QuEChERS聯(lián)合GC-MS/MS法測定豇豆等豆莢類蔬菜中7種農(nóng)藥

陳祝軍

張家港市疾病預(yù)防控制中心（張家港 215600）

豆莢類蔬菜，屬豆科類植物，是老百姓餐桌上常見的蔬菜，如豇豆、豌豆、蠶豆、四季豆等[1]。該類蔬菜營養(yǎng)豐富、清脆可口，還含有大量的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)等，尤其是維生素和礦物質(zhì)含量較高，而且豆莢類蔬菜還具有入藥等多種用途[2-5]。豆莢類蔬菜在種植過程中極易受病蟲害的影響而減產(chǎn)，種植戶通常施用農(nóng)藥、殺菌劑等用于防治病蟲害[6-9]。皮蠅磷、水胺硫磷、氯唑磷、氧樂果、滅線磷、甲拌磷和甲基異柳磷等均系有機(jī)磷類農(nóng)藥，該類農(nóng)藥殺菌效果好，但毒性較大，人畜誤食用該類農(nóng)藥后，會導(dǎo)致機(jī)體中毒，嚴(yán)重影響人們的身體健康[10]。因此，加強(qiáng)對豇豆等豆莢類蔬菜中上述農(nóng)藥的監(jiān)測，具有重要的意義。

現(xiàn)階段，針對豇豆等豆莢類蔬菜中農(nóng)藥殘留檢測的研究不多：趙馨[11]研究了QuEChERS方法在HPLC測定豇豆中滅蠅胺殘留量的方法；孫小龍等[12]研究了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定豆角中3種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的不確定度評定。GB 23200.93—2016[13]中規(guī)定了關(guān)于動物源類食品中皮蠅磷等有機(jī)磷類農(nóng)藥的GCMS/MS方法檢測，GB 2763—2019中規(guī)定了在豆莢類蔬菜中要求：水胺硫磷≤0.05 mg/kg、氯唑磷≤0.01 mg/kg、氧樂果≤0.02 mg/kg、滅線磷≤0.02 mg/kg、甲拌磷≤0.01 mg/kg、甲基異柳磷≤0.01 mg/kg，皮蠅磷未有指標(biāo)[14]。試驗建立QuEChERS法提取豇豆等豆莢類蔬菜中皮蠅磷、水胺硫磷、氯唑磷、氧樂果、滅線磷、甲拌磷和甲基異柳磷殘GC-MS-MS法定量的檢測方法，結(jié)果證明，此方法具有快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點，適用于豇豆等豆莢類蔬菜中農(nóng)藥殘留的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Thermo Scientific IT Q 1100型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜質(zhì)譜儀（美國熱電公司）；N-丙基乙二胺（PSA）、C18（上海安普試劑公司）；25 mL凈化管（填料為1 g MgSO4、500 mg PSA和500 mg C18，浙江合譜試劑公司）；DSY-VI型氮吹儀（北京東方精華苑公司）；GPC Clean up 600型凝膠凈化色譜儀（北京萊伯泰科公司）；屹堯EXTRA型固相萃取儀（寧波屹堯公司）；Sartorious Quintix 224-1CN型電子天平（德國賽多利斯公司）。

皮蠅磷溶液標(biāo)準(zhǔn)物[編號：GBW（E）081423]、水胺硫磷溶液標(biāo)準(zhǔn)物[編號：GBW（E）081439]、氯唑磷溶液標(biāo)準(zhǔn)物[編號：GBW（E）082088]、氧樂果溶液標(biāo)準(zhǔn)物[編號：GBW（E）081328]、滅線磷溶液標(biāo)準(zhǔn)物[編號：GBW（E）081444]、甲拌磷溶液標(biāo)準(zhǔn)物[編號：GBW（E）081415]、甲基異柳磷溶液標(biāo)準(zhǔn)物[編號：GBW（E）081443]，北京萬佳首化生物科技有限公司；環(huán)氧七氯溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[編號：GBW（E）081456]，北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司；試驗所用試劑均為分析純，國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑廠。

1.2 儀器方法

1.2.1 色譜參數(shù)

色譜柱：Rtx-5MS型質(zhì)譜專用石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：240 ℃；載氣流速：1.46 mL/min；載氣：高純氦氣（純度99.999 9%，浙江海天氣體公司）；進(jìn)樣方式：脈沖不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣體積：1 μL；升溫方式：程序升溫（初始溫度：50 ℃，保持1 min；以15 ℃/min的升溫速率升溫至180 ℃，保持3 min，再以12 ℃/min的升溫速率升溫至290 ℃，保持9 min）。

