數(shù)字聚合酶鏈反應(dPCR)技術在病原體基因檢測應用中的研究進展

唐月明，伊 潔

（中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科，北京 100730）

在許多感染性疾病中，病原體的量化已經被證明是一項有用的預后指標和監(jiān)測治療反應的重要參考。實時熒光定量多聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR）作為二代核酸檢測方法，已在實驗室被廣泛使用。它通過在反應體系中加入熒光標記的探針來實時檢測熒光信號，借助熒光曲線的循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）和標準曲線來定量起始靶基因的濃度，為相對定量技術。這種方法能有效測定對數(shù)拷貝數(shù)，動態(tài)范圍寬，但由于很多因素都會影響qPCR 的效率，比如在低拷貝靶分子（如病原體本身含量低或者部分患者在檢測前已使用抗生素治療）、復雜模板背景（如大量人基因組會干擾引物和探針的特異度反應、qPCR 抑制物存在）、擴增效率低下（靶基因具有多態(tài)性卻使用統(tǒng)一的探針及引物）、探針保存不當導致部分降解、標準品和標準曲線偏斜等情況下，其Ct值都會受到影響，因此qPCR 的準確度和精密度可能會有很大的差異[1]。除此之外，缺乏絕對定量值來校準標準品，導致qPCR 結果不精密度高及各實驗室之間的可比性差。所以qPCR 作為臨床常規(guī)檢測技術存在不足之處，尤其是在復雜背景下檢測低含量的靶基因時，需要更加敏感和穩(wěn)定的方法檢測。數(shù)字聚合酶鏈反應（digital PCR，dPCR）作為一種新的準確定量技術，在基因的絕對定量檢測中得到廣泛應用，尤其是對微量樣本的絕對定量。

現(xiàn)將dPCR 技術的特點、優(yōu)勢及在病原微生物檢測中的應用綜述如下。

1 dPCR 簡介

1999年VOGELSTEIN 等[2]采用96 孔板對樣本進行了微升級別的PCR 擴增，從而提出了dPCR的概念。隨著技術的進步，dPCR 近年來逐漸興起，成為一種新的分子生物學診斷技術，其將微量樣品作大倍數(shù)稀釋和分液，實現(xiàn)理論上的單分子擴增，然后用終點法PCR 和統(tǒng)計學中的柏松分布原理計算出樣品的原始濃度[1]。

dPCR 根據(jù)樣品分散模式不同分為磁珠模式、微滴模式和芯片模式，后兩者更為常見。其中微滴模式是隨著納米制造技術和微流體技術發(fā)展起來的新模式，也叫微滴式dPCR（droplet digital PCR，ddPCR）。它的原理是微滴發(fā)生器將PCR 反應混合液通過打散并制成數(shù)萬個皮升級大小的油包水液滴后進行PCR 反應，每個微滴中會含有一個或者不包含目標分子，每個微滴內的PCR 反應在相對獨立的環(huán)境里獨自反應，反應完成后，通過對每個微滴進行熒光檢測，含有熒光信號的微滴確定為陽性，不含熒光信號的微滴確定為陰性。對微滴進行計數(shù)，可以準確得出含有目標分子的微滴數(shù)和不含目標分子的微滴數(shù)，同時可以以一維圖或二維圖呈現(xiàn)檢測結果。每微升的目標數(shù)是使用一個包含陽性微滴數(shù)、總微滴數(shù)和微滴體積的公式來計算的[3]。隨著濃度的增加，單個反應體系可能包含2 和/或多個目標模板分子，這時能夠通過泊松分布進行校正，從而計算出樣品中靶分子濃度，實現(xiàn)絕對定量。芯片模式即芯片PCR（chip dPCR，cdPCR），是由物理隔離的腔室組成，在微孔中進行PCR 擴增反應。因此，檢測芯片擴增的熒光可以代表陽性反應和陰性反應的數(shù)量。根據(jù)樣品分布方法不同進一步分為基于微孔的毛細力驅動樣品分散模式、基于通道的樣品分散模式、基于水凝膠珠的樣品分散模式和基于噴墨的樣品分散模式[4]。

