人參皂苷Rg3對環(huán)磷酰胺致免疫功能低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用

鄭厚勝， 鄭斯文， 王英平*， 白玉潔

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112)

環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)適用于抗腫瘤和部分免疫性疾病[1-2]。CTX是一種細胞毒性藥物，它在體外沒有活性，在體內(nèi)它可以破壞DNA的結(jié)構(gòu)，切斷拷貝導(dǎo)致體內(nèi)細胞死亡[3]。研究表明，長期使用CTX具有極大的副作用，如免疫抑制，骨髓抑制和白細胞減少[4-6]。因此，CTX經(jīng)常用于構(gòu)建免疫抑制的鼠模型。

藥理學(xué)研究證明，人參皂苷Rg3具有調(diào)節(jié)免疫[7-9]、抗氧化[10]和神經(jīng)保護作用等[11]。20(R)-Rg3可能通過減少脂質(zhì)過氧化物、清除自由基和改善能量代謝來降低大鼠腦缺血性腦損傷[12]，還可以通過激活PI3K/Akt通路抑制氧化反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，減輕叔丁基過氧化氫引起的肝細胞壞死和凋亡[13]。Rg3可有效增強免疫功能低下小鼠的細胞免疫功能[14]，20(S)-Rg3可以直接驅(qū)動B細胞產(chǎn)生IgA[15]。20(R)-Rg3和20(S)-Rg3均能增強小鼠對OVA誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，使細胞因子IL-12、IL-4、IL-10、IFN-γ、IgG2a和IgG3增加[16]。此外，Rg3還可以降低化學(xué)抗性誘導(dǎo)的PD-L1表達并恢復(fù)T細胞對癌細胞的細胞毒性。因此，Rg3被認為是靶向PD-L1的新藥[8]。

1 材料

1.1 動物 雄性SPF級BALB/c小鼠，體質(zhì)量(24±2)g，購自長春億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(吉)-2017-0005。小鼠自由飲食飲水，在溫度24.0 ℃、相對濕度60%下適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后進行實驗。

1.2 細胞株 YAC-1細胞，購自中國科學(xué)院細胞庫。

1.3 藥物與試劑 人參皂苷Rg3(吉林大學(xué)，純度為97%)。環(huán)磷酰胺(江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司)；刀豆蛋白(Concanavalin，ConA)、脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)、紅細胞裂解液、Hank’s液、曲拉通TritonX-100、Enhanced Cell Counting Kit-8(CCK-8)(北京索萊寶生物科技有限公司)；無支原體胎牛血清(美國Gibco公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；IFN-γ、TNF-α、IL-2試劑盒(上海朗頓生物技術(shù)有限公司)。

1.4 儀器 Allegra X-30R centrifuge離心機(美國貝克曼庫爾特公司)；BB150二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；MDF-782超低溫冰箱(日本Panasonic公司)；Allegra X-22 R冷凍離心機(美國Beckman Coulter公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Bio Tek公司)。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 60只小鼠隨機分成6組，每組10只，即空白對照組(腹腔注射生理鹽水)、模型組(腹腔注射生理鹽水)、陽性對照組(灌胃給予鹽酸左旋咪唑100 mg/kg)、低劑量組(腹腔注射人參皂苷Rg3 1 mg/kg)、中劑量組(腹腔注射人參皂苷Rg3 2.5 mg/kg)、高劑量組(腹腔注射人參皂苷Rg3 5 mg/kg)，除空白對照組外，其余各組于給藥第5天時腹腔注射環(huán)磷酰胺(80 mg/kg)，連續(xù)3 d，間隔3 d后，再以相同劑量連續(xù)腹腔注射2 d,造模期間正常給藥，共15 d。

2.2 小鼠脾臟指數(shù)測定 末次給藥24 h后，小鼠稱定體質(zhì)量，摘眼球采血，頸椎脫臼處死，取脾臟，剝除結(jié)締組織，預(yù)冷PBS沖洗殘血后濾紙吸去殘液，稱定脾臟質(zhì)量，計算脾臟指數(shù)，公式為脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量。

