基于全鏈條的回收PET材料中非揮發(fā)性可遷移物的非靶向篩查及特征風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物的確定

楊 頡，馬 鑫，楊道遠(yuǎn)，隋海霞*，杜振霞*

（1．北京化工大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，北京 100029；2．國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，北京 100022）

聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（Polyethylene terephthalate，PET）因具有出色的阻隔性能而被廣泛用于礦泉水瓶、塑料茶包、餐盒餐具及食品包裝袋等[1－4]。近年來，塑料制品的一次性使用造成的持久性環(huán)境污染問題愈加嚴(yán)重，目前世界各國(guó)加強(qiáng)對(duì)塑料制品的管控以減少污染，同時(shí)通過回收利用使廢棄塑料轉(zhuǎn)化為有價(jià)值的新產(chǎn)品[5]。PET在自然條件下很難降解，從廢棄PET包裝材料變?yōu)樵偕鶳ET包裝材料包括粉碎、漂洗、烘干、造粒和融熔加工等步驟[6]?；厥誔ET（rPET）是否可再用作食品包裝材料有待進(jìn)一步研究。

研究表明，隨著rPET在原材料中添加比例的提高，rPET材料的總遷移量呈線性上升趨勢(shì)，當(dāng)rPET添加比例超過50%時(shí)總遷移量達(dá)到最大值，為原生PET材料總遷移量的5．6倍[7]。rPET中污染物來源為：一是消費(fèi)后PET制品原先盛裝的內(nèi)容物中水楊酸甲酯等小分子遷移進(jìn)入PET[8]；二是PET在回收加工過程中引入的污染物以及由材料本身和添加劑降解產(chǎn)生的污染物[9]。

本研究首先采用溶解沉淀法提取碎片、粒料、瓶坯、瓶子4種不同生產(chǎn)階段rPET產(chǎn)品中的非揮發(fā)性小分子潛在遷移物，并根據(jù)法規(guī)探究rPET瓶子在6種食物模擬液中的遷移情況，結(jié)合超高效液相色譜－四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC－Q－TOF MS）篩查rPET產(chǎn)品中潛在遷移物及模擬液中遷移物，通過MS－DIAL（Mass spectrometry－data independent analysis software）軟件對(duì)不同生產(chǎn)階段的rPET產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)志物的快速篩選，確定各個(gè)階段的風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物。最后，通過TEST（Toxicity estimation software tool）軟件預(yù)測(cè)潛在遷移物及遷移物的大鼠經(jīng)口急性毒性、發(fā)育毒性和致突變性，使用Toxtree軟件對(duì)潛在遷移物及遷移物進(jìn)行Cramer分級(jí)，并對(duì)潛在遷移物及遷移物進(jìn)行危害評(píng)估。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜－四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（UPLC－Q－TOF MS）：Waters Xevos G2－S QTOF（美國(guó)Waters公司），配有 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm ×2．1 mm，1．7μm）；KH－100DE型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；SHA－BA型水浴恒溫振蕩器（華普達(dá)儀器有限公司）；MTN－2800D型氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；GP225D型電子天平（Sartorius公司）；Milli－Q A10超純水器（美國(guó)Millipore公司）；0．22μm PTFE有機(jī)濾膜（津騰公司）。

1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇（HFIP，阿拉丁公司）；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher Chemical公司）；甲酸（純度>98%，ACROS公司）；乙醇（分析純，阿拉丁公司）；乙酸（分析純，北京化工廠）。超純水由Milli－Q A10超純水器制備；基于供應(yīng)鏈的碎片、粒料、瓶坯、瓶子4種不同生產(chǎn)階段的rPET產(chǎn)品由供應(yīng)商提供。

1.2 色譜與質(zhì)譜條件

液相色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2．1 mm，1．7μm）；流動(dòng)相：0．1%甲酸水溶液（A）－甲醇（B）；梯度洗脫條件：0～6 min，97%～0%A；6～10 min，0%A；10～10．5 min，0%～97%A；10．5～12 min，97%A；進(jìn)樣量：1μL；流速：0．3 mL/min；柱溫：35℃。