2 dPCR 技術的優(yōu)勢

2.1 更高的敏感度和精密度 因為dPCR 將樣本分成若干小PCR 反應分區(qū)，可實現(xiàn)單分子級檢測，避免了模板間的競爭效應，理論上可以提高低豐度目的序列的檢測敏感度，也有實驗證實[5]，dPCR 在測量某些病原體時具有更高的敏感度。由于dPCR較少受到擴增效率的影響，并且采用終點法定量，因此具有更高的精密度和準確性[3,6-7]。

2.2 更高的重復性和通用性 dPCR不依賴標準品，不需要標準曲線，也不依賴熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環(huán)數(shù)，直接計算樣品中目的核酸分子的個數(shù)，可實現(xiàn)絕對定量，重復性和通用性高[8]，因此dPCR 可用于給常規(guī)qPCR 所需的標準品定量，具有計量學意義[6]。

2.3 更高的抗干擾能力和穩(wěn)定性 QUAN 等[9]系統(tǒng)比較了十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate,SDS）、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt,EDTA）及肝素等常見PCR 抑制物對ddPCR 和qPCR 的影響，結果顯示，ddPCR對SDS 和肝素的耐受程度高于qPCR，但是抗EDTA 的表現(xiàn)并不突出。NIXON 等[10]人也發(fā)現(xiàn)cdPCR 對乙醇和血漿抑制作用的敏感性較低，但是對EDTA 依舊敏感。dPCR 耐受能力高的可能原因包括：在ddPCR 中，樣品被分割成許多微小的反應區(qū)，這提高對緩蝕劑的抵抗力[7]；用于生成液滴乳液的油可能將一些抑制物質從水相PCR 反應中分離出來；qPCR 是依賴每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環(huán)數(shù)來進行定量，dPCR 是終點法而不是實時擴增進行定量，因此較少收到樣本中可能存在的抑制物的影響[1]，可以應用在復雜臨床樣本（血液、糞便和組織等）中的病原微生物或其他標志物的檢測[11]，通用性更高。

3 dPCR 技術的應用

3.1 低載量病原微生物的DNA 檢測 優(yōu)越的精密度和敏感度使dPCR 可用于低載量致病微生物的早期檢測及治療的后續(xù)監(jiān)測，提供客觀和量化的判斷閾值。USHIO 等[12]利用dPCR 成功地在肺結核患者的血漿樣本中檢測到結核桿菌DNA，并提出這種微創(chuàng)、快速和準確的循環(huán)檢測結核桿菌 DNA 的方法有可能成為一種新的標準診斷方法，輔助結核早期確診。關于dPCR 檢測人乳頭瘤病毒（human papillomavirus,HPV）相關癌癥患者血清中HPV DNA 的研究表明，可以使用這種高靈敏度的技術進行亞臨床腫瘤腫塊的生物學檢測,例如早期浸潤癌、微小殘留或早期復發(fā)的腫瘤監(jiān)測[13]。STRAIN 等[9]論證并提出dPCR 的高敏感度和精密度有助于測量潛伏中的HIV 病毒進而能夠及時干預，達到早期消除的目的。2013年，PERSAUD 等[14]對1 例感染HIV 的嬰兒從出生后30 h 至18 個月時期進行聯(lián)合抗反轉錄病毒治療，在停止治療后，分別在嬰兒24個月和26 個月的時候，使用ddPCR 檢測嬰兒血液中HIV DNA 水平，檢測發(fā)現(xiàn)嬰兒體內細胞相關的HIV-1 DNA 幾乎完全消失，殘存片段不具備復制能力。2020年，英國學者[15]用ddPCR 等核酸檢測方法對接受了異基因干細胞移植，并且中斷分析治療18 個月的病人進行了HIV-DNA 的檢測，ddPCR 被用來檢測腸道活檢和淋巴結組織的細胞。結果顯示，該病人在各基質中均沒有檢測到具有復制能力的病毒，因此認為這些發(fā)現(xiàn)代表了HIV 患者的治愈?？梢?，dPCR 優(yōu)越的檢測能力在HIV 治療后監(jiān)測中起到了關鍵作用。

