小檗堿對大鼠急性放射性腸炎的療效及機制研究

王遙，高穎，陳海若，井海亮，李卓虹

成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院腫瘤科，成都 610072

放射性腸炎繼發(fā)于小腸和(或)大腸輻射損傷，常見于胃腸道腫瘤、婦科腫瘤和泌尿系惡性腫瘤的放射治療(簡稱放療)中，以腹痛、腸出血、腸梗阻、腸穿孔、瘺管、吸收不良、直腸疼痛、繼發(fā)于潰瘍的直腸出血為主要臨床表現(xiàn)[1]，最常見的癥狀為伴或不伴有疼痛的腹瀉。據(jù)報道，90%接受盆腔放療的患者排便習慣會發(fā)生永久性改變[2]，多達3/4的患者在接受盆腔放療時會發(fā)生急性不良反應，常發(fā)生于放療過程中或90 d內(nèi)[3]，而5%～55%的患者會發(fā)生慢性放射性腸炎。放療相關毒性的防治和管理已成為臨床亟待解決的難題。目前，放射性腸炎的治療措施包括藥物治療、內(nèi)鏡治療、高壓氧治療、手術治療等，但缺乏臨床研究數(shù)據(jù)證實其確切的療效，且在預防放射性腸炎和治療慢性癥狀方面效果不明顯。因此，探索新的治療藥物和方式具有重要意義[3]。

黃連為毛莫科植物，其根莖為中藥要藥，性寒、味苦，具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效。黃連的作用主要與根莖內(nèi)含有的生物堿有關。小檗堿(Berberine)是從中草藥黃連等小檗屬植物中分離出的一種異喹啉生物堿，是黃連活性成分中最有價值的單體[4]，具有多種藥理作用，如抑制細菌和毒素[5]、抑制腸道分泌和蠕動、保護腸上皮屏障等，是治療炎癥性腸病的候選藥物[6-7]，但有關其治療放射性腸炎的研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿能夠提高放化療的療效；臨床研究發(fā)現(xiàn)，中藥復方中應用黃連能明顯減輕腹瀉、便血、里急后重等癥狀。本研究旨在探討小檗堿對大鼠急性放射性腸炎的療效及可能機制，以期為放射性腸炎的治療提供新的選擇，也為小檗堿治療放射性腸炎的機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 HE染液套裝(G1005)、Masson染液套裝(G1006)購自武漢谷歌生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，E-BC-K020-M)、丙二醛(malondialdehyde，MDA，E-BC-K025-M)購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6，EK206/3-96)、IL-1β(EK201B/3-96)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α，70-EK282/3-96)酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術有限公司；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，ml02242)ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；RNA提取液(Trizol，15596018)購自美國Invitrogen公司；人尿糞隱血測試盒(C027-1-1)購自南京建成生物工程研究所；小檗堿(2021003125)購自成都瑞芬思生物科技有限公司；地塞米松(LOT20235135)購自北京索萊寶科技有限公司；RPMI Medium 1640 basic(C11875500BT)購自美國Gibco公司；青鏈霉素雙抗溶液(SV30010)購自美國Hyclone公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(BL699A)購自合肥志宏生物技術有限公司；SYBR Green qPCR Mix試劑盒(BL698A)購自合肥志宏生物技術有限公司。臺式高速冷凍離心機(Neofuge 15R)購自香港力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；超聲細胞粉碎機(JY92-Iin)購自寧波新芝生物科技有限公司；渦旋混合器(MX-F)購自美國賽洛杰克公司；全自動研磨儀(KH-Ⅲ)、勻漿儀(KZ-Ⅱ)購自武漢賽維爾生物科技有限公司；酶標檢測儀(Epoch)購自美國BioTek公司；臺式高速冷凍型微型離心機(D3024R)購自美國SCILOGEX公司；全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)(SLAN-96S)購自上海宏石醫(yī)療科技有限公司；K2800核酸分析儀(K2800)購自北京凱奧科技發(fā)展有限公司；標準試劑型純水儀(FBZ2001-up-p)購自青島富勒姆科技有限公司；正置光學顯微鏡(Nikon Eclipse E100)購自日本尼康公司。

1.2 動物實驗

1.2.1 實驗動物及分組 健康成年SPF級雄性SD大鼠32只，體重200～220 g，由成都達碩科技生物有限公司提供[實驗動物使用許可證號：SYXK(川)2020-199]。按照隨機數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、小檗堿組和地塞米松組，每組8只，隨機編號稱重。實驗過程符合國家和單位有關實驗動物的管理和使用規(guī)定。

