基于質(zhì)譜流式細胞技術(shù)揭示TP53突變型乙型肝炎病毒相關(guān)性肝細胞癌的免疫微環(huán)境特征

詹國華 胡嘉欣 潘立鑫 王秋雁 向邦德

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發(fā)性肝癌的主要組織學類型，占肝癌診斷和死亡的絕大多數(shù)［1］。長期以來，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）慢性感染一直被認為是HCC發(fā)生和發(fā)展的主要危險因素，其中全球超過一半的HCC病例均為HBV相關(guān)［2］。手術(shù)切除是HCC主要的治療手段，而目前相比傳統(tǒng)的手術(shù)切除，腫瘤的免疫療法也成為研究的熱點之一［3］。近年來，隨著研究的不斷深入，免疫療法在HCC的臨床應(yīng)用中顯示了巨大潛力［4］。腫瘤免疫微環(huán)境是一個復雜的生態(tài)系統(tǒng)，在疾病進展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。既往已有研究報道了HBV相關(guān)性HCC的腫瘤免疫微環(huán)境特征，這為開發(fā)HBV相關(guān)性HCC的免疫療法提供了參考［5］。TP53是人類癌癥中最常發(fā)生改變的基因之一，大約50%的侵襲性腫瘤存在該突變［6］。在HCC中，TP53突變也是最常見的突變，且深刻影響著HCC的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。已有研究報道，TP53突變可導致HCC中的免疫反應(yīng)下調(diào)，從而影響HCC表型［7］。但關(guān)于TP53突變的HBV相關(guān)性HCC的免疫微環(huán)境特點鮮有報道。本研究使用質(zhì)譜流式細胞術(shù)（CyTOF）描繪TP53突變的HBV相關(guān)性HCC的免疫圖譜，以期進一步了解其免疫微環(huán)境特征，為HCC的免疫治療提出新見解。

1 材料與方法

1.1 標本收集及隨訪

收集2018—2019年于廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院肝膽胰脾外科接受肝切除術(shù)的38例患者的活體組織標本。納入標準：術(shù)后病理均證實為HCC；以手術(shù)切除為初始治療；既往未接受放療、化療等抗腫瘤治療；無其他惡性腫瘤病史。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學醫(yī)學倫理委員會批準。

本研究以門診和電話形式對38例患者進行出院后隨訪，每隔6個月隨訪1次，隨訪內(nèi)容包括腫瘤復發(fā)及其時間，術(shù)后輔助性治療情況及治療方案，患者死亡時間及原因。隨訪截至2021年6月11日，其中死亡10例（TP53突變組8例，TP53未突變組2例），失訪3例?？偵嫫冢╫verall survival，OS）定義為手術(shù)日至因HCC引起死亡或末次隨訪的時間。

1.2 主要儀器及試劑

細胞混旋儀、組織處理器購自德國美天旎生物技術(shù)有限公司，TD25?WS臺式低速離心機購自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，Helios 2 CyTOF質(zhì)譜流式細胞儀、DNA嵌入儀均購自Fluidigm公司。1.6%甲醛溶液購自Thermo Fisher公司，F(xiàn)c受體阻滯劑、鑭系金屬、MaxPar X8抗體標記試劑盒、MaxPar PBS、Maxpar Cell Staining Buffer、順鉑、QTMFour Element Calibration Beads等均購自Fluidigm公司。

1.3 基因突變分析

本研究根據(jù)文獻查閱并確定常見的TP53突變位點，并主要關(guān)注熱點區(qū)域。首先，將提取的肝臟DNA標本送至上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司測序，后續(xù)過程包括文庫構(gòu)建，數(shù)據(jù)質(zhì)控，序列比對，SNP calling，變異檢測及過濾，變異注釋等。其中，測序使用IlluminaX?10測序平臺，測序模式為Paired?end，測序讀長2×150 bp。變異篩選標準：⑴變異處測序總深度大于30；⑵變異在該處的總深度比例大于1%；⑶變異位點的質(zhì)量值Q=-10lgP＞10。對測序后的數(shù)據(jù)進行基因突變信息統(tǒng)計，并將發(fā)生TP53特異位點突變的樣本定義為TP53突變組。

