不同貯藏溫度對(duì)黃瓜花粉生活力的影響

洪嘉駿 牛歡歡 李征

摘要 首先對(duì)黃瓜花粉生活力的鑒定方法進(jìn)行分析，隨后對(duì)花粉管萌發(fā)檢測(cè)方法進(jìn)行了優(yōu)化，包括最適蔗糖濃度、最適培養(yǎng)觀(guān)察時(shí)間的篩選。結(jié)果表明不同蔗糖濃度的液體培養(yǎng)基對(duì)花粉生活力影響很大，以15%蔗糖+100 mg/kg硼酸效果最佳。培養(yǎng)時(shí)間方面，以培養(yǎng)1.5 h后觀(guān)察花粉萌發(fā)狀態(tài)最佳。隨后，分析貯藏溫度對(duì)黃瓜花粉生活力的影響。結(jié)果表明較于常溫（25 ℃恒溫貯藏）和-20 ℃恒溫貯藏，4 ℃恒溫貯藏能有效減緩花粉活性的下降速度。最后，比較了自交系與雜交商品種在不同貯藏條件下的花粉生活力。結(jié)果表明商品種相較于供試自交系，在相同貯藏條件下花粉萌發(fā)率較高，表明黃瓜花粉活性可能具有雜種優(yōu)勢(shì)效應(yīng)。

關(guān)鍵詞 黃瓜花粉;花粉生活力;花粉管萌發(fā)檢測(cè)法;貯藏溫度

中圖分類(lèi)號(hào) S 642.2? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2021）20-0057-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.20.016

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Effect of Different Storage Temperatures on Viability of Cucumber Pollen

HONG? Jia-jun， NIU? Huan-huan， LI Zheng

（College of Horticulture， Northwest A&F Univeristy， Yangling， Shaanxi 712100）

Abstract The identification methods of cucumber pollen viability were compared and analyzed， and then the detection methods of pollen tube germination were optimized， including the selection of the optimal sucrose concentration and the optimal culture observation time. The results showed that the liquid medium with different sucrose concentration had a great influence on pollen viability， and 15% sucrose + 100 mg/kg boric acid was an optimal choice. In terms of culture time， pollen germination was the best after 1.5 h. Then， the effect of storage temperature on the viability of cucumber pollen was analyzed. The results showed that compared with normal temperature （25 ℃ storage） and -20 ℃ storage， 4 ℃ storage could effectively slow down the decline of pollen activity. Finally， the pollen viability of inbred lines and commercial hybrids under different storage conditions was compared. The results showed that the pollen germination rate of commercial varieties was higher than that of the tested inbred lines under the same storage conditions， indicating that the pollen activity of cucumber may have heterosis effect.

Key words Cucumber pollen;Pollen viability;Detection method of pollen tube germination;Storage temperature

作者簡(jiǎn)介 洪嘉駿（1995—），男，遼寧鐵嶺人，碩士研究生，研究方向：黃瓜遺傳育種。

*通信作者，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事黃瓜遺傳育種研究。

收稿日期 2021-02-19

黃瓜是我國(guó)種植范圍最廣、面積最大的蔬菜之一。由于花器官發(fā)育的特殊性，黃瓜雜交制種一般使用人工授粉，父本花粉的質(zhì)量是決定制種種子產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵因素[1]。相較于其他葫蘆科植物，黃瓜花粉產(chǎn)量較低，且活性衰減較快，花粉離體保存較為困難。生產(chǎn)中，黃瓜授粉能力和花粉活力與環(huán)境溫度關(guān)系較大。黃瓜是喜溫性植物，溫度過(guò)高或過(guò)低均可以導(dǎo)致其授粉受精作用不良，進(jìn)而影響產(chǎn)量和育種工作的順利進(jìn)行[2-3]。