1.2.2 質(zhì)譜參數(shù)

離子源：EI源；離子源溫度：250 ℃；傳輸線溫度：250 ℃；碰撞氣：高純氬氣（純度99.999 9%，浙江海天氣體公司）；電離電壓：65 eV；溶劑延遲時間：3.4 min；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式。

1.3 溶液制備

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液

精密吸取1.0 mL 100 μg/mL皮蠅磷溶液標(biāo)準(zhǔn)物，置10 mL棕色容量瓶中，加丙酮定容并搖勻，即得10 μg/mL皮蠅磷標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液；同法分別配制水胺硫磷、氯唑磷、氧樂果、滅線磷、甲拌磷和甲基異柳磷標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，質(zhì)量濃度均為10 μg/mL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液

取1.3.1小節(jié)各物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，分別精密吸取適量，加丙酮配制質(zhì)量濃度依次為0.05，0.1，0.5，1.0，2.0和6.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，再分別加入10 μL 10 μg/mL的環(huán)氧七氯內(nèi)標(biāo)液搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

1.3.3 樣品待測溶液

取市售豆莢類蔬菜，以豇豆為例，取約500 g，置粉碎機(jī)中將樣品粉碎，粉碎后的樣品如需保存，設(shè)置保存條件為冷凍（-18 ℃）；準(zhǔn)確稱取約10.0 g粉碎后的樣品，置50 mL離心管中，加25 mL乙腈，均質(zhì)3 min，加入QuEChERS萃取包[填料：N-丙基乙二胺（PSA）、C18]，均質(zhì)5 min后，冷凍離心8 min（控制轉(zhuǎn)速10 000 r/min）；精密吸取10 mL離心液上層清液，置25 mL QuEChERS凈化管中，均質(zhì)5 min，將溶液凈化完畢，再冷凍離心10 min（控制轉(zhuǎn)速10 000 r/min）；精密吸取5.0 mL離心液上層清液，置試管中，氮吹至近干，最后加1.0 mL丙酮溶解殘渣，再加入10 μL 10 μg/mL的環(huán)氧七氯內(nèi)標(biāo)液，渦旋1 min，即得樣品待測溶液。

1.3.4 內(nèi)標(biāo)儲備溶液

內(nèi)標(biāo)儲備溶液：將100 μg/mL的環(huán)氧七氯標(biāo)準(zhǔn)溶液用丙酮作為稀釋溶液，配制成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的選擇

蔬菜中農(nóng)藥殘留萃取常用的方法有液液萃取法和固相萃取法。液液萃取法是以石油醚等溶劑對樣品進(jìn)行多次萃取。萃取過程中分析人員接觸大量有機(jī)溶劑，整個萃取過程耗時較長且萃取效率不高，對人和環(huán)境也造成一定的危害。固相萃取法為近年來農(nóng)藥殘留常用的萃取方法，包括萃取柱萃取和分散固相萃取兩種方式。萃取柱萃取法溶劑消耗量較少且準(zhǔn)確度較高，但過柱耗時相對較長。分散固相萃取方式中QuEChERS法目前廣受歡迎。該方法以無水硫酸鎂作為脫水劑，采用分散固相萃取劑N-丙基乙二胺（PSA）、C18以及石墨化碳黑替代傳統(tǒng)的固相萃取法，以減少樣品取樣量來降低提萃取溶劑的用量，大大提高了工作效率。選擇QuEChERS提取法時，待測物提取率均在80%~110%之間。因此試驗選擇QuEChERS提取法作為前處理方法。

2.2 內(nèi)標(biāo)法消除基質(zhì)干擾

豆莢類蔬菜中農(nóng)藥殘留的檢測，因其基質(zhì)成分較為復(fù)雜，基質(zhì)干擾較大，尤其是水胺硫磷等有機(jī)磷類農(nóng)藥，基質(zhì)影響較大[15-16]；因此，有必要采取措施對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行消除。內(nèi)標(biāo)法是農(nóng)藥殘留中解決基質(zhì)效應(yīng)最常用的方法，使檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度大大提高。通過在樣品中加入一定量的內(nèi)標(biāo)物，通過內(nèi)標(biāo)物計算待測物的含量，可以有效地消除進(jìn)樣誤差、基質(zhì)干擾、信號漂移等的影響。試驗研究比較了內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法對7種農(nóng)藥檢測結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)標(biāo)法所得回收率結(jié)果較為滿意（見表3）。因此，試驗采取內(nèi)標(biāo)法作為定量方法。