關于人巨細胞病毒（human cytomegalovirus,CMV）的研究發(fā)現(xiàn)，CMV 病毒載量從200 copies/ml以下增長到200 copies/ml 以上時患者會出現(xiàn)明顯的癥狀[16]，能夠檢測CMV 載量的微小變化在臨床上具有明顯的意義，因此dPCR 在CMV 的研究領域中被廣泛使用。QUAN 等[9]發(fā)現(xiàn)qPCR 比ddPCR有更高的敏感度，但是該研究中qPCR 和ddPCR 的初始DNA 模板量不等，因此可能導致ddPCR 敏感度下降。在優(yōu)化試驗后發(fā)現(xiàn)，ddPCR 在敏感度相同的情況下，批間精密度和批內精密度都更高，這種優(yōu)勢有利于體內CMV 的持續(xù)檢測[17]。在其他基質中，也有研究者用dPCR 對CMV 進行絕對定量：CAO 等[5]用dPCR 技術對60 例青光眼睫狀體炎綜合征患者的房水進行檢測，發(fā)現(xiàn)27 例CMV 陽性，而qPCR 法僅發(fā)現(xiàn)20 例陽性，二代測序驗證結果與dPCR 檢測結果完全一致，其證明dPCR 的高敏感度更適合用于房水樣本中微量病毒的檢測，可以避免重復的有創(chuàng)操作。dPCR 是近年來在寄生蟲學中應用的一項強有力的技術，在惡性瘧原蟲和日本血吸蟲中顯示出明顯優(yōu)于qPCR 的優(yōu)勢，在無癥狀和低密度感染中，dPCR 可能成為檢測寄生蟲血癥的首選方法[18]。

理想的精密度使得dPCR 可用于測量高拷貝數(shù)和低拷貝數(shù)目標基因的擴增比率。人類皰疹病毒6型（human herpesvirus 6，HHV-6）能夠潛伏感染大多數(shù)成人。在大約1% 的人群中，HHV-6 能夠整合在人類染色體上（chromosomally integrated human herpesvirus 6，ciHHV-6），并通過生殖系統(tǒng)傳播。在檢測活動性HHV-6 感染時，遺傳了ciHHV-6 的患者經常被誤診產生不必要的治療和副作用。SEDLAK 等[19]運用dPCR 通過精確測定HHV-6 和人DNA 的比率來快速準確地鑒定ciHHV-6 的方法。遺傳了ciHHV-6 的個體HHV -6/人細胞比例為1:1。在造血細胞移植的背景下對這些人進行識別有助于解釋HHV-6 檢測的陽性結果，并可能避免使用抗病毒藥物進行不必要的治療。該團隊還在隨后的研究中建立了新的dPCR 方法能夠識別是哪一種亞類-HHV-6A 或者HHV-6B。

3.2 低載量病原微生物的RNA 檢測 dPCR 也被用于RNA 的定量檢測。乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV) RNA 是一種反映共價封閉環(huán)狀DNA活性的新標記。然而，檢測HBV RNA 的方法一直是一個技術挑戰(zhàn)。LIMOTHAI 等[20]人比較了逆轉錄ddPCR（reverse transcriptase droplet digital PCR,RT-ddPCR）和逆轉錄qPCR（reverse transcriptase quantitative real-time PCR,RT-qPCR）對不同治療階段的慢性乙肝患者血清的HBV RNA 檢測，結果顯示RT-ddPCR 在所有濃度的 RNA 定量一致性方面均優(yōu)于RT-qPCR，可以提高血清RNA 的檢測敏感度，成為HBV RNA 定量的最佳方法。dPCR 也被用于檢測細菌核糖體RNA，結合測序技術，對危重病人肺微生物群進行定量和表征，輔助分析危重病人預后與入院時肺微生物群特征的關系[21]。在2020年造成全國緊急公共衛(wèi)生事件的新型冠狀病毒-2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，Sars-Cov-2）的檢測中，ddPCR 展現(xiàn)出其在低載量病毒檢測中的優(yōu)越性。LIU 等[22]人建立了ddPCR的臨界值，為40 copies/ml，顯著低于目前常用qPCR 的檢測下限（1 000,500 copies/ml 等）。同時實驗證明，ddPCR 對確診病人的拭子檢出陽性率高于qPCR[23]，在qPCR 陰性的出院患者樣本中仍檢測出了Sars-Cov-2 的存在[22,24]，表明ddPCR 有助于減少假陰性結果的發(fā)生，降低了病毒傳播的潛在風險。此外，ddPCR 可以報告病毒載量的具體數(shù)值，可用于動態(tài)監(jiān)測患者的SARS-CoV-2 病毒載量，利于病毒載量與預后關系的研究。