目前對(duì)花粉萌發(fā)和授粉方面的研究，在牡丹[4]、大花蕙蘭[5]等花卉植物中研究較多，相比較而言，在番茄[6-7]、西葫蘆[8]、黃瓜[3]等蔬菜中研究較少。在多年生產(chǎn)實(shí)踐中，發(fā)現(xiàn)進(jìn)行黃瓜花粉的最適培養(yǎng)條件和貯藏條件的研究仍很有必要。這不僅可以用于黃瓜花粉的長(zhǎng)期保存和遠(yuǎn)距離運(yùn)輸，同時(shí)也為開(kāi)展如小孢子培養(yǎng)、花粉轉(zhuǎn)染等生物技術(shù)試驗(yàn)提供材料保存方法的借鑒。筆者首先分析花粉生活力鑒定方法，篩選在液體培養(yǎng)條件下，花粉萌發(fā)率的最佳培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)和培養(yǎng)基的最佳蔗糖濃度。隨后選擇1個(gè)黃瓜自交系和7個(gè)陜西地區(qū)主栽的雜交商品種為試材，分析不同保存溫度對(duì)黃瓜花粉生活力的影響，較全面地分析影響黃瓜花粉離體保存的因素。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃瓜標(biāo)準(zhǔn)自交系CU 雌雄異花系，秋季雄花率較高，適于大量收集花粉，由西北農(nóng)林科技大學(xué)黃瓜課題組保存。雜交黃瓜商品種選擇陜西省關(guān)中地區(qū)目前主栽的商品種，包括津優(yōu)1號(hào)、博耐5000、博耐35B、大宇園藝705、大宇園藝616、大宇園藝131、大宇園藝6-8。商品種由試驗(yàn)當(dāng)?shù)胤N子市場(chǎng)購(gòu)得。

試驗(yàn)于2019年8—10月在西北農(nóng)林科技大學(xué)涇陽(yáng)蔬菜試驗(yàn)站進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃瓜花粉生活力鑒定方法比較。

黃瓜花粉的醋酸洋紅染色法、亞歷山大染色法、TTC（? 5-氯化三苯基四氮唑）染色法和I-KI染色法分別參照Frescura等[9]、Alexander[10]、Norton[11]和Aslam等[12]的方法。花粉管萌發(fā)法采用李曉麗等[3]的方法。處理后的花粉樣品置于光學(xué)顯微鏡觀(guān)察、拍照并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.2.2 黃瓜花粉萌發(fā)最適蔗糖濃度液體培養(yǎng)基的篩選。

在含有100 mg/L硼酸水溶液中加入不同質(zhì)量的蔗糖，配制蔗糖終濃度分別為0、5%、10%、15%、20%的5種液體培養(yǎng)基[3]。采摘當(dāng)日盛開(kāi)的黃瓜雄花，將花粉分別均勻散在4種液體培養(yǎng)基中，置于25 ℃、相對(duì)濕度80%的人工氣候箱中培養(yǎng)2 h后，使用顯微鏡鏡檢觀(guān)察。以花粉管萌發(fā)長(zhǎng)度大于花粉粒直徑為標(biāo)準(zhǔn)記錄花粉萌發(fā)情況。隨機(jī)選取3個(gè)視野統(tǒng)計(jì)花粉發(fā)芽率。

1.2.3 黃瓜花粉萌發(fā)最適觀(guān)察時(shí)間的篩選。

采摘當(dāng)日盛開(kāi)的黃瓜雄花，將花粉均勻散在15%蔗糖濃度的液體培養(yǎng)基中，置于25 ℃、相對(duì)濕度80%的人工氣候箱中。從處理0.5 h起，間隔0.5 h觀(guān)察花粉萌發(fā)情況。隨機(jī)統(tǒng)計(jì)3個(gè)視野并計(jì)算萌發(fā)率。

