以期改進(jìn)腎素的檢測現(xiàn)狀，實現(xiàn)腎素檢測結(jié)果的互通可比性[15]。