1.2.2 急性放射性腸炎大鼠模型制備 各組大鼠照射前禁食12 h，使用10%水合氯醛腹腔麻醉，仰臥位固定，空白對照組給予偽照射，余各組給予全腹部(從劍突至恥骨聯(lián)合)單次照射，其他部位用鉛板屏蔽，源波距50 cm，皮下距點1.5 cm，照射時間3 min，總照射劑量12 Gy，所有電離輻射照射均在成都友誼醫(yī)院放射醫(yī)學研究所進行。照射后大鼠出現(xiàn)攝食、飲水量減少，體重下降，精神萎靡，蜷縮少動、稀便及血便，表明造模成功。地塞米松組給予地塞米松0.12 mg/(kg.d)灌胃，小檗堿組給予小檗堿50 mg/(kg.d)灌胃，空白對照組與模型組大鼠給予相同體積生理鹽水灌胃。各組于照射后3 h開始行胃管灌胃，1次/d，連續(xù)7 d。末次給藥后12 h腹主動脈取血保存血清，處死大鼠，取腸組織保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 大鼠排便情況及體重測量 觀察并記錄給藥期間各組大鼠的體重及排便情況，分別在實驗第0、3、7天稱取體重，運用人尿糞隱血試劑盒檢測大便隱血情況，并按以下標準進行評分。陰性：3 min不顯藍綠色，評分為0分；弱陽性：30～60 s顯藍色，評分為1分；陽性：立即顯藍綠色，評分為2分；強陽性：肉眼可觀察到血便，立即顯深藍色，評分為3分。

1.2.4 HE染色觀察腸組織病理學變化 取2 cm結(jié)腸或直腸組織，用10%多聚甲醛溶液固定，4 ℃預冷的生理鹽水洗凈血液，石蠟包埋、切片，行HE染色，使用CaseViewer 2.2在不同倍數(shù)下觀察腸組織病理變化，計數(shù)每個腸道截面的隱窩數(shù)量。

1.2.5 Masson染色觀察腸組織膠原纖維沉積情況

將腸組織切片脫蠟，重鉻酸鉀染色水洗，鐵蘇木精染色水洗，磷鉬酸浸染后直接入苯胺藍染液染色，切片用1%冰醋酸分化，無水乙醇脫水后透明封片，使用顯微鏡鏡檢，采集圖像分析。

1.2.6 ELISA檢測腸組織LPS、TNF-α、IL-6、IL-1β含量 取腸組織，用9倍勻漿介質(zhì)研磨，將研磨液以3000～4000 r/min離心10 min，離心半徑為6 cm，取上清制備成10%組織勻漿，采用ELISA試劑盒檢測LPS、TNF-α、IL-6、IL-1β含量，按照試劑盒說明書步驟操作。

1.2.7 腸組織SOD活性、MDA含量檢測 取腸組織，用高速分散器勻漿，制備成10%組織勻漿，采用SOD、MDA試劑盒測定SOD活性(WST-1法)、MDA含量(TBA法)，按照試劑盒說明書步驟操作。

1.3 細胞實驗

1.3.1 含藥血清制備 將各組大鼠腹主動脈血清樣本靜置4 h，低溫離心(4 ℃，3000 r/min，離心半徑6 cm)，取血清，56 ℃水浴30 min滅活補體，0.22 μm濾膜過濾后密封分裝，–20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 細胞培養(yǎng)及處理 IEC-6細胞來源于ATCC CRL-1592，由上海酶研生物科技有限公司提供。將復蘇的IEC-6細胞用含90% RPMI Medium 1640 basic、10% FBS、1%青鏈霉素雙抗溶液的培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細胞密度達到80%時進行傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。將細胞進行等量載體孵育后分為空白對照組、模型組、小檗堿組、地塞米松組。空白對照組僅接受偽照射；余各組接受12 Gy60Co γ射線照射3 min。各組細胞分別按照含藥血清:培養(yǎng)基為1:10的比例加入對應的含藥血清，并于24、48 h測量細胞色素C Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA表達水平。

1.3.3 實時熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR，qPCR)檢測各組細胞色素C、Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA表達水平 參照RNA提取試劑盒說明書提取各組RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別將2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用SYBR Green qPCR Mix試劑盒檢測細胞色素C、Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA表達水平，按照試劑盒說明書步驟操作。實驗重復3次。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列如表1所示。