表1 內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法回收率結(jié)果

2.3 多發(fā)應(yīng)監(jiān)測方法的優(yōu)化

開啟儀器后，首先采用自動調(diào)諧，即采用全氟三丁胺（PFTBA）對儀器進(jìn)行性能優(yōu)化，優(yōu)化完畢后，選擇質(zhì)譜掃描模式為Q1 Scan（全掃描），對待測物濃度為1.0 μg/mL的皮蠅磷溶液進(jìn)行掃描，確定皮蠅磷母離子；再選擇質(zhì)譜掃描模式為Production scan（產(chǎn)物離子），找到皮蠅磷母離子對應(yīng)的子離子，分別選擇豐度較高的2個子離子，其中1個作為定量離子，1個作為定性離子；根據(jù)選擇的定量離子和定性離子，分別對碰撞電壓（DP）和碰撞能量（CE）進(jìn)行優(yōu)化，建立皮蠅磷對反應(yīng)監(jiān)測方法。同此法，分別建立水胺硫磷、氯唑磷、氧樂果、滅線磷、甲拌磷和甲基異柳磷的對反應(yīng)監(jiān)測方法。監(jiān)測離子對見表2。

表2 7種農(nóng)藥質(zhì)譜參數(shù)

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限

取1.3.1小節(jié)中各物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，分別精密吸取適量，加丙酮配制質(zhì)量濃度依次為0.05，0.1，0.5，1.0，2.0和6.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，再分別加入10 μL 10 μg/mL的環(huán)氧七氯內(nèi)標(biāo)液1搖勻，按1.2小節(jié)中儀器方法條件下的色譜條件和質(zhì)譜條件，分別進(jìn)樣上述標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，每個濃度進(jìn)樣3次，計算平均峰面積，以待測物質(zhì)量濃度為橫軸（x），以峰面積為縱軸（y）進(jìn)行線性擬合，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后以3倍信號噪音比計算檢測限，以10倍信號噪音比計算定量限。典型譜圖見圖1，結(jié)果見表3。由表3可知，檢出限與定量限結(jié)果均低于標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度點。

圖1 典型譜圖

表3 7種待測物線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢測限

2.5 加標(biāo)回收率試驗

取市售豆莢類蔬菜，以豇豆為例，取約500 g，置粉碎機(jī)中將樣品粉碎，準(zhǔn)確稱取約10.0 g粉碎后的樣品，置50 mL離心管中，分別加入一定量1.3.1小節(jié)下的7種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，后續(xù)處理按1.3.3小節(jié)進(jìn)行，分別制備最終加標(biāo)濃度依次為0.01，0.5和6.0 mg/kg的樣品加標(biāo)溶液，每個濃度點制備5份，再按1.2小節(jié)中儀器方法條件下的色譜條件和質(zhì)譜條件，分別進(jìn)樣上述加標(biāo)溶液，計算實際檢測結(jié)果，根據(jù)實測結(jié)果和加入量計算回收率。結(jié)果見表4。

表4 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果

2.6 方法重復(fù)性試驗

取市售豆莢類蔬菜，以豇豆為例，取約500 g，置粉碎機(jī)中將樣品粉碎，準(zhǔn)確稱取約10.0 g粉碎后的樣品，置50 mL離心管中，分別加入一定量1.3.1小節(jié)中7種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，后續(xù)處理按1.3.3小節(jié)進(jìn)行，制備最終加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05 mg/kg的樣品加標(biāo)溶液，同此法共制備6份，再按1.2小節(jié)中儀器方法條件下的色譜條件和質(zhì)譜條件，分別進(jìn)樣上述重復(fù)性溶液，計算實際檢測結(jié)果，根據(jù)實測結(jié)果計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示，皮蠅磷、水胺硫磷、氯唑磷、氧樂果、滅線磷、甲拌磷和甲基異柳磷重復(fù)性SRSD分別為3.47%，2.91%，3.66%，4.05%，2.78%，1.94%和3.09%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

3 結(jié)論

試驗以農(nóng)藥超標(biāo)情況較為嚴(yán)重的豆莢類蔬菜為研究對象，建立了采用QuEChERS提取法將豇豆等豆莢類蔬菜中的皮蠅磷、水胺硫磷、氯唑磷、氧樂果、滅線磷、甲拌磷和甲基異柳磷提取、凈化，氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法定量檢測的分析方法。試驗比較了3種常用于蔬菜中農(nóng)藥提取、凈化的前處理方法，比較了內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度，考察了方法的檢測限、回收率等。試驗結(jié)果表明，試驗建立的方法具有快速、簡便、準(zhǔn)確等特點，適用于豆莢類蔬菜中農(nóng)藥殘留的檢測，為保障老百姓舌尖上的安全提供技術(shù)參考。