2.3 小鼠脾淋巴細胞增殖反應(yīng)實驗 末次給藥24 h后，小鼠頸椎脫臼處死，酒精消毒3 min，超凈工作臺取脾，剝除結(jié)締組織，加入3 mL Hank’s液，10 mL注射器芯研磨，過70 μm細胞篩，離心加入紅細胞裂解液3 min，10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液清洗2次，制得均勻細胞懸液，臺盼藍染色后計數(shù)(活細胞在95%以上)，調(diào)細胞密度為1×106/mL，設(shè)對照孔，脾細胞懸液100 μL；刺激孔，脾細胞懸液100 μL+conA(終質(zhì)量濃度為5 μg/mL)、脾細胞懸液100 μL+LPS(終質(zhì)量濃度為10 μg/mL)；空白孔，RPMI-1640完全培養(yǎng)液100 μL，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別孵育24、48 h后，每孔加CCK-8顯色劑10 μL繼續(xù)孵育3 h，在450 nm下測定吸光度。

2.4 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)實驗 于檢測前4 d，小鼠以2%無菌脫脂SRBC腹腔注射致敏，每只0.2 mL，4 d后測量左側(cè)足趾厚度，平行3次，取平均值，并在測量處注射20%SRBC 20 μL，24 h后再次測量，平行3次，取平均值，以注射前后足趾厚度差值來表示DTH程度。

2.6 細胞因子測定 末次給藥24 h后，小鼠摘眼球取血，分離血清，按ELISA試劑盒說明書中操作方法檢測IFN-γ、TNF-α、IL-2水平，用Chem3D軟件繪制人參皂苷Rg3化學(xué)結(jié)構(gòu), 作為對接配體，再從PDB數(shù)據(jù)庫中下載IFN-γ、TNF-α、IL-2三維結(jié)構(gòu)。應(yīng)用Autodock分子對接軟件，使用Pymol模塊進行蛋白準(zhǔn)備，刪掉水分子，移除磷酸根，加上極性氫原子, 賦予電荷, 添加磁場。提取已知配體，保存文件。運用AutodockTool-1.5.6轉(zhuǎn)換格式，尋找活性口袋，最后通過vina進行對接。

2.7 組織學(xué)觀察 將小鼠脾臟固定在10%緩沖甲醛中，脫水透明后包埋，從石蠟塊切下4 μm切片，HE染色切片，在顯微鏡下觀察。

3 結(jié)果

3.1 人參皂苷Rg3對小鼠體質(zhì)量、脾臟指數(shù)的影響 由表1、圖1可知，與空白對照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量、脾臟指數(shù)降低(P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組小鼠體質(zhì)量升高(P<0.05)，而各給藥組小鼠體質(zhì)量無明顯變化(P>0.05)，陽性對照組、各給藥組小鼠脾臟指數(shù)升高(P<0.01)。

圖1 人參皂苷Rg3對小鼠脾臟指數(shù)的影響

表1 人參皂苷Rg3對小鼠體質(zhì)量、脾臟指數(shù)的影響

3.2 對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響 由圖2可知，在24、48 h后與空白對照組比較，模型組在自然、ConA刺激條件下OD值均升高(P<0.05)；與模型組比較，除陽性對照組外，各給藥組在自然、ConA刺激條件下OD值提高(P<0.05，P<0.01)。與空白對照組比較，模型組在LPS刺激條件下OD值升高(P<0.01)；與模型組比較，各組在自然、LPS刺激條件下OD值均升高(P<0.01)。

注：與空白對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01。

3.3 人參皂苷Rg3對小鼠吞噬指數(shù)、足趾厚度差值的影響 由表2可知，與空白對照組比較，模型組小鼠吞噬指數(shù)、足趾厚度差值降低(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組小鼠吞噬指數(shù)(除低劑量組外)、足趾厚度差值升高(P<0.05，P<0.01)。