表1 qPCR引物序列Tab.1 Primer sequence for qPCR

1.4 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計分析。定量數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠排便及體重變化情況 空白對照組大鼠大便正常，大便含血得分為0分。造模各組大鼠均出現(xiàn)不同程度的稀便或血便，模型組大鼠血便最嚴重，造模后即出現(xiàn)黏液便、稀爛血便，人尿糞隱血試劑盒檢測顯示大便含血得分為(1.88±0.30)分；地塞米松組血便較輕，人尿糞隱血試劑盒檢測顯示大便含血得分為(1.00±0.27)分；小檗堿組血便最輕，人尿糞隱血試劑盒檢測顯示大便含血得分為(0.75±0.25)分。各組大鼠第0天體重差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模型組大鼠第3、7天出現(xiàn)體重下降(P<0.05)；地塞米松組第7天體重較模型組明顯下降(P<0.05)；小檗堿組第3、7天體重高于地塞米松組和模型組(P<0.05)(表2)。

表2 各組大鼠體重變化情況(g，±s，n=8)Tab.2 Changes in body weight of rats in each group (g, ±s,n=8)

表2 各組大鼠體重變化情況(g，±s，n=8)Tab.2 Changes in body weight of rats in each group (g, ±s,n=8)

組別 第0天 第3天 第7天空白對照組 18.09±0.96 18.91±0.19 20.24±0.19模型組 18.10±0.13 16.97±0.11(1) 17.23±0.17(1)地塞米松組 17.88±0.12 17.20±0.22(1) 16.10±0.24(1)(2)小檗堿組 18.03±0.22 18.72±0.63(2)(3) 19.14±0.72(2)(3)

2.2 各組大鼠腸組織病理學變化 HE染色結(jié)果顯示，空白對照組大鼠腸道黏膜完整，各層結(jié)構清晰，未見充血水腫；模型組出現(xiàn)不同程度的腸道結(jié)構破壞，可見黏膜上皮細胞壞死脫落、隱窩受損、糜爛形成；地塞米松組腸腔內(nèi)見脫落細胞團塊；小檗堿組見輕微黏膜上皮細胞壞死脫落，未見明顯病理損傷改變(圖1)。

圖1 各組大鼠腸組織病理學變化(HE ×100)Fig.1 Histopathological changes of rats' intestinal tissues in each group (HE ×100)

2.3 各組大鼠腸組織膠原纖維變化 Masson染色

與空白對照組比較，(1)P<0.05；與模型組比較，(2)P<0.05；與地塞米松組比較，(3)P<0.05。結(jié)果顯示，空白對照組大鼠腸組織正常，無明顯膠原增生；模型組大鼠腸組織黏膜下層出現(xiàn)膠原纖維增生；與模型組比較，地塞米松組和小檗堿組膠原纖維增生明顯減少，且小檗堿組膠原纖維增生明顯少于地塞米松組(圖2)。

圖2 各組大鼠腸組織膠原纖維變化(Masson ×100)Fig.2 Changes of collagen fibers in intestinal tissues of rats in each group (Masson ×100)

2.4 各組大鼠腸道隱窩數(shù)量比較 與空白對照組[(183.67±2.6)個]比較，模型組[(115.67±1.45)個]、地塞米松組[(148.33±3.76)個]、小檗堿組[(173.67±2.33)個]腸道隱窩數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組、小檗堿組腸道隱窩數(shù)量明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與地塞米松組比較，小檗堿組腸道隱窩數(shù)量明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.5 各組大鼠腸組織炎性因子水平、SOD活性、MDA含量比較 ELISA檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠腸組織IL-6、TNF-α、IL-1β、LPS水平明顯升高(P<0.05)，地塞米松組大鼠腸組織IL-6水平升高(P<0.05)；與模型組比較，小檗堿組大鼠腸組織IL-6、TNF-α、IL-1β、LPS水平明顯降低(P<0.05)，地塞米松組大鼠腸組織IL-6水平升高、IL-1β水平降低(P<0.05)；與地塞米松組比較，小檗堿組大鼠腸組織IL-6水平明顯降低(P<0.05)(表3)。

與空白對照組比較，模型組大鼠腸組織MDA含量升高、SOD活性降低(P<0.05)；與模型組比較，小檗堿組和地塞米松組MDA含量降低、SOD活性升高(P<0.05)；與地塞米松組比較，小檗堿組MDA含量降低(P<0.05)(表3)。

表3 各組大鼠腸組織炎性因子水平、SOD活性及MDA含量比較(±s，n=8)Tab.3 Comparison of inflammatory factor level, SOD activity and MDA content in intestinal tissues of rats in each group (±s,n=8)

