梔子開花生物學(xué)特性和人工去雄授粉研究

王曉云， 徐 旭， 王鵬良

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)， 南昌330004； 2.江西民族傳統(tǒng)藥現(xiàn)代科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心， 南昌330004；3.江西省中藥種質(zhì)資源工程技術(shù)研究中心， 南昌330004；4.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院， 南寧530002）

梔子（Gardenia jasminoides Ellis.）是茜草科多年生灌木，在我國廣泛分布于中部及以南各省區(qū)。據(jù)《中國植物志》記載［1］，梔子包括2個變種，一個是黃梔子（Gardenia jasminoides Ellis var.jasminoides），通常簡稱為梔子；另一個是重瓣梔子（G.jasminoides Ellis var.fortuniana（Lindl.）Hara.）。黃梔子又變異為2個類型，一類通常稱為“山梔子”，果卵形或近球形，較?。涣硪活愅ǔ７Q為“水梔子”，果橢圓形或長圓形，較大［2］。山梔子可以用作藥材，是藥典規(guī)定種。水梔子一般不作為藥用，主要用作染料或色素提取。重瓣梔子不結(jié)果實，又名白蟾，主要用于園林栽培。

梔子在國內(nèi)的栽培面積很大，江西、廣西、福建等省均有種植基地。梔子種下變異異常豐富，例如，果型有大、中、小果之分，果卵形、近球形、橢圓形或長圓形；葉的形態(tài)有大小及長圓狀披針形、倒卵狀長圓形、倒卵形或橢圓形等差別；分枝上有短、長枝和稀疏、密集之分；冠型上有寬大、矮小和窄長等區(qū)別。形態(tài)上的差異對果實產(chǎn)量有一定的影響，也為育種提供了豐富的材料。

前期從全國各地的梔子資源中，篩選了2種形態(tài)差異顯著、產(chǎn)量等性狀表現(xiàn)優(yōu)良的類型，一種為高枝大果型，典型特征是植株較高、果實大、果實長形、葉片大、單株結(jié)果數(shù)量少、開花晚、花期長、開花時間可延續(xù)到8月份；另外一種為矮枝小果型，典型特征是植株矮小、果實小、果實近球形、單株結(jié)果數(shù)量多、開花早、花期短，在6、7月份集中開放。本研究以這2種類型的梔子和重瓣梔子為材料，對它們的花粉活力和柱頭可授性進(jìn)行了測定。根據(jù)測定結(jié)果，選擇合適時期人工去雄后，進(jìn)行正反交授粉，為探討通過優(yōu)良品系的有性雜交，進(jìn)行品種選育提供科學(xué)依據(jù)和育種材料。

1 材料與方法

1.1 植物材料

高枝大果、矮枝小果型梔子和重瓣梔子種植在江西中醫(yī)藥大學(xué)。將梔子花朵分成5個發(fā)育時期（圖1），每個發(fā)育時期的花朵各取3朵，立即帶到實驗室中，分離雄蕊和雌蕊，進(jìn)行花粉活力和柱頭可授性檢測。同時，取完全開放的重瓣梔子進(jìn)行檢測。

1.2 花粉活力檢測

用氯化三苯基四氮唑（2，3，5－tri－phenyl－tetrazolium chloride，TTC）染色法測定花粉的活力和壽命［3］。用0.2mol／L pH＝7.2的磷酸緩沖液將TTC配制成1%的染色液，并加入30mg／L的蔗糖，蔗糖濃度參考梔子花粉離體萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基濃度［4，5］。

用毛筆蘸取花粉涂抹在載玻片上，滴加染色液，迅速蓋上蓋片，置入內(nèi)有濕濾紙的平皿中，連同平皿放置在37℃黑暗條件下2h。在顯微鏡下，統(tǒng)計蓋片中央部位3～5個視野中紅色花粉占全部觀察花粉粒的比例?；ǘ浒l(fā)育的第5個時期，肉眼未見散出的花粉，則用鑷子輕輕劃開花絲，然后浸泡到載玻片上面的染色液中，再置于顯微鏡下觀察。