1.2.4 不同貯藏溫度對(duì)黃瓜花粉生活力的影響。

采摘當(dāng)日盛開(kāi)的黃瓜雄花，取出花藥干燥3～4 h。然后將所有干燥的花藥分成3份，分別放入50 mL離心管中并貯存于-20、4和25 ℃條件下。處理開(kāi)始0、3、6 h分別檢測(cè)一次花粉生活力，從3種貯藏溫度的花藥中取出3～5顆花藥，用毛筆輕刷，使花粉均勻散至培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基配方為15%蔗糖+100 mg/L硼酸。將培養(yǎng)基置于25 ℃、相對(duì)濕度80%的人工氣候箱中培養(yǎng)1.5 h后，在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察3個(gè)互不重疊的視野。將花粉管萌發(fā)長(zhǎng)度超過(guò)花粉直徑的花粉粒認(rèn)定為正常萌發(fā)。隨后每天重復(fù)1次，觀(guān)察花粉萌發(fā)情況。計(jì)算0 h的花粉平均萌發(fā)率，并以其為對(duì)照，計(jì)算其他處理時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)萌發(fā)率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，處理后的結(jié)果采用SPSS（17.0）軟件按照鄧肯法分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜花粉生活力鑒定方法篩選

首先確定黃瓜花粉生活力的檢測(cè)方法。使用I-KI、亞歷山大、醋酸洋紅染色法和花粉管萌發(fā)法分別檢測(cè)黃瓜自交系花粉的生活力，結(jié)果見(jiàn)圖1。I-KI溶液處理后，黃瓜花粉粒的染色情況存在明顯差異，出現(xiàn)藍(lán)黑色的花粉粒較少，表明黃瓜花粉的淀粉含量存在明顯差異。另一方面，亞歷山大和醋酸洋紅溶液處理后，幾乎所有黃瓜花粉粒均顯現(xiàn)出紫紅色和橘紅色，表明絕大部分花粉粒的染色體成分是正常的。最后，使用花粉管萌發(fā)法檢測(cè)供試黃瓜花粉，經(jīng)初步條件摸索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可萌發(fā)花粉管的花粉粒約為70%，陽(yáng)性花粉結(jié)果介于I-KI染色和亞歷山大＼醋酸洋紅染色結(jié)果之間?；诖私Y(jié)果，認(rèn)為染色法檢測(cè)黃瓜花粉雖然操作簡(jiǎn)便，但結(jié)果并不準(zhǔn)確，因此選擇花粉管萌發(fā)法作為檢測(cè)供試黃瓜花粉生活力的首選方法，并加以?xún)?yōu)化。

2.2 黃瓜花粉萌發(fā)的液體培養(yǎng)基蔗糖濃度篩選

使用含有0、5%、10%、15%、20%的蔗糖培養(yǎng)基培養(yǎng)黃瓜自交系CU2的花粉，25 ℃、濕度80%的人工氣候箱中培養(yǎng)2 h后，花粉在5種培養(yǎng)基中均能萌發(fā)，但萌發(fā)率差異顯著（圖2）。在不含蔗糖（0）的培養(yǎng)基中，花粉平均萌發(fā)率為10.00%。隨著蔗糖濃度的提高，花粉萌發(fā)率逐漸上升，在5%和10%蔗糖濃度培養(yǎng)基中分別為19.20%和35.76%，在15%蔗糖濃度培養(yǎng)基中達(dá)到最高值71.40%。隨后，花粉平均萌發(fā)率在20%蔗糖濃度培養(yǎng)基中出現(xiàn)下降，為45.00%。統(tǒng)計(jì)分析表明，培養(yǎng)基中的蔗糖濃度為15%時(shí)，花粉萌發(fā)率與無(wú)糖培養(yǎng)基及蔗糖濃度5%處理呈顯著差異，而培養(yǎng)基中的蔗糖濃度為5%、10%和20%時(shí)差異不顯著。同時(shí)，培養(yǎng)基中的蔗糖濃度為15%時(shí)，花粉萌發(fā)率高于其他處理。因此，15%蔗糖培養(yǎng)基是供試黃瓜材料花粉萌發(fā)的最適條件。