表3 各組大鼠腸組織炎性因子水平、SOD活性及MDA含量比較(±s，n=8)Tab.3 Comparison of inflammatory factor level, SOD activity and MDA content in intestinal tissues of rats in each group (±s,n=8)

IL-6. 白細胞介素-6；IL-1β. 白細胞介素-1β；TNF-α. 腫瘤壞死因子-α；LPS. 脂多糖；SOD. 超氧化物歧化酶；MDA. 丙二醛；與空白對照組比較，(1)P<0.05；與模型組比較，(2)P<0.05；與地塞米松組比較，(3)P<0.05。

組別 IL-6(pg/ml) IL-1β(pg/ml) TNF-α(pg/ml) LPS(ng/ml) SOD(U/ml) MDA(μmol/L)空白對照組 28.26±1.82 496.33±23.13 418.72±2.42 14.35±0.19 22.74±0.18 6.02±1.96模型組 42.23±2.89(1) 766.66±41.89(1) 925.10±88(1) 42.75±3.75(1) 21.62±0.76(1) 12.54±1.19(1)地塞米松組 102.66±10.05(1)(2) 552.00±6.35(2) 786.31±138.78 35.74±7.16 22.54±0.22(2) 11.09±0.92(2)小檗堿組 28.27±4.59(2)(3) 529.66±6.64(2) 470.71±13.19(2) 21.15±2.52(2) 22.55±0.06(2) 9.15±0.003(2)(3)

2.6 各組IEC-6細胞中Bax、Bcl-2、caspase-3、細胞色素C mRNA表達水平比較 qPCR檢測結(jié)果顯示，含藥血清處理24 h和48 h后，模型組Bax、caspase-3和細胞色素C mRNA表達水平高于空白對照組，Bcl-2 mRNA表達水平低于空白對照組(P<0.05)；小檗堿組、地塞米松組Bax、caspase-3和細胞色素C mRNA表達水平低于模型組，Bcl-2 mRNA表達水平高于模型組(P<0.05)；小檗堿組與地塞米松組Bax、Bcl-2、caspase-3、細胞色素C mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表4)。

表4 各組IEC-6細胞Bax、Bcl-2、caspase 3、細胞色素C mRNA表達水平比較(±s，n=8)Tab.4 Comparison of the expression levels of Bax, Bcl-2, caspase 3, cytochrome C mRNA in IEC-6 cells in each group (±s, n=8)

表4 各組IEC-6細胞Bax、Bcl-2、caspase 3、細胞色素C mRNA表達水平比較(±s，n=8)Tab.4 Comparison of the expression levels of Bax, Bcl-2, caspase 3, cytochrome C mRNA in IEC-6 cells in each group (±s, n=8)

與空白對照組比較，(1)P<0.05；與模型組比較，(2)P<0.05。

組別 Bax Bcl-2 Caspase-3 細胞色素C 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h空白對照組 0.99±0.06 1.17±0.13 0.89±0.07 1.00±0.00 0.93±0.04 1.11±0.07 0.89±0.07 1.01±0.01模型組 70.17±2.39(1) 92.10±3.41(1) 0.15±0.01(1) 0.11±0.01(1) 64.37±19.78(1) 65.84±22.41(1) 64.09±29.49(1) 63.68±28.65(1)地塞米松組 4.51±0.11(2) 7.45±0.23(2) 0.73±0.01(2) 0.82±0.04(2) 3.96±0.12(2) 8.14±0.30(2) 2.43±0.13(2) 3.07±0.22(2)小檗堿組 10.13±3.83(2) 9.90±0.48(2) 0.59±0.13(2) 0.46±0.01(2) 12.14±0.52(2) 19.35±0.50(2) 3.18±0.27(2) 4.36±1.21(2)

3 討 論

從天然產(chǎn)物中尋找毒副作用小、安全有效的藥物治療放射性腸炎是值得研究的方向。中藥黃連在腸炎的治療中應用頗多且療效確切，小檗堿為黃連主要生物堿，在抗炎、抗菌及抗腫瘤方面藥效明確。本研究證實了小檗堿能夠有效治療大鼠急性放射性腸炎，為急性放射性腸炎的藥物研究提供了新的方向。

