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    氣相色譜分析方法開發(fā)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

    2021-11-25 11:17:28長(zhǎng)征縱橫
    實(shí)驗(yàn)與分析 2021年1期
    關(guān)鍵詞:沸點(diǎn)頂空雜質(zhì)

    文/ 長(zhǎng)征縱橫

    氣相分析方法開發(fā)的十二個(gè)步驟 // 方法開發(fā)是個(gè)復(fù)雜而又神秘的工程,往往需要扎實(shí)的理論知識(shí)儲(chǔ)備,但同時(shí)也少不了經(jīng)驗(yàn)的積累;對(duì)于方法開發(fā),需要我們從多學(xué)科出發(fā),分析儀器學(xué)、色譜學(xué)、藥學(xué)、有機(jī)化學(xué)、分析化學(xué)等學(xué)科綜合,也需要我們熟練掌握文獻(xiàn)信息檢索,從中吸取精華,同時(shí)不斷去試錯(cuò),下面就把我個(gè)人職業(yè)生涯的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行總結(jié)提煉,供同行一起學(xué)習(xí)探討。

    步驟一、確認(rèn)主要工作內(nèi)容

    1.殘留溶劑檢測(cè)分析方法:GC-HS方法、GC直接進(jìn)樣方法。

    2.基因毒雜質(zhì)檢測(cè)分析方法。

    3.高沸點(diǎn)樣品雜質(zhì)分離與含量檢測(cè)方法。

    步驟二、信息收集

    1.要確定待測(cè)物質(zhì)的溶解性、極性、沸點(diǎn),主要針對(duì)“溶劑殘留”。

    2.需要確定樣品的溶解性、熱穩(wěn)定性、極性、沸點(diǎn)、化學(xué)性質(zhì)(酸堿)、物理屬性(固體/液體/半固態(tài))。

    3.收集并計(jì)算化合物(待測(cè)物質(zhì))的CH含量%比值,CH含量%比值越高檢測(cè)靈敏度就越好,反之,CH含量%比值越低檢測(cè)靈敏度就越差。

    步驟三、色譜柱使用選擇指南(分離關(guān)鍵)

    1.非極性色譜柱:分離主要根據(jù)沸點(diǎn)高低,沸點(diǎn)低先出,沸點(diǎn)高后出;同沸點(diǎn)的含有O含有N的極性先出,烴類后出,如:DB-1、HP-1、BP-1、SE-30;

    2.極性色譜柱:分離主要根據(jù)分子極性大小,極性小先出,極性大后出,如DB-Wax;

    3.首選中極性毛細(xì)管色譜柱,既能兼顧沸點(diǎn)差異又能兼顧極性差異,如:DB-624、HP-5,表1列舉了幾種常見色譜柱的極性及使用范圍;

    表1 常見色譜柱的極性與使用范圍

    4.色譜柱直徑(內(nèi)徑/粒徑)越窄/越小,柱效越高,峰展寬越小,峰越尖銳,峰靈敏度越高,增加分離度;

    5.色譜柱膜厚影響傳質(zhì)阻力,液膜越薄的傳質(zhì)阻力越小,在同樣的線速度下能夠獲得更高的柱效,柱效越高,峰展寬越小,峰越尖銳,峰靈敏度越高,增加分離度;液膜厚,保留時(shí)間延長(zhǎng)。

    步驟四、進(jìn)樣方法的選擇

    1.方法有溶液直接進(jìn)樣法、頂空進(jìn)樣法。

    ①殘留溶劑-HS:大多數(shù)是低沸點(diǎn)物質(zhì)(醇/酯/烷烴/醚),90%以上采用頂空進(jìn)樣(GC-HS),清潔進(jìn)樣,基本不出雜峰(溶劑),原料不被破壞但經(jīng)濟(jì)費(fèi)用高。

    ②殘留溶劑-DS:5%及少數(shù)采用溶液直接進(jìn)樣(GC-DS),雖然經(jīng)濟(jì),但出雜峰多(主要原料破壞帶入),易損壞色譜柱,需清潔老化保護(hù),表2總結(jié)了一些方法開發(fā)選擇需要考慮的方面。

    表2 開發(fā)選擇考慮總結(jié)

    2.溶劑沸點(diǎn)過高(沸點(diǎn)大于180℃