3.3 基因多態(tài)性的檢測 dPCR 不僅可以對低載量病毒絕對定量，還可在200 000 個野生型病毒中定性檢測出變異病毒，檢測限達0.005%，而qPCR 和焦磷酸測序法只能檢測高于10%的突變基因[25]。由于基因組的高度多樣性，引物或探針的不匹配可能會降低擴增或探針水解的效率，在這種情況下，qPCR 可能大大低估了真實的模板拷貝數(shù)，利用病原體DNA 序列數(shù)據(jù)定制患者特異性引物和探針可以解決此問題，但是該方法繁瑣，可行性差。dPCR 由于不依賴于擴增效率，而擴增效率會受到引物或探針結合區(qū)序列失配的影響，因此，dPCR比qPCR 具有更高的準確性，可用于基因組多態(tài)性的突變檢測，包括稀有突變、單堿基突變及拷貝數(shù)的變異。已報道的利用dPCR 技術定性檢測序列多樣性高的病原體包括結核桿菌[12]、BK 病毒（BK virus,BKV）[26]、JC 病毒（JC virus,JCV）[27]等。在此基礎上利用dPCR 檢測變異的耐藥菌株，對用藥的療程管理和療效預測有十分重要的意義。利用dPCR 已能成功區(qū)分對甲氧西林耐受或者敏感的金黃色葡萄球菌[28]。ABRAM 等[29]人證明dPCR 技術可以直接從全血中識別攜帶特定耐藥基因的病原體并且具有100% 的敏感度和特異度。

3.4 標準品絕對定量值的建立 美國國家標準與技術研究所采用dPCR 對CMV 進行了絕對拷貝數(shù)的測量，這也是第一次采用dPCR 建立標準,并根據(jù)精確確定的已知擴增DNA 分子數(shù)來進行不同實驗室的方法校準驗證和質量控制[30]。此后dPCR 陸續(xù)被用于CMV 的qPCR 標準品的定值[31]。dPCR 在對WHO 國際標準物質的拷貝數(shù)異質性鑒定中也起到了一定作用。例如，由于T 抗原等區(qū)域的大范圍不同缺失，導致多瘤病毒基因組不同位點之間拷貝數(shù)顯著差異，會導致定量結果顯著不同，利用dPCR對WHO 關于BKV 和JCV 的國際標準進行測定發(fā)現(xiàn)定量結果可相差8 倍，這一發(fā)現(xiàn)經下一代測序證實是由于該國際標準中存在多個病毒亞群[26-27]。

3.5 不同基質中病原微生物的檢測 dPCR 具有比qPCR 更高的抗干擾能力和穩(wěn)定性，對不同基質的抑制作用更強，在糞便組織檢測幽門螺桿菌[32]、石蠟包埋組織檢測HBV[11]中表現(xiàn)出優(yōu)越的靈敏度和特異度，在鼻咽拭子、痰液、尿液、精液等其他基質中也有應用[5,23,33-34]，便于研究者對致病微生物進行研究，能夠幫助病人獲得早期診斷。

3.6 其他新興應用

3.6.1 多重dPCR 檢測:ddPCR 實現(xiàn)了CMV，人腺病毒（human adenovirus,ADV）的多重DNA 檢測，并對糞便中兩種病毒進行了分析，靈敏度均高于同時進行檢測的qPCR，保證了易受抑制的臨床標本的準確測定，防止了假陰性[11]。

3.6.2 為高通量測序技術提供靈敏校準:DING 等[35]使用dPCR 精確定量測序模板，使測序文庫在沒有預擴增的前提下對樣品需求體積減少了1 000 倍以上至皮克級，同時消除了構建標準曲線帶來的不確定性，最大限度的減少了偏倚，成功地對低于納克級的細菌和哺乳動物的DNA 樣品進行了測序。EASTBURN 等[36]人引入了微流控液滴富集技術，將5 個不同基因組位點的靶基因富集了31.6 倍，應用dPCR 技術實現(xiàn)了測序文庫的絕對定量，且大大降低了樣本用量、測序成本和時間。將下一代測序方法與dPCR 聯(lián)合使用可被視為未來病毒學領域應用的發(fā)展趨勢,能夠更全面識別目標基因座內的遺傳多態(tài)性。