表2 人參皂苷Rg3對小鼠碳廓清及DTH的影響

3.4 人參皂苷Rg3對小鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-2水平的影響 由表3可知，與空白對照組比較，模型組小鼠IFN-γ、TNF-α、IL-2水平均降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組、各給藥組IFN-γ、TNF-α、IL-2水平均升高(P<0.05，P<0.01)。另外，人參皂苷Rg3與靶點蛋白對接得分分別為IFN(-7.6)、IL-2(-7.3)、TNF(-9.3)，其數(shù)值越小，構(gòu)想越合理，小于-7的值說明結(jié)合模式是良好的，見圖3。

表3 人參皂苷Rg3對小鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-2表達的影響

圖3 人參皂苷Rg3與IL-2、IFN-γ、TNF-α的結(jié)合

3.5 人參皂苷Rg3對免疫低下小鼠脾臟組織病理變化的影響 模型組小鼠脾臟紅髓和白髓混合，小梁被拆散或消失，脾竇擴張，脾臟淋巴細胞減少；各給藥組小鼠紅髓和白髓混合現(xiàn)象明顯減輕，小梁清晰可見，脾臟淋巴細胞明顯增多，見圖4。

注：A為空白對照組，B為模型組，C為陽性對照組，D為低劑量組，E為中劑量組，F(xiàn)為高劑量組。

4 討論

研究表明，Rg3具有多種藥理活性，包括調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。通過刺激樹突狀細胞(DC)，促進Th1細胞分泌細胞因子，還可以誘導(dǎo)CD4+T細胞(Th)向Th1型分化[9]。其與化療藥物聯(lián)用，可以發(fā)揮抗腫瘤作用[17-18]。人參皂苷Rg3有兩種類型，20(R)-Rg3和20(S)-Rg3，可以立體特異性的促進免疫反應(yīng)，20(R)-Rg3在臨床上用于癌癥治療或其它免疫介導(dǎo)的疾病時效果更佳[16]。

脾臟是成熟T細胞、B細胞定居的場所，具有合成生物活性因子、過濾和凈化血液的作用?？乖蛴薪z分裂原可引起T和B淋巴細胞的分裂，ConA誘導(dǎo)的細胞分裂常用于檢測T淋巴細胞免疫活性，LPS誘導(dǎo)的細胞分裂常用于檢測B淋巴細胞免疫活性[19]。IL-2是Th1細胞產(chǎn)生的重要免疫因子, 與 IL-2受體結(jié)合后可誘發(fā)免疫細胞的增殖，抑制腫瘤細胞分裂[20]，并增強NK細胞的活性[21]，從而增加IFN-γ的產(chǎn)生[22]。IL-2還促進B細胞的分化和分泌，IL-2與IL-21共同刺激幼稚B細胞，其產(chǎn)生漿細胞的頻率和分泌的IgM、IgG和IgA的量增加了2至5倍[23]。肝、脾等處的巨噬細胞會清除血液中的碳粒，活性越強，清除能力越強，而TNF-α是活化的單核細胞和淋巴細胞的產(chǎn)物。在本實驗中，通過腹腔注射人參皂苷Rg3，可以提高免疫低下小鼠的脾臟指數(shù)、脾淋巴細胞增殖活性、NK細胞的活性及碳廓清能力。這表明Rg3可能通過調(diào)節(jié)免疫低下小鼠血清IL-2、TNF-α的水平, 對抗CTX對小鼠免疫細胞活性的抑制，從而達到調(diào)節(jié)免疫的作用。由分子對接可知人參皂苷Rg3與IL-2、IFN-γ、TNF-α主要通過氫鍵和π-π堆積等相互作用進行結(jié)合。人參皂苷Rg3與IL-2、IFN-γ主要通過3條氫鍵相連、與TNF-α主要通過3條氫鍵、2條π-π堆積相連，擁有較好的結(jié)合模式。

腹腔注射不同劑量的Rg3對CTX致免疫低下小鼠的脾臟指數(shù)、脾淋巴細胞增殖能力、NK細胞殺傷能力及碳廓清能力的提高都呈現(xiàn)良好的劑量依賴性。但對于小鼠體質(zhì)量的增加、胸腺損傷的修復(fù)及外周血白細胞數(shù)并沒有明顯提高，建議增加藥物配伍使用，增強對胸腺組織損傷的修復(fù)，以進一步增強化療患者的免疫功能。