質(zhì)譜條件：檢測(cè)模式為MSE；電離模式為ESI+和ESI－；毛細(xì)管電壓為2．5 kV；錐孔電壓為30 kV（ESI+）、40 kV（ESI－）；離子源溫度為120℃；脫溶劑氣溫度為450℃；脫溶劑氣流速為1 000 L/h；錐孔氣流速為50 L/h；低能通道碰撞能為4 eV；高能通道碰撞能為20～40 eV；掃描范圍為m/z50～1 200；采用亮氨酸腦啡肽實(shí)時(shí)校正質(zhì)量軸：556．2 766（ESI+），554．2 620（ESI－），每30 s切換1次進(jìn)行質(zhì)量數(shù)的校正。

1.3 溶解沉淀實(shí)驗(yàn)

在玻璃離心管中分別稱取0．2 g 4種不同生產(chǎn)階段的rPET產(chǎn)品，加入2 mL HFIP溶解聚合物。40℃下靜置24 h，待聚合物溶解完全，加入4 mL甲醇并超聲1 h使聚合物完全沉淀。隨后，將混合物以3 000 r/min離心10 min，取上清液，并用1 mL甲醇洗滌殘留的聚合物沉淀，合并上清液。在溫和氮?dú)饬飨聦⑸锨逡捍抵两?，并? mL甲醇復(fù)溶后，經(jīng)0．22μm PTFE針式濾器過濾，得到待測(cè)樣品。每種樣品設(shè)置2個(gè)平行，并分析相同程序的空白樣品。

1.4 遷移試驗(yàn)

遷移試驗(yàn)參照歐盟No．10/2011[10]及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 31604．1－2015法規(guī)[11]進(jìn)行。參考rPET制品的預(yù)期用途，選取10%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇、3%乙酸、4%乙酸、20%乙醇、50%乙醇及95%乙醇食物模擬物，分別取10 cm2rPET瓶片放入盛有10 mL食物模擬物的玻璃離心管中。根據(jù)rPET預(yù)期接觸的最長(zhǎng)時(shí)間并利用歐盟推薦的加速實(shí)驗(yàn)采用60℃水浴加熱10 d作為遷移測(cè)試條件。將上述條件下得到的溶液于溫和氮?dú)饬飨麓蹈桑? mL甲醇復(fù)溶后經(jīng)0．22μm PTFE針式濾器過濾，每個(gè)樣品設(shè)置2個(gè)平行，并分析相同流程的空白。

1.5 非靶向篩查流程

使用UNIFI軟件對(duì)潛在遷移物進(jìn)行非靶向篩查。UNIFI科學(xué)信息系統(tǒng)是沃特世公司開發(fā)的一款可對(duì)液相色譜與高分辨質(zhì)譜聯(lián)用數(shù)據(jù)進(jìn)行采集、處理、瀏覽、報(bào)告生成等操作的軟件。Q－TOF MSE采集模式能在一次進(jìn)樣下通過低能通道與高能通道分別得到物質(zhì)的準(zhǔn)分子離子峰及碎片信息。通過對(duì)比樣品與空白的色譜峰及質(zhì)譜響應(yīng)，判斷物質(zhì)碎片信息來識(shí)別潛在遷移物，未知物的鑒定流程如圖1所示。

圖1 未知遷移物的鑒定流程Fig．1 Flow chart for identification of unknown migrants

1.6 MS－DIAL標(biāo)志物篩選

通過MS－DIAL對(duì)不同生產(chǎn)階段的rPET產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)志物的快速篩選，以進(jìn)一步確定各階段的風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)。MS－DIAL是一款針對(duì)非靶向代謝組學(xué)的分析軟件，可快速篩選標(biāo)志物。軟件設(shè)置如下：根據(jù)儀器類型選擇數(shù)據(jù)類型為“Centroid data”，離子模式為正離子。通過ABF Converter軟件將液質(zhì)聯(lián)用的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為．ABF格式，樣品文件批量導(dǎo)入軟件中，并設(shè)置相應(yīng)的樣品類型、分類ID、分析順序、進(jìn)樣量（μL）信息。數(shù)據(jù)收集選項(xiàng)卡設(shè)置MS1的容差值為0．01 Da，MS2的容差值為0．05 Da，設(shè)置保留時(shí)間段為0～10 min，MS1和MS2的質(zhì)量數(shù)分析范圍為50～1 200 Da。最大電荷數(shù)為2，多線程數(shù)為2。為篩選不同生產(chǎn)階段rPET產(chǎn)品的標(biāo)志物，設(shè)置最小峰高為5 000，峰寬閾值為0．1。使用平滑方法可準(zhǔn)確確定峰的左邊緣與右邊緣，分別設(shè)置平滑等級(jí)為3，最小峰寬為5。對(duì)于正離子模式，選擇加合離子為[+H]+、[+Na]+、[+K]+和[+NH4]+。