3.6.3 免除核酸提取，減少工作流程:PAVSIC等[31]分別用兩個不同的dPCR 平臺（Bio-Rad 和Biomark）分別對病毒DNA 進行免提取及提取后dPCR 定量分析，結果表明兩種平臺的免提取方法測得濃度與實際病毒載量更接近。這是第一份免DNA 提取進行dPCR 直接定量的研究。免DNA 提取進行病原微生物定量將大大減少工作流程，提高工作效率，節(jié)省臨床周轉時間，但是仍然需要對其他病毒、參考物質和臨床相關基質進行驗證。在此基礎上，ddPCR 也被用于直接從全血樣本中進行細菌鑒定和抗生素敏感性分析，為血液感染和抗生素耐藥早期指導和適當治療提供快速診斷[29]。

3.6.4 與多種擴增技術整合:將數(shù)字技術同其他擴增技術整合的模式比如數(shù)字環(huán)介導等溫擴增技術（digital loop-mediated isothermal amplification,dLAMP）和數(shù)字重組酶聚合酶擴增技術（digital recombinase polymerase amplification,dRPA） 也有報道。dLAMP 易于組裝和操作的特點，可以在沒有預處理設備、輔助儀器或控制系統(tǒng)的情況下形成堅固的液滴。研究者利用dLAMP 定量HPV[37]，發(fā)現(xiàn)雖然敏感度低于dPCR，但其定量性能及抗抑制劑性能均優(yōu)于qLAMP，后者無法對1 000 copies/ml以下的核酸進行定量[10]。而GORGANNEZHAD 等[38]人描述的一種微流控dRPA SlipChip 是利用RPA替代dPCR 所需要的溫度循環(huán)，通過在每個反應室中添加一個化學引發(fā)劑，只需簡單的滑動步驟，即可同時引發(fā)1 000 多個納升規(guī)模的RPA 反應。經過驗證，該模式與相同SlipChip 基礎上的dPCR 性能相當。

4 小結與展望

dPCR 雖具有更高的敏感度、重復性和穩(wěn)定性，也已在相應領域獲得了應用，但是該技術在未來能否廣泛應用仍具有許多挑戰(zhàn)。

4.1 通量低 qPCR 可同時檢測96 個樣本甚至更多，但是cdPCR 的每張芯片上最多分析48 個樣品，ddPCR 則更少，因此應增加檢測通量，以降低臨床周轉時間。

4.2 靈敏度需提高 增加單樣本反應分區(qū)數(shù)和熒光通道數(shù)量或改進熒光編碼的方法，可以進一步提升檢測靈敏度甚至同時檢測多種靶標。

4.3 檢測范圍受限 由于dPCR 需要單分子級檢測，在不同濃度下需要不同的稀釋方法，尤其是高濃度下增加稀釋分區(qū)以確保儀器不飽和。

4.4 RNA 定量易受影響 雖然dPCR 被廣為應用于核酸的檢測，其在RNA 定量檢測領域仍是需要不斷發(fā)展的，目前看仍然是依賴于轉錄效率和檢測效率的。在進行RNA 定量時，由于逆轉錄酶和引物等因素影響，導致逆轉錄過程不完整，使得cDNA 與原始RNA 拷貝數(shù)目不一致；或者由于分子丟失效應，比如在反應孔中同時添加逆轉錄反應體系和cDNA 擴增體系，擴增體系受到抑制，導致不是所有模板都被擴增，因此對RNA 定量不準確。

4.5 價格昂貴 dPCR 未來應降低成本以解決因實驗成本昂貴而無法普及的現(xiàn)狀。

4.6 不同廠家間結果互通性仍需提高 雖然dPCR是絕對定量，但是不同廠家使用的不同試劑和平臺檢測結果仍然不一致，已有研究者采用三套PCR試劑和兩個dPCR 平臺進行CMV DNA 的檢測，發(fā)現(xiàn)結果存在差異[39]，對檢測到的假陽性信號，值得進一步研究。

綜上所述，雖然dPCR 技術在達到普遍應用的道路上仍然存在許多不足與挑戰(zhàn)，但是其不需要標準曲線，以絕對定量的優(yōu)勢，對低拷貝核酸，尤其是缺乏標準品的病原體的檢測和定量提供了一種新的發(fā)展方向，dPCR 技術的進一步發(fā)展也會更利于病原體的診斷、治療及耐藥分析監(jiān)測等。但其檢測結果特別是極低檢測下限在臨床中的實際應用價值尚需進一步通過更多的研究證明。