2.3 黃瓜花粉萌發(fā)時(shí)間的篩選

使用15%蔗糖濃度液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)黃瓜自交系CU2的花粉，在25 ℃、濕度80%的人工氣候箱中分別培養(yǎng)0.5、1.0、1.5和2.0 h后，觀(guān)察花粉萌發(fā)情況。結(jié)果顯示處理之間差異顯著（圖3）。培養(yǎng)0.5 h時(shí)花粉萌發(fā)率為0。在培養(yǎng)時(shí)間從0.5 h延長(zhǎng)至1.5 h時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加花粉萌發(fā)率顯著提高，分別為35.44%和66.63%。培養(yǎng)時(shí)間從1.5 h到2.0 h時(shí)，花粉萌發(fā)率增加并不顯著，最終萌發(fā)率為67.63%。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)2.0 h后，由于花粉管生長(zhǎng)過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)容易出現(xiàn)偏差?；谏鲜鼋Y(jié)果，認(rèn)為培養(yǎng)1.5 h后觀(guān)察花粉萌發(fā)情況是比較理想的試驗(yàn)條件，并在后續(xù)研究中加以應(yīng)用。

2.4 不同貯藏溫度對(duì)黃瓜花粉萌發(fā)的影響

采集黃瓜自交系CU2花藥，經(jīng)干燥處理后，貯藏于不同溫度下觀(guān)察其萌發(fā)率變化情況。由于干燥處理會(huì)影響花粉生活力，因此將干燥后未經(jīng)貯藏的花粉萌發(fā)情況作為參照，計(jì)算其他貯藏條件下花粉相對(duì)萌發(fā)率。結(jié)果表明（表1），貯藏在25 ℃恒溫下的花粉初期萌發(fā)情況最好，貯藏3 h后平均相對(duì)萌發(fā)率仍達(dá)84.68%。隨后，在該溫度下的萌發(fā)率快速下降，在貯藏6 h后花粉平均相對(duì)萌發(fā)率僅有40.99%，貯藏1 d后進(jìn)一步下降為22.00%，三者之間有顯著差異。貯藏2和3 d后花粉萌發(fā)率降為6.57%和2.87%，兩者之間無(wú)顯著差異。在4 ℃恒溫貯藏的處理中，貯藏3 h、6 h和1 d后花粉平均相對(duì)萌發(fā)率分別為63.51%、57.34%和27.63%，前兩者無(wú)顯著差異，且與1 d處理有顯著差異。進(jìn)一步貯藏2和3 d后花粉萌發(fā)率均值分別為9.79%和4.34%，兩者之間無(wú)顯著差異。在-20 ℃恒溫貯藏3 h、6 h、1 d、2 d和3 d后花粉平均相對(duì)萌發(fā)率分別為28.07%、19.18%、10.29%、6.11%和2.00%。

由圖4可知，25 ℃恒溫保存對(duì)黃瓜花粉的早期（3 h）傷害最低，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，該貯藏溫度使得花粉生活力迅速下降。相比較而言，對(duì)于短期（1 d）保存黃瓜花粉，4 ℃恒溫可以更好地保存花粉生活力。而-20 ℃恒溫由于對(duì)花粉早期傷害較大，不具有明顯的黃瓜花粉貯藏優(yōu)勢(shì)。進(jìn)一步延長(zhǎng)貯藏時(shí)間，發(fā)現(xiàn)無(wú)論以哪種溫度保存花粉，貯藏2 d后花粉基本失去活性，表明單純溫度條件仍不足以長(zhǎng)時(shí)間有效保存黃瓜花粉。