2 結(jié)果與討論

2.1 rPET瓶中潛在遷移物及遷移物的非靶向篩查

通過UPLC－Q－TOF MS分析了溶解沉淀處理后不同生產(chǎn)階段的rPET樣品及6種食物模擬物遷移樣品的潛在遷移物和遷移物。圖2顯示了不同生產(chǎn)階段rPET中潛在遷移物的總離子流色譜圖。在4種樣品及6組遷移實(shí)驗(yàn)中共鑒定出包括有意添加物和非有意添加物在內(nèi)的30種化合物（見表1）。

圖2 不同生產(chǎn)階段rPET中潛在遷移物的色譜圖Fig．2 Chromatograms of potential migrants in rPET at different production stages

表1 鑒定的潛在遷移物和遷移物Table 1 Identified migrants and potential migrants

（續(xù)表1）

4種不同生產(chǎn)階段rPET溶解沉淀樣品的非靶向篩查結(jié)果表明，在碎片、粒料、瓶坯、瓶子中均篩查出PET寡聚體、潤(rùn)滑劑等物質(zhì)。在瓶坯樣品中檢出的PET寡聚體種類最多，其次是瓶子和碎片樣品，在粒料樣品中檢測(cè)的PET寡聚體種類最少，可能是粒料被加工為瓶坯的過程中產(chǎn)生了新的PET寡聚體（見表1）。通過了解廠商整個(gè)rPET的回收加工過程，從粒料到瓶坯需經(jīng)過300℃左右的高溫注塑，因此，推測(cè)在此過程中高溫導(dǎo)致PET發(fā)生降解，從而使瓶胚中的寡聚體種類增加。

潤(rùn)滑劑在聚合物加工中可提高加工速度，降低聚合物與加工機(jī)械表面摩擦，減少能耗，提高產(chǎn)品質(zhì)量。在4種生產(chǎn)階段的產(chǎn)品中均檢出脂肪酸酰胺類潤(rùn)滑劑：硬脂酸酰胺、芥酸酰胺和二十酰胺，均為常見的聚合物潤(rùn)滑劑且均被列入歐盟聚合物添加劑的準(zhǔn)許清單[10]。在粒料和瓶胚中檢出的9，10-二羥基硬脂酸甲酯也是被歐盟批準(zhǔn)使用的一種潤(rùn)滑劑[10]。此外，粒料、瓶坯、瓶子中檢測(cè)到碎片中未檢出的潤(rùn)滑劑十八烯酰胺、十六酰胺及二十烯酰胺，表明在rPET碎片到粒料加工過程中可能添加了潤(rùn)滑劑。

此外，碎片中檢出非離子表面活性劑脂肪醇聚氧乙烯醚CxH2x+1－O－（CH2CH2O）n－H（x=12，n=2～11；x=14，n=2～9），其用作漂洗劑而在回收清洗過程中被引入?；厥誔ET碎片需去除表面污染物，經(jīng)過一系列清洗過程后才能用于生產(chǎn)粒料，漂洗劑為清洗階段的殘留。

2.2 MS－DIAL對(duì)不同生產(chǎn)階段rPET產(chǎn)品標(biāo)志物的快速篩選

采用MS－DIAL對(duì)不同生產(chǎn)階段rPET產(chǎn)品標(biāo)志物進(jìn)行快速篩選。樣品中所有物質(zhì)均在散點(diǎn)圖中顯示，圖中點(diǎn)的顏色代表不同色譜峰高度，其中紅色為較高色譜峰，藍(lán)色為較低色譜峰。MS－DIAL界面中柱狀圖為散點(diǎn)圖中某一點(diǎn)在各樣品中的色譜峰高度。脂肪醇聚氧乙烯醚的鑒定如圖3所示，圖3中柱狀圖部分1、2、3、4、5分別代表空白、碎片、粒料、瓶胚、瓶子，保留時(shí)間為7．01 min與7．31 min的一系列散點(diǎn)分別為C12H25－O－（CH2CH2O）n－H（n=2～11）、C14H29－O－（CH2CH2O）n－H（n=2～9）。通過對(duì)比峰高發(fā)現(xiàn)，只有rPET碎片樣品存在這兩種物質(zhì)，故這兩種物質(zhì)為碎片樣品的標(biāo)志物。

