POLQ對SACC-83細(xì)胞的影響及POLQ基因表達(dá)調(diào)控因子預(yù)測

白晗 劉涵 朱蕾 劉超 李楠 肖晶

唾液腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma， SACC)具有高復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移傾向的特點(diǎn)，患者遠(yuǎn)期生存率低，無有效治療措施[1-3]。因此，闡明SACC發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)分子機(jī)制，對于優(yōu)化SACC治療策略具有重要意義。

POLQ(polymerase theta)基因高表達(dá)于特定的正常組織及多種腫瘤組織中，主要參與alt-NHEJ(alternative non-homologous end joining)修復(fù)通路[4-6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PTEN(homologue deleted on chromosome 10)低表達(dá)的SACC中POLQ高表達(dá)，POLQ與SACC惡性程度及較差的預(yù)后正相關(guān)，且PTEN與POLQ無直接相互作用，表明POLQ是受PTEN間接調(diào)控的促癌因子，但調(diào)控機(jī)制尚不明確。

本研究分析了POLQ在腫瘤及正常組織中的差異表達(dá)，探討了POLQ作為SACC治療靶點(diǎn)的可能性，并初步探究POLQ異常高表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，提出治療SACC的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 基因表達(dá)分析

利用TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(http://timer.comp-genomics.org/)，評估腫瘤樣本和同位正常組織中POLQ表達(dá)量的差異。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SACC-83細(xì)胞系應(yīng)用含10%胎牛血清(Gibco，10099-141, 美國)及1%雙抗(Gibco，15140122)的1640培養(yǎng)基(Gibco，C11875500BT)于恒溫37 ℃、 5% CO2、相對濕度95%以上的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 每48 h換液一次。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

細(xì)胞接種于6 孔板貼壁后按照Lipofectamine?3000(Invitrogen，L3000015，美國)說明書配制并加入轉(zhuǎn)染試劑，6 h后換液。shRNA及siRNA由上海吉瑪公司合成，序列為：對照組shControl(5′-CACCGTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3′)、POLQ干擾組shPOLQ(5′-CACCGGATATATTTCCTGTCCAAGATTCAAGAGATCTTGGACAGGAAATATATCCTTTTTTG-3′)、PTEN干擾組siPTEN(5′-GAUCUUGACAAAGCAAAUATT-3′)以及對照組siControl(5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)。

1.4 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染24 h的細(xì)胞消化后接種于96 孔板， 5 000 個/孔，培養(yǎng)1～6 d后，棄培養(yǎng)基，加入CCK-8(北京全式金生物，F(xiàn)C101)10 μL和含10% FBS的培養(yǎng)基100 μL，培養(yǎng)2 h，檢測450 nm的吸光度值。

1.5 平板克隆實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染24 h后常規(guī)消化，以5 000 個/孔接種于6 孔板常規(guī)培養(yǎng)，直至肉眼可見克隆后，棄培養(yǎng)基，用預(yù)冷無水乙醇4 ℃固定30 min，洗滌后用0.1%結(jié)晶紫(索萊寶，G1063)靜置染色30 min，雙蒸水清洗至細(xì)胞克隆清晰可見后，拍照呈像。

1.6 qRT-PCR

轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞，用Trizol法(Takara，9109，日本)提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄(Takara，RR047A)，并擴(kuò)增(Takara，RR820A)所得cDNA(95 ℃ 30 s→95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s， 循環(huán)40 次)。引物由Takara公司合成，序列見表 1。

表 1 qRT-PCR引物序列

1.7 啟動子及轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

應(yīng)用Cistrome數(shù)據(jù)庫(http://dbtoolkit.cistrome.org/)預(yù)測與POLQ啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，AnimalTFDB3.0數(shù)據(jù)庫(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB/#!/)預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子的特異性結(jié)合位點(diǎn)，TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(http://timer.comp-genomics.org/)分析蛋白表達(dá)相關(guān)性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 POLQ在腫瘤中的表達(dá)

TIMER2.0分析結(jié)果顯示，與正常組織相比，POLQ在包括頭頸部腫瘤(head and neck squamous cell carcinoma, HNSC，P=6.25e-19)在內(nèi)的19 種腫瘤中呈較高水平表達(dá)，僅在部分乳腺浸潤癌(breast invasive carcinoma, BRCA)腫瘤亞型中無明顯變化及在皮膚黑色素瘤(skin cutaneous melanoma, SKCM)中下調(diào)，提示POLQ高表達(dá)是促進(jìn)大多數(shù)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素(圖 1)。

圖 1 TIMER2.0分析腫瘤與正常組織之間的POLQ差異表達(dá)

2.2 POLQ干擾對SACC-83細(xì)胞增殖及克隆形成能力的影響

本課題通過研究靶向抑制POLQ對SACC-83細(xì)胞的影響，探討POLQ作為治療SACC新靶點(diǎn)的可能性。CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組SACC-83細(xì)胞相比，POLQ干擾組SACC-83細(xì)胞增殖能力被抑制。兩組細(xì)胞生長曲線隨培養(yǎng)時(shí)間延長而呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，但與對照組相比，POLQ干擾組的生長曲線上升相對平緩(圖2A)。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組及POLQ干擾組克隆形成數(shù)目分別為133.33±27.78及48.00±9.80個。與對照組相比，POLQ干擾組形成的克隆數(shù)目降低(圖 2B)。

圖 2 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測POLQ干擾對SACC-83細(xì)胞增殖(A)及克隆形成能力(B)的影響

2.3 生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)合POLQ啟動子的轉(zhuǎn)錄因子及 FOXM1靶向結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測

用Cistrome數(shù)據(jù)庫Toolkit模塊預(yù)測出的可能性最大的前20 個轉(zhuǎn)錄因子中(http://dbtoolkit.cistrome.org/?specie=hg38&factor=tf&interval=Chr3%3A121545889-121547988#plot_result)，僅FOXM1(forkhead box M1)既受PTEN負(fù)調(diào)控，又與DNA修復(fù)相關(guān)，且POLQ基因啟動子上有5 個FOXM1結(jié)合位點(diǎn)(圖 3A)。用AnimalTFDB3.0預(yù)測出FOXM1在靶基因啟動子上的特異性結(jié)合位點(diǎn)長度為13 bp，特異性結(jié)合序列為A/G-A/T-A/C/G-A/C-A/T-C/T/G-A/G-A/C/G-A/T-C-A/T/C-A/C/-C/A(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB/#!/tf_gene_info?tf=ENSG00000111206)(圖 3B)。

圖 3 Cistrome預(yù)測結(jié)合POLQ啟動子的轉(zhuǎn)錄因子(A)及AnimalTFDB3.0預(yù)測FOXM1的特異性結(jié)合位點(diǎn)(B)

2.4 FOXM1與POLQ在腫瘤中的表達(dá)相關(guān)性分析

TIMER2.0分析結(jié)果顯示，在包括HNSC在內(nèi)的39 種腫瘤中FOXM1與POLQ表達(dá)水平正相關(guān)，僅在葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma, UVM)中二者表達(dá)水平無相關(guān)關(guān)系(圖 4)。

圖 4 TIMER2.0分析腫瘤中FOXM1與POLQ的表達(dá)相關(guān)性

2.5 PTEN干擾的SACC-83細(xì)胞中POLQ與FOXM1的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，PTEN干擾組細(xì)胞POLQ與FOXM1基因mRNA的表達(dá)上調(diào)(圖 5)。

圖 5 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測PTEN干擾對SACC-83細(xì)胞POLQ與FOXM1表達(dá)水平的影響

3 討 論

POLQ基因廣泛表達(dá)于正常組織及腫瘤組織中， 促進(jìn)alt-NHEJ通路中退火產(chǎn)物的延伸[7]。alt-NHEJ修復(fù)中，PARP1(poly(ADP-ribose)polymerase 1)先與DNA斷端結(jié)合，POLQ插入核苷酸延伸退火產(chǎn)物。數(shù)據(jù)庫分析顯示，POLQ在多種腫瘤中表達(dá)高于正常組織，提示POLQ高表達(dá)是促進(jìn)絕大多數(shù)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)POLQ與SACC惡性程度及較差的預(yù)后正相關(guān)，表明POLQ促進(jìn)SACC發(fā)生發(fā)展。本研究證實(shí)，POLQ表達(dá)降低抑制SACC-83細(xì)胞增殖及克隆形成能力。本研究還發(fā)現(xiàn)POLQ表達(dá)降低促進(jìn)γH2AX(phospho-histone H2A.X)、ATM(ataxia telangiectasia mutated)以及ATR(ataxia telangiectasia and Rad3 related)表達(dá)，并抑制PARP1表達(dá)，表明POLQ下調(diào)促進(jìn)DNA雙鏈斷裂、激活DNA損傷應(yīng)答、抑制alt-NHEJ通路，目前相關(guān)結(jié)果正在投稿中。以上結(jié)果提示POLQ作為SACC治療靶點(diǎn)的可能性。

SACC中PTEN負(fù)調(diào)控POLQ，且PTEN與POLQ無直接結(jié)合，說明有中間因子介導(dǎo)PTEN調(diào)控POLQ。DNA聚合酶多由轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，推測POLQ也可能受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)[8-10]。POLQ與DNA修復(fù)有關(guān)，于是應(yīng)用Cistrome預(yù)測出與POLQ啟動子結(jié)合的DNA修復(fù)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子FOXM1。FOXM1促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，缺失時(shí)可導(dǎo)致非整倍體及DNA斷裂數(shù)量的增加，表明FOXM1參與維持基因組穩(wěn)定性和DNA修復(fù)[11-13]。此外，F(xiàn)OXM1受PTEN負(fù)調(diào)控，并與PI3K/AKT通路正相關(guān)[14]。數(shù)據(jù)庫顯示FOXM1與POLQ在多種腫瘤中表達(dá)正相關(guān)，且下調(diào)PTEN促進(jìn)SACC-83細(xì)胞FOXM1與POLQ表達(dá)上調(diào)，提示二者可能存在直接調(diào)控關(guān)系。在未來研究中，可通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)明確FOXM1與POLQ的直接調(diào)控關(guān)系及結(jié)合位點(diǎn)。

總之，本課題研究了POLQ對SACC-83細(xì)胞的影響，分析了POLQ與FOXM1在多種腫瘤中的表達(dá)相關(guān)性，首次提出PTEN/FOXM1/POLQ通路存在的可能性，以及FOXM1可能是SACC治療新靶標(biāo)。