混合采集西安市大宇園藝系列品種、津優(yōu)1號(hào)等黃瓜商品種的花粉，使用相同的貯藏溫度進(jìn)行處理，分析花粉平均相對(duì)萌發(fā)率的變化情況，結(jié)果表明（圖5，表2），25 ℃恒溫條件貯藏3 h花粉平均相對(duì)萌發(fā)率為80.69%，貯藏1 d后花粉萌發(fā)率均值為64.43%，貯藏2 d后花粉萌發(fā)率均值下降幅度較大，僅為4.23%，三者間有顯著差異。而延長(zhǎng)貯藏3和4 d后，花粉幾乎完全失活。4 ℃恒溫貯藏花粉萌發(fā)率下降幅度較小，同時(shí)花粉萌發(fā)率相對(duì)較高，貯藏 3 h、1 d、2 d的花粉平均相對(duì)萌發(fā)率均值分別為80.19%、77.66%、65.99%，三者之間無(wú)顯著差異。貯藏時(shí)間延長(zhǎng)至3和4 d后，花粉萌發(fā)率大幅度下降至12.84%和0.48%，兩者之間無(wú)顯著差異。-20 ℃恒溫條件不利于花粉的貯藏，花粉萌發(fā)率下降速度較快，同時(shí)花粉活性也不高。貯藏3 h時(shí)花粉平均相對(duì)萌發(fā)率僅為42.98%，而1 d后下降至14.26%，貯藏2 d后的花粉萌發(fā)率為4.22%，三者之間有顯著差異。繼續(xù)貯藏3、4 d后花粉的萌發(fā)率分別為4.07%和2.33%，兩者之間無(wú)顯著差異?；旌匣ǚ鄣馁A藏結(jié)果與黃瓜自交系的分析結(jié)果一致，25 ℃恒溫條件有利于短時(shí)貯藏花粉，而4 ℃恒溫條件長(zhǎng)時(shí)貯藏花粉的效果相對(duì)較好。

3 討論與結(jié)論

黃瓜是典型的單性花植物，雌雄蕊分別著生于獨(dú)立的花器官中。黃瓜花器官較大，單瓜結(jié)籽率較高，又由于生產(chǎn)多使用穴盤(pán)育苗定植，用種量較小。這些原因促使黃瓜育種中多使用人工授粉。在授粉過(guò)程中往往涉及花期不遇、雜交父母親本距離等問(wèn)題，這是研究黃瓜花粉離體保存的一個(gè)重要原因。另外，近年來(lái)，利用花粉為媒介進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的工作已逐漸成為研究熱點(diǎn)[13]，而花粉離體保存也是這些研究的前提條件。相較于西瓜、南瓜等其他葫蘆科植物，黃瓜的花藥體積較小，開(kāi)裂并不充分，散粉能力較差，大量獲得花粉相對(duì)困難，因此研究如何高效地保存其花粉顯得更為重要[3]。

為了研究貯藏花粉生活力的變化情況，首先比較了黃瓜花粉生活力的檢測(cè)方法。先后分析了I-KI、亞歷山大、醋酸洋紅、TTC 4種溶液的染色效果，發(fā)現(xiàn)其結(jié)果并不一致。其中，亞歷山大、醋酸洋紅溶液的染色結(jié)果陽(yáng)性率非常高，I-KI溶液染色的陽(yáng)性率較差。然而，令人意外的是，TTC溶液并不能獲得任何陽(yáng)性結(jié)果（結(jié)果未顯示）。進(jìn)一步使用甜瓜、西瓜、西葫蘆分別進(jìn)行上述溶液的染色分析，獲得的結(jié)果與黃瓜中基本一致?？紤]到4種溶液染色的機(jī)理，推測(cè)葫蘆科花粉（包括供試的黃瓜、甜瓜、西瓜、西葫蘆）中淀粉含量和呼吸活性相對(duì)較低，其花粉生活力不適宜使用I-KI和TTC染色進(jìn)行檢測(cè)。為了獲得準(zhǔn)確的花粉生活力結(jié)果，最后采用花粉管萌發(fā)法進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)優(yōu)化條件，發(fā)現(xiàn)供試黃瓜天然花粉的萌發(fā)率約為70%，遠(yuǎn)高于I-KI溶液的染色結(jié)果，但明顯低于亞歷山大、醋酸洋紅溶液的染色結(jié)果。由此認(rèn)為，在該研究中，花粉管萌發(fā)法是檢測(cè)黃瓜花粉生活力的唯一可靠方法。