圖3 不同標(biāo)志物在MS－DIAL中的識(shí)別Fig．3 Recognition of different markers in MS－DIAL

限定p值<0．05篩選標(biāo)志物，定義在所有樣品中色譜峰最高或最低為標(biāo)志物，最終在所有樣品中篩選出7個(gè)標(biāo)志物，如表2所示。

表2 確定的標(biāo)志物Table 2 Identified markers

通過MS－DIAL分析進(jìn)一步確定了全鏈條中不同回收生產(chǎn)階段的風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物。碎片中風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物為脂肪醇聚氧乙烯醚，而后續(xù)階段篩查中未檢出該漂洗劑，其僅在碎片中被發(fā)現(xiàn)，說明經(jīng)歷全鏈條過程后漂洗劑被去除。粒料中風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物9，10-二羥基甲基酯硬脂酸為潤(rùn)滑劑，塑料制品加工工藝擠出成型步驟需添加潤(rùn)滑劑。推測(cè)在碎片加工為粒料過程中加入了新的潤(rùn)滑劑。瓶坯中風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物為PET線性寡聚體，粒料到瓶坯的高溫注塑過程中寡聚體為主要風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物，可能由于高溫加工過程導(dǎo)致PET材料熱降解，產(chǎn)生更多的PET寡聚體。綜合分析結(jié)果，回收PET中最需要關(guān)注的風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物為PET寡聚體及潤(rùn)滑劑。

2.3 全鏈條中PET寡聚體及潤(rùn)滑劑的相對(duì)含量對(duì)比分析

對(duì)需要關(guān)注的PET寡聚體及潤(rùn)滑劑的相對(duì)含量進(jìn)行對(duì)比分析。潛在遷移物及遷移物中大部分為PET寡聚體，包括11種環(huán)狀寡聚體和7種線性寡聚體。寡聚體的色譜峰面積如圖4所示。PET寡聚體結(jié)構(gòu)相似，其在質(zhì)譜中響應(yīng)差別較小，因此本文使用PET寡聚體的峰面積表示其相對(duì)含量。所有樣品中相對(duì)含量最高的環(huán)狀寡聚體為第二系列環(huán)狀二聚體TPA2－EG－DEG，線性寡聚體為第一系列線性二聚體（TPA－EG）2+H2O。環(huán)狀寡聚體的相對(duì)含量高于線性寡聚體，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，這是由于PET合成過程中在形成環(huán)狀寡聚體及線性寡聚體之間存在熱力學(xué)平衡，而小分子量的環(huán)狀寡聚體更容易生成[12－13]?？梢钥闯鲈诨厥誔ET全鏈條中，大部分PET寡聚體的相對(duì)含量增加，PET回收過程導(dǎo)致PET寡聚體增多。

圖4 對(duì)全鏈條不同生產(chǎn)階段中PET寡聚體的相對(duì)含量對(duì)比分析Fig．4 Comparative analysis of PET oligomers contents in different production stages in the whole chain

不同生產(chǎn)階段中潤(rùn)滑劑的相對(duì)含量對(duì)比分析如圖5所示。潤(rùn)滑劑的相對(duì)含量從碎片到瓶子的過程中有不同程度的增加。粒料中檢出3種碎片樣品未檢出的潤(rùn)滑劑，推測(cè)從碎片到粒料的擠出加工過程中加入了潤(rùn)滑劑，以降低加工時(shí)的摩擦力，提高流動(dòng)性和加工效率?；厥占庸み^程造成PET材料中潤(rùn)滑劑相對(duì)含量及種類的增加。

圖5 對(duì)全鏈條不同生產(chǎn)階段中潤(rùn)滑劑的相對(duì)含量對(duì)比分析Fig．5 Comparative analysis of lubricants contents in dif?ferent production stages in the whole chain