1.4 GyTOF標志物的標記與檢測

按照文獻［8］報道方法，解離組織，制備單細胞懸液，完成后將細胞懸液保存在液氮中。根據(jù)說明書，使用MaxPar X8抗體標記試劑盒并將選定的抗體連接到同位素標簽上。從每個樣本中提取100萬個活細胞，用MaxPar PBS配制順鉑（比例為1∶10 000），并將細胞染色，以確定細胞存活率。細胞懸液用人Fc受體阻斷劑室溫孵育10 min，再用表面抗體孵育1 h，然后洗滌。接著用核抗原染色緩沖液（25℃）孵育30 min，用細胞內(nèi)抗體孵育1 h，洗滌后在室溫下用1.6%多聚甲醛新鮮溶液孵育10 min，然后用DNA嵌入儀于4°C孵育過夜。上機檢測前，用10%的EQTM四元素校準小球再懸浮細胞，然后用Helios 2 CyTOF質(zhì)譜流式細胞儀以小于500個事件/秒的速率分析標記樣本。CyTOF的實驗操作流程見圖1。

圖1 質(zhì)譜流式細胞術(shù)的實驗操作流程Fig.1 Experimental process of mass cytometry

1.5 CyTOF的數(shù)據(jù)分析

CyTOF應(yīng)用單細胞理論，使用金屬同位素標記的抗體，允許在單個細胞中同時檢測多達40個參數(shù)。CyTOF克服了傳統(tǒng)流式通道之間發(fā)射光譜信號重疊的影響，能精確分析細胞亞群［9］。在Helios 2 CyTOF質(zhì)譜流式細胞儀上進行檢測分析，檢測速度每秒小于500個細胞。本研究采集樣本數(shù)據(jù)后，統(tǒng)一使用CyTOF軟件v6.7對FCS數(shù)據(jù)文件進行標準化合并處理。使用在線網(wǎng)站Cytobank（https://www.cytobank.org/）R 語言包（cytofkit、Rtsne、FlowSOM、cytofexplorer、ggplots等）分析FCS數(shù)據(jù)文件。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0和R 4.1.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。臨床基線資料之間的對比采用Fisher確切概率法；TP53突變組與TP53未突變組的OS比較采用R 4.1.0軟件中的survival包繪制生存曲線，采用Log?rank檢驗評估兩組生存曲線的差異；TP53突變組（TP53未突變組）癌組織和癌旁組織的細胞亞群比例差異比較采用配對t檢驗，TP53突變組與TP53未突變組癌組織細胞亞群比例差異比較采用獨立樣本t檢驗；采用R 4.1.0中的heatmap包繪制熱圖。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 基線資料

根據(jù)納入標準，本研究共收集了38例HBV相關(guān)性HCC患者癌組織及其相對應(yīng)癌旁組織標本，其中TP53突變?HBV相關(guān)性HCC（TP53突變組）19例，TP53未突變?HBV相關(guān)性HCC（TP53未突變組）19例，TP53突變組與TP53未突變組患者的年齡、性別等臨床基線資料分布，差異均無統(tǒng)計學意義均（P＞0.05），見表1。

表1 TP53突變組和TP53未突變組患者的臨床基線資料Tab.1 Clinical baseline information of cases in the TP53 mutated group compared to the TP53 unmutated group

2.2 預(yù)后分析

生存分析結(jié)果顯示，TP53突變組與TP53未突變組的1年生存率分別為68.42%和93.75%，TP53突變組和TP53未突變組的生存曲線比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.24），見圖2。

圖2 TP53突變組和TP53未突變組的生存曲線Fig.2 Survival curves of TP53 mutated group and TP53 unmutated group

2.3 CyTOF鑒定細胞亞群

采用CyTOF鑒定TP53突變組和TP53未突變組的所有免疫細胞，結(jié)果鑒定為22個細胞亞群，其中包括3個CD4+T細胞亞群（細胞亞群1、8、14）、9個CD8+T細胞亞群（細胞亞群2、4、5、6、7、9、10、19、21）、1個B細胞亞群（細胞亞群20）、1個樹突（dendritic cells，DC）細胞亞群（細胞亞群3）、3個自然殺傷（natural killer cell，NK）細胞亞群（細胞亞群11、15、16）、2個NKT細胞亞群（細胞亞群12、13）、1個粒細胞亞群（細胞亞群22）和2個未知細胞群，見圖3～4。