培養(yǎng)基中蔗糖濃度過(guò)高或過(guò)低都不利于花粉管的萌發(fā)，發(fā)現(xiàn)黃瓜花粉在蔗糖濃度為15%的液體培養(yǎng)基中具有較高的萌發(fā)能力。當(dāng)然，由于所選擇蔗糖濃度梯度的原因，不排除在15%左右范圍內(nèi)更適合的蔗糖濃度，未來(lái)需要更精細(xì)的試驗(yàn)檢驗(yàn)該結(jié)果。使用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)花粉，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間在1.5 h左右時(shí)花粉萌發(fā)率較高。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)（1.5～2.0 h）花粉萌發(fā)情況增加不明顯，但已萌發(fā)的花粉管伸長(zhǎng)較為顯著，對(duì)結(jié)果觀(guān)察統(tǒng)計(jì)產(chǎn)生明顯阻礙，因此，認(rèn)為選擇培養(yǎng)1.5 h后觀(guān)察黃瓜花粉（管）萌發(fā)情況較為合適，能夠有較好的觀(guān)察效果。

在不同溫度貯藏黃瓜花粉研究中，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是自交系還是黃瓜商品種的混合花粉，25 ℃恒溫貯藏均可短時(shí)保存花粉，但長(zhǎng)時(shí)保存花粉萌發(fā)率下降較快;4 ℃恒溫貯藏能較好的長(zhǎng)時(shí)間保持花粉活性;-20 ℃恒溫貯藏花粉能最大化減緩花粉萌發(fā)率的下降速度，但花粉初始萌發(fā)率較低。25 ℃處理的結(jié)果表明，在正常生理?xiàng)l件下，干燥黃瓜花粉活性喪失較快，與文獻(xiàn)[1-3]和育種實(shí)踐的經(jīng)驗(yàn)觀(guān)察一致。詳細(xì)分析-20 ℃處理的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在該溫度下花粉生活力的下降最緩慢，只是由于低溫對(duì)花粉的初始傷害較大，導(dǎo)致該溫度處理不能有效保存黃瓜花粉。推測(cè)該現(xiàn)象可能是由于花粉的干燥處理不夠徹底造成的。

比較有趣的現(xiàn)象是，黃瓜商品種的花粉與自交系相比，雖然短時(shí)貯藏相對(duì)萌發(fā)率（25 ℃處理3 h時(shí)分別為80.69%和84.68%）差異不大，但貯藏時(shí)間延長(zhǎng)后表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)，25 ℃處理1 d時(shí)萌發(fā)率分別為64 .43%和22.00%，4 ℃處理1 d時(shí)萌發(fā)率分別為77.66%和27.63%。進(jìn)一步延長(zhǎng)時(shí)間，發(fā)現(xiàn)商品種的花粉甚至在4 ℃處理2 d時(shí)仍能保持相對(duì)理想的萌發(fā)率（65.99%）。推測(cè)黃瓜花粉的這一現(xiàn)象可能與商品種的雜合遺傳背景有關(guān)，可能涉及雜種優(yōu)勢(shì)現(xiàn)象，需要進(jìn)一步研究。

綜合該研究結(jié)果，認(rèn)為黃瓜花粉生活力的最適檢測(cè)方法是花粉管萌發(fā)法，該方法使用的液體培養(yǎng)基中蔗糖的最適濃度是15%，最適培養(yǎng)時(shí)間是1.5 h。干燥黃瓜花粉短時(shí)（1 d以?xún)?nèi)）保存可以選擇25 ℃，延長(zhǎng)（2 d以?xún)?nèi)）保存應(yīng)選擇4 ℃。

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