1.3 花粉離體萌發(fā)檢測

用人工培養(yǎng)法［4，5］檢測花粉萌發(fā)情況。培養(yǎng)基為0.8% 瓊脂＋30mg／L蔗糖＋15mg／L硼酸＋15g／L PEG－6000＋2.0mmol／L CaCl2，將培養(yǎng)基倒在培養(yǎng)皿中，把花粉均勻彈灑到凝固的培養(yǎng)基上，室溫下暗培養(yǎng)4h后，在Nikon CI－S型生物顯微鏡下觀測花粉情況，統(tǒng)計萌發(fā)率?；ǚ勖劝l(fā)以花粉管伸長超過花粉直徑為標(biāo)準(zhǔn)。每處理重復(fù)3次，每重復(fù)觀察5個視野，每個視野花粉粒數(shù)不少于50粒。在花朵發(fā)育的第5個時期，肉眼未見散出的花粉，則用鑷子輕輕劃開花絲，然后涂抹培養(yǎng)基于花絲上，再置于顯微鏡下觀察。

花粉萌發(fā)率（%）＝萌發(fā)花粉數(shù)／總花粉數(shù)×100%。

1.4 柱頭可授性檢測

用聯(lián)苯胺－過氧化氫法測定柱頭的可授性。染色液的配制方法是：1%聯(lián)苯胺∶3%過氧化氫∶水＝4∶11∶22（體積比）。用毛筆蘸蒸餾水將花粉粒刷去，再浸入凹面載片，載玻片上含有聯(lián)苯胺－過氧化氫反應(yīng)液。立即置于顯微鏡下觀察，若柱頭具可授性，則柱頭周圍的反應(yīng)液呈現(xiàn)藍(lán)色并有大量氣泡出現(xiàn)。

圖1 不同發(fā)育時期的梔子花朵（以高枝大果型為例）

1.5 人工去雄雜交

將高枝大果型和矮枝小果型梔子互為父母本，人工去雄后進(jìn)行正反交。在母本花朵尚未開放時（圖1，第1個時期）去除雄蕊。首先，用解剖刀沿著花苞中部豎向劃一刀直到花瓣底部，割破花瓣（注意不要碰到花藥和雌蕊），然后在花瓣上部1／3處橫向劃一刀，去除上部1／3的花冠，再沿著豎向切口，用鑷子剝開花瓣，小心抽出每一根雄蕊（鑷子不要觸碰花柱和柱頭）。要將雄蕊整條抽出，若是斷裂了需要將殘留的部分去除干凈；注意不要使花粉囊破裂，若是破裂可用蒸餾水沖洗柱頭。去掉雄蕊后，將花瓣恢復(fù)原來的狀態(tài)，繼續(xù)包裹并保護(hù)柱頭。用硫酸紙袋給去雄后的整個花朵套袋并掛標(biāo)簽，記錄去雄時間。氣溫、降雨、遮陰情況和花朵著生位置等均會影響柱頭和花藥的發(fā)育速度，去雄3d左右檢查柱頭發(fā)育情況，待柱頭完全變成黃色，且有粘液產(chǎn)生時進(jìn)行授粉。取第3個時期的父本花朵進(jìn)行人工授粉。用干凈的毛筆刷小心蘸取花粉，涂抹在母本已去雄花朵的柱頭上。授粉后給母本繼續(xù)套袋，記錄授粉時間。授粉3d后除去套袋，等待果實發(fā)育成熟。期間可將未經(jīng)人工授粉的果實摘除一些，并施肥防止落果；噴灑農(nóng)藥防治病蟲害，鋤草培土，加強(qiáng)田間管理。

1.6 雜交后代的收獲和種子發(fā)芽

霜降前后收獲深紅色的果實，小心剝出種子，將殘余的果肉沖洗掉。將種子擺放在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，用1.2mg／mL濃度赤霉素溶液于30℃黑暗條件下浸泡2d破除休眠［6］，然后用蒸餾水沖洗3遍，除去赤霉素，更換新的濾紙，再按照標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗程序進(jìn)行發(fā)芽，每天定時給種子換水，直至種子露白為止。

2 結(jié)果與分析

2.1 梔子花部特征和開花習(xí)性觀察

《中國植物志》記載，梔子的花芳香，通常單朵生于枝頂，花冠白色或乳黃色，花絲極短，花藥線形，長1.5～2.2cm，伸出；花柱粗厚，長約4.5cm，柱頭紡錘形，伸出，長1～1.5cm，寬3～7mm?；ㄆ?～7月，果期5月至翌年2月［1］。