放射性腸炎是盆腔、腹腔或腹膜后惡性腫瘤放療后的主要并發(fā)癥[8]，為非特異性炎癥，主要表現(xiàn)為腹痛、膿液膿血便、腹瀉等，病變累及小腸、結(jié)腸、直腸黏膜及黏膜下層[9]。在放射性腸炎急性期，緊密連接表達降低導致黏膜破壞和上皮細胞死亡，從而引起炎癥[10]。單核細胞的額外募集和常駐肥大細胞的激活可刺激促炎和促纖維化介質(zhì)IL-1β、IL-6、TNF-α的產(chǎn)生[11]。本研究通過電離輻射一次性照射大鼠腹部12 Gy模擬急性放射性腸炎，結(jié)果顯示，模型組大鼠出現(xiàn)體重嚴重下降和稀爛血便，大便含血強陽性，腸組織可見黏膜上皮細胞壞死脫落、隱窩受損，隱窩數(shù)量明顯減少，炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平明顯升高，提示電離輻射導致的炎性損傷與上皮細胞死亡有關，急性放射性腸炎大鼠模型構建成功。本研究動物實驗發(fā)現(xiàn)，小檗堿組大鼠體重在第3、7天均明顯高于模型組和地塞米松組，血便情況優(yōu)于地塞米松組；與模型組比較，小檗堿組大鼠腸組織未見明顯的腸道結(jié)構破壞，膠原纖維增生明顯減少，隱窩數(shù)量明顯增多，但與地塞米松組比較無明顯差異，表明小檗堿對大鼠急性放射性腸炎確有治療作用。

急性放射性腸損傷凋亡期主要表現(xiàn)為隱窩丟失[12-13]；在慢性期，輻射刺激誘導成纖維細胞增殖和膠原沉積，最終導致組織纖維化[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿對腸道隱窩有明顯的保護與修復作用，且對急性放射性腸炎早期出現(xiàn)的膠原纖維增生有抑制作用。放射線輻射可引起大量氧自由基堆積，氧自由基通過直接攻擊作用或氧化作用造成DNA及蛋白質(zhì)等生物大分子損傷，從而引起細胞凋亡，進而引起腸道機械屏障、免疫屏障、化學屏障、生物屏障等功能異常，以及菌群失調(diào)與炎性因子釋放等，最終造成腸組織損傷[15]。本研究選擇MDA、SOD作為氧化應激的代表性指標，其中SOD活性可直接反映機體清除氧自由基、抗脂質(zhì)過氧化損傷的能力，MDA可間接反映組織中氧自由基的生成量，也可反映組織生物膜脂質(zhì)過氧化的程度和組織膜結(jié)構受損的程度[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，放射性腸炎大鼠模型中MDA含量升高，SOD活性降低，而在使用小檗堿與地塞米松后以上指標均有改善，且小檗堿降低MDA含量的效果優(yōu)于地塞米松，表明小檗堿具有減輕大鼠放射性腸炎過度氧化應激損傷的作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿能夠明顯降低急性放射性腸炎大鼠腸組織中LPS的含量。LPS是革蘭陰性菌細胞壁外膜的重要組成成分，可激活生物體內(nèi)巨噬細胞等效應靶細胞，刺激機體產(chǎn)生TNF-α、IL-1、IL-6等多種細胞因子[17]。放射性腸炎患者常存在腸道菌群紊亂，且與腸黏膜損傷、黏膜炎癥及炎性因子釋放相互影響[18]，而小檗堿能夠降低大鼠腸組織中LPS的含量，其與小檗堿抗菌作用的關系值得深入研究。

放射性腸炎的特征是隱窩細胞凋亡誘導上皮屏障的破壞及隨后的炎癥[14]。細胞凋亡可通過暴露于包括電離輻射在內(nèi)的外源DNA損傷劑而被誘導。本研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿可明顯抑制促凋亡蛋白Bax、caspase-3和細胞色素C的表達，促進抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，表明小檗堿可能通過抑制IEC-6細胞凋亡而減輕腸道炎癥反應并保護、修復隱窩細胞。

綜上所述，小檗堿能有效減輕大鼠急性放射性腸炎的炎癥反應，其作用機制可能與小檗堿減輕氧化應激反應、調(diào)控凋亡蛋白的表達以抑制隱窩細胞凋亡有關。小檗堿灌胃對大鼠放射性腸炎具有修復作用，其作用與地塞米松相當，且在抑制膠原纖維增生、抑制炎性因子分泌、減輕氧化應激等方面優(yōu)于地塞米松，表明小檗堿對于急性放射性腸炎具有綜合治療作用，具有進一步研究價值。但本研究尚存在一些不足之處：僅在急性放射性腸炎的炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡方面進行效應觀察，初步探索了小檗堿治療急性放射性腸炎的機制，但缺乏對急性放射性腸炎炎性因子、氧化應激反應以及細胞凋亡三者之間信號通路的深入探究，后續(xù)仍需進一步進行更加具體、全面的機制研究。