圖3 TP53突變組和TP53未突變組的細胞亞群分布Fig.3 Distribution of cell subsets in TP53 mutated group and TP53 unmutated group

圖4 TP53突變組和TP53未突變組癌組織中免疫標志物的表達情況Fig.4 Expreesion of immunomarker of tumor tissues between TP53 mutated group and TP53 unmutated group

2.4 TP53突變組和TP53未突變組的免疫微環(huán)境特征比較

對各組所含有細胞亞群的比例進行比較，TP53突變組的各細胞亞群比例箱式圖和火山圖顯示，癌組織中CD4+T細胞（細胞亞群1、14）比例較高（P＜0.05），而CD8+T細胞（細胞亞群10、19）、NK細胞（細胞亞群11）及NKT細胞（細胞亞群13）比例低于癌旁組（P＜0.05），見圖5。TP53未突變組也顯示，癌組織中CD4+T細胞（細胞亞群1、14）比例較高（P＜0.05），而CD8+T細胞（細胞亞群7、9、10、19）、NK細胞（細胞亞群11）和NKT細胞（細胞亞群13）比例低于癌旁組（P＜0.05），見圖6。在TP53突變組和TP53未突變組癌組織各細胞簇比例箱式圖中，TP53突變組中CD8+T細胞（細胞亞群10）和CD4+T細胞（細胞亞群8）的比例均較TP53未突變組高（2.26%vs0.47%，P=0.028；7.53%vs3.55%，P=0.046），見圖7。

圖5 TP53突變組癌組織和癌旁組織的各細胞群比例Fig.5 Proportion of cell population in tumor and paraneoplastic tissues of the TP53 mutated group

圖6 TP53未突變組癌組織和癌旁組織的各細胞群比例Fig.6 Proportion of cell population in tumor and paraneoplastic tissues of the TP53 unmutated group

圖7 TP53突變組和TP53未突變組癌組織的各細胞群比例Fig.7 Proportion of cell population in tumor tissues of the TP53 mutated group and TP53 unmutated group

2.5 TP53突變組和未突變組癌組織免疫細胞亞群的標志物表達

基于對上述TP53突變組中CD8+T細胞和CD4+T細胞比例較高這一結(jié)果，進一步分析突變組和未突變組癌組織中各免疫細胞亞群相關(guān)標志物表達情況。細胞亞群免疫標志物的表達情況的熱圖顯示，突變組與未突變組癌組織差異表達的CD8+T細胞亞群表達活化細胞標志分子CD45RA，細胞凋亡信號通路分子GranzymeB和激活分子HLA?DR，而CD4+T細胞亞群則表達CD45RO和HLA?DR，見圖8。