2.4 潛在遷移物及遷移物的危害評(píng)估

TEST軟件是由美國(guó)環(huán)境保護(hù)署開發(fā)的毒性評(píng)估軟件，基于定量結(jié)構(gòu)活性關(guān)系（QSAR）原理評(píng)估化學(xué)品毒性。其包含幾種QSAR方法，如分層方法、小組貢獻(xiàn)法、單模型方法等，可對(duì)已知結(jié)構(gòu)遷移物的急性毒性、發(fā)育毒性等不同毒性終點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。使用TEST（v 5．1．1）軟件對(duì)潛在遷移物及遷移物的LD50、發(fā)育毒性和致突變性進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)方法為共識(shí)法，該法是在適用范圍內(nèi)通過對(duì)分層方法、單模型方法、小組貢獻(xiàn)法和臨近值法的預(yù)測(cè)毒性取平均值得到預(yù)測(cè)值，對(duì)于已有動(dòng)物試驗(yàn)的遷移物，其LD50值取實(shí)驗(yàn)值（見表3）。

表3 潛在遷移物和遷移物的危害評(píng)估Table 3 Hazard assessment of potential migrants and migrants

（續(xù)表3）

Cramer規(guī)則由Cramer等[14]提出，該規(guī)則基于化合物毒性與其結(jié)構(gòu)相關(guān)的假設(shè)，可通過Cramer決策樹將化合物分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3類。其中Ⅰ級(jí)化合物具有較低的經(jīng)口毒性，Ⅲ級(jí)化合物具有顯著毒性，Ⅱ級(jí)化合物的毒性則介于兩者之間。對(duì)不屬于DNA反應(yīng)性致突變物和/或致癌物的潛在遷移物，用Toxtree（v3．1．0）軟件對(duì)潛在遷移物及遷移物進(jìn)行Cramer分級(jí)，如表3所示。

TEST軟件分析發(fā)現(xiàn)，所有潛在遷移物和遷移物的致突變性均為陰性，即均不屬于DNA反應(yīng)性致突變物和/或致癌物。而大部分酰胺類潤(rùn)滑劑和PET寡聚體存在發(fā)育毒性，可能會(huì)對(duì)子代發(fā)育過程產(chǎn)生不良影響。使用Toxtree軟件對(duì)潛在遷移物和遷移物進(jìn)行Cramer分級(jí)，PET線性寡聚體均被分為Cramer Ⅰ級(jí)，PET環(huán)狀寡聚體和酰胺類潤(rùn)滑劑均為Cramer Ⅲ級(jí)。表明PET環(huán)狀寡聚體和酰胺類潤(rùn)滑劑的毒性高于PET線性寡聚體，需要重點(diǎn)關(guān)注。

3 結(jié) 論

本文通過UPLC－Q－TOF MS對(duì)回收PET全鏈條中碎片、粒料、瓶坯、瓶子4種階段樣品進(jìn)行了非靶向篩查，分析溶解沉淀法得到的不同階段樣品和歐盟及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)推薦的6種食物模擬物對(duì)rPET瓶進(jìn)行的遷移測(cè)試樣品，共提取出30種潛在遷移物和遷移物，主要為PET寡聚體和酰胺類潤(rùn)滑劑。在碎片樣品中檢出清潔過程引入的漂洗劑，發(fā)現(xiàn)在回收加工中高溫導(dǎo)致PET寡聚體的增加。利用MS－DIAL進(jìn)一步確定全鏈條各個(gè)階段的風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)，篩選出7種標(biāo)志物。最后利用TEST和Toxtree軟件對(duì)遷移物進(jìn)行危害評(píng)估，結(jié)果表明部分物質(zhì)的發(fā)育毒性為陽性，PET環(huán)狀寡聚體和酰胺類潤(rùn)滑劑均為Cramer Ⅲ級(jí)物質(zhì)，需在回收PET全鏈條生產(chǎn)過程中引起關(guān)注。下一步需要結(jié)合遷移水平開展暴露評(píng)估，并進(jìn)行最終的風(fēng)險(xiǎn)表征，為rPET是否能夠用于生產(chǎn)食品接觸材料及制品提供科學(xué)依據(jù)。