根據(jù)觀察（圖1，表1），高枝大果型和矮枝小果型梔子的花藥和花柱貼生，等高。柱頭由2～3心皮構(gòu)成，每個心皮有幾條突起的縱棱。心皮合生處有凹槽。第1個時期花朵已經(jīng)開放，花瓣內(nèi)外表面均為白色；第2個時期花朵半開放，花苞頂端已經(jīng)完全松開，花瓣內(nèi)表面為白色，外表面大部分為白色，僅邊緣殘留有淡綠色；第3個時期花朵即將開放，花苞頂端即將松開，花瓣內(nèi)外表面為白色，但邊緣殘留有淡綠色；第4個時期花朵尚未開放，花瓣內(nèi)表面為白色，外表面彼此重疊的部分為白色，暴露在陽光下的部分為綠色。以上4個時期花朵的花粉囊均已破裂，散出黃色的花粉粒。第5個時期花朵的花冠為深綠色，花瓣內(nèi)外表面都是綠色，花苞緊閉，花冠緊緊包裹柱頭和花絲，柱頭為綠色無粘液產(chǎn)生，花絲和花藥為乳白色，花粉囊尚未破裂。在花朵發(fā)育的5個時期，隨著花朵逐漸成熟，花冠由緊緊包裹花藥和柱頭逐漸變得松散直到完全開放；柱頭的外表面（包括心皮上的縱棱和縱棱間的溝）逐漸由綠色變?yōu)榈S色，最后變成黃色；心皮合生處的凹槽由綠色逐漸變?yōu)榈G色，再轉(zhuǎn)變成黃色。完全成熟開放的花朵，心皮合生處的凹槽與柱頭外表面均為黃色，并產(chǎn)生大量粘液。另外，在花朵發(fā)育的第5個時期，花藥尚未散粉；隨著花朵逐漸成熟，可散出大量黃色花粉粒。

表1 梔子花朵發(fā)育5個時期花器的形態(tài)變化

重瓣梔子花朵未開放時，柱頭畸形，幾乎不可見；即將開放時，花苞外表面綠色，花瓣內(nèi)表面白色，未見柱頭，花絲和花藥極小，未見散粉；完全開放時，柱頭很小，花絲花藥也小，但能夠散出極少量黃色的花粉。

2.2 花粉活力檢測

在花朵發(fā)育的5個時期，高枝大果型和矮枝小果型梔子的花粉粒均以復(fù)合花粉的形式存在，4個單粒花粉聚合在一起，稱為四合花粉。TTC染色后，第1～4個發(fā)育時期的花粉粒形態(tài)完整、清晰，大小均一，均能染成紅色（圖2A）。在第5個時期，可以觀察到極少量形態(tài)完整、大小正常但未能染色的花粉粒，表明有極少量花粉粒尚未成熟。

重瓣梔子花朵完全開放時，極少量成熟的花粉粒形態(tài)完整、清晰，大小正常，也為四合花粉，可以染成紅色。大部分是形態(tài)較小的單?；ǚ刍驈?fù)合花粉，未能染色，表明花粉畸形，活力低下（圖2B）。

2.3 花粉離體萌發(fā)檢測

圖2 TTC法檢測梔子和重瓣梔子花粉活力（目鏡10×）

在花朵發(fā)育的5個時期，高枝大果型和矮枝小果型梔子的成熟花粉粒在離體培養(yǎng)條件下均能正常萌發(fā)。隨著花朵發(fā)育成熟度下降，萌發(fā)率也下降，未成熟花粉粒逐漸增多。前4個時期下降不明顯，在最后一個時期，矮枝小果型梔子花粉粒萌發(fā)率迅速下降，高枝大果型略有下降（圖3、圖4）。重瓣梔子發(fā)育正常的花粉粒數(shù)量極少，未能檢測萌發(fā)情況。

圖3 不同發(fā)育時期高枝大果型桅子花粉萌發(fā)情況

圖4 不同發(fā)育時期矮枝小果型桅子花粉萌發(fā)情況

2.4 柱頭可授性檢測

剝下高枝大果型和矮枝小果型梔子的柱頭，浸泡到染色液中，進(jìn)行柱頭可授性檢測。柱頭心皮合生的凹槽處均立即有肉眼可見的氣泡產(chǎn)生。隨后，構(gòu)成凹槽的2條縱棱逐漸變藍(lán)，凹槽表面和其他縱棱也隨之變藍(lán)。顯微鏡下可見縱棱處有大量氣泡產(chǎn)生。在5個發(fā)育時期，隨著花朵成熟度降低，柱頭浸泡在染色液中產(chǎn)生的氣泡逐漸變小，數(shù)量逐漸減少，柱頭變色速度減慢，表明柱頭成熟度降低。將完全開放的重瓣梔子的柱頭浸泡在染色液中，無變色，顯微鏡下僅觀察到極少量氣泡。

2.5 果實收獲和種子發(fā)芽率

2種優(yōu)良的梔子類型互為父母本，人工去雄后正反交授粉，共獲得43個果實，果實中種子的數(shù)目為16～517，發(fā)芽率為0～100%（表2）。

3 討 論

梔子是喜光和喜溫植物。氣溫在26℃以上時，若是天氣晴朗，往往集中在下午開放。早晨花苞緊閉，花瓣外表全部呈現(xiàn)為綠色；16：00時左右，花苞外表開始“露白”，花瓣邊緣白色部分顯露出來，花苞頂端松開，露出縫隙，并有清香散發(fā)，吸引許多小蟲爬進(jìn)爬出，屬于蟲媒花。隨著花瓣逐步展開，花冠逐漸轉(zhuǎn)變成白色，花朵迅速開放。它的柱頭龐大，花藥明顯，去雄和授粉操作較容易完成；花器構(gòu)造和開花特征使其兼具自花授粉和異花授粉的優(yōu)勢。人工授粉后，每個梔子果實中均含有種子多數(shù)，但其中有大量種子的胚或胚乳敗育。授粉時雌雄配子狀態(tài)可能是影響種子質(zhì)量的主要因素之一。關(guān)于梔子雜交育種的研究未見報道，準(zhǔn)確把握花朵授粉的生理條件和環(huán)境條件，有利于提高梔子人工去雄授粉后種子的質(zhì)量。

許多植物的柱頭從開花到具有可授性在形態(tài)上會發(fā)生一定變化［7］。梔子為雌雄異熟植物，花朵尚未開放時，雄蕊和雌蕊已經(jīng)成熟。其中，花粉粒成熟較早，包裹在未裂開的花藥中。隨著雄蕊由白色轉(zhuǎn)變?yōu)榈S色最終變?yōu)辄S色，龐大的柱頭也由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色并產(chǎn)生大量粘液，過氧化物酶活性明顯增強(qiáng)，具備了花粉萌發(fā)所需的生理條件。待到花朵開放，花藥已經(jīng)提前開裂并完成授粉。劉麗仙等對梔子受精過程進(jìn)行了詳細(xì)的觀察，結(jié)果表明，自然授粉后的第6天可見到花粉管長入珠孔進(jìn)入胚珠的內(nèi)部，雙受精作用的完成是在授粉后的第12天［8］。根據(jù)本研究的觀察，光照和溫度對梔子開花和自然授粉的過程影響很大，可以加速或者延緩以上過程。

表2 梔子種子發(fā)芽率

一般來說，植物花朵盛開的當(dāng)天，花粉粒的活力最強(qiáng)。本研究結(jié)果表明，在花朵發(fā)育早期梔子花粉粒就已經(jīng)成熟，具備了萌發(fā)能力。進(jìn)行人工去雄后雜交時，選擇即將開放的花朵作為父本（此時花粉粒已經(jīng)成熟），選擇柱頭尚未發(fā)育成熟且未開放的花朵去雄，待柱頭完全成熟時再進(jìn)行授粉。以上措施既避免了自交和外源花粉粒的污染，又使得花粉粒和柱頭處于成熟的生理狀態(tài)下，有利于獲得發(fā)育良好的雜交種。

郝 大 翠 等 對 狹 葉 梔 子 （G.jasminoides Elli var.angusti folia Nakai）、大 花 梔 子 （G.jasminoides Elli var.grandiflora Nakai）和梔子的花粉粒育性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，梔子的花粉粒育性最高，可育花粉粒的百分率約為99%，是另外2種梔子的2倍還多［9］。而且，梔子花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂幾乎完全正常，花粉的可育性最高，果飽滿，結(jié)實率高，而2種作為觀賞用梔子的減數(shù)分裂存在異常，花粉可育性低，結(jié)實率極低或不結(jié)實。本研究結(jié)果表明，重瓣梔子不結(jié)實的原因包括花器畸形、花粉粒少且敗育，是否存在染色體行為異常，尚需進(jìn)一步研究。

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