圖8 各細胞亞群免疫標志物表達情況的熱圖Fig.8 Heatmap of immune marker expression by cell subtype

3 討論

既往多項研究對癌癥免疫治療反應(yīng)相關(guān)分子特征進行鑒定，如腫瘤細胞中的腫瘤突變負荷、錯配修復、新抗原等［10?11］。癌癥中抑癌基因蛋白 TP53突變經(jīng)常發(fā)生，且與癌癥不良預(yù)后相關(guān)［12］。有研究表明，TP53通過促進細胞周期阻滯和細胞凋亡，在抑制腫瘤發(fā)展中發(fā)揮重要作用［13］，且與腫瘤免疫調(diào)節(jié)有關(guān)［14?15］，如TP53激活可增強抗腫瘤免疫［16］。然而，當TP53突變時，抗腫瘤效應(yīng)的喪失會導致細胞增殖異常并促進癌癥發(fā)生［17］。在肺癌研究中發(fā)現(xiàn)TP53突變與其治療耐藥性增加及預(yù)后較差有關(guān)［18］。TP53突變也是HCC中最常見的突變之一［19］，有研究發(fā)現(xiàn)TP53突變狀態(tài)與腫瘤微環(huán)境有關(guān)［20］。也有研究表明，TP53突變的免疫原性是由復雜的動力學驅(qū)動，可能包括人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）在腫瘤或抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）上的表達、T細胞抗原受體（T cell receptor，TCR）的親和性、T細胞向腫瘤微環(huán)境的轉(zhuǎn)運等［21］。因此推測，TP53突變可能對HBV相關(guān)性HCC患者免疫微環(huán)境具有一定影響。CyTOF是利用質(zhì)譜原理對單細胞進行多參數(shù)檢測的流式技術(shù)，可用于鑒定表達特定蛋白的細胞的大規(guī)模細胞計數(shù)方法。這種技術(shù)能夠在單細胞水平同時分析超過50種細胞參數(shù)，包括蛋白質(zhì)、核酸甚至小分子，從而實現(xiàn)對細胞的精細分群，深入細胞內(nèi)部對信號通路、細胞增殖、細胞周期等進行精細分析。目前，CyTOF已在腎癌［22］、乳腺癌［23］等多種實體瘤分析中發(fā)揮重要作用。為闡明TP53突變狀態(tài)下HBV相關(guān)性HCC的免疫微環(huán)境特征，本研究利用CyTOF對TP53突變組和TP53未突變組進行免疫微環(huán)境研究。首先應(yīng)用CyTOF鑒定兩組的所有免疫細胞，結(jié)果將兩組的所有免疫細胞分為22個細胞亞群，從各細胞亞群比例箱式圖觀察到TP53突變組癌組織中CD4+T細胞比例較高，而癌旁組織中CD8+T細胞、NK細胞和NKT細胞比例較高。同樣地，在TP53未突變組也出現(xiàn)上述情況。但是在TP53突變組與TP53未突變組癌組織比較中，TP53突變組主要以CD4+T細胞、CD8+T細胞和NK細胞為主，TP53未突變組則以CD8+T細胞、B細胞、DC細胞NKT細胞為主。有文獻報道，在TP53突變的乳腺浸潤性癌和肺癌中CD8+T細胞、NK細胞和免疫溶細胞活性具有更高的富集水平［24］，與本研究結(jié)果一致。此外，有研究顯示，肝癌中的免疫細胞亞型也會影響患者預(yù)后［25］，但是遺憾的是，本研究中所鑒定的22個細胞亞群，并未發(fā)現(xiàn)與預(yù)后相關(guān)的免疫細胞亞群，考慮原因可能與本研究病例數(shù)較少、隨訪時間較短有關(guān)，這一方面值得深入探究。

根據(jù)腫瘤免疫編輯假說，腫瘤發(fā)展過程中，具有免疫原性的癌細胞較少，因此規(guī)避了抗腫瘤的免疫反應(yīng)［26］。而這也可能導致免疫抑制細胞（如調(diào)節(jié)性T細胞和腫瘤相關(guān)巨噬細胞）增加，免疫反應(yīng)細胞（如T細胞濾泡性輔助細胞）減少［7］。例如，在TP53高危肺鱗狀細胞癌患者中單核細胞和M1巨噬細胞浸潤率普遍高于低?；颊?，高?；颊叩妮o助性CD8+T細胞和T細胞比例更低［27］。本研究觀察到TP53突變組中CD8+T細胞（細胞亞群10）和CD4+T細胞（細胞亞群8）比例較高，根據(jù)各免疫標志物表達情況得出該CD8+T細胞亞群表達活化細胞標記分子CD45RA，以及參與調(diào)控細胞凋亡的信號通路分子GranzymeB和激活分子HLA?DR，表明該細胞群為初始性CD8+T細胞；而CD4+T細胞亞群則表達CD45RO和HLA?DR，可能為記憶性CD4+T細胞。類似地，有研究發(fā)現(xiàn)在小鼠突變的TP53肉瘤細胞生長過程中，也產(chǎn)生了針對新抗原的CD8+T和CD4+T細胞［28］。由此可見，當TP53突變體被有效地處理和呈現(xiàn)免疫原性，可能產(chǎn)生癌癥特異性免疫反應(yīng)。綜上所述，在HBV相關(guān)性HCC中，相對TP53未突變的HBV相關(guān)性HCC，TP53突變下的HBV相關(guān)性HCC中主要富集初始性CD8+T細胞和記憶性CD4+T細胞，且與腫瘤微環(huán)境的免疫作用有關(guān)，具有免疫異質(zhì)性，但這2個細胞亞群中是否還存在其他產(chǎn)生影響的免疫分子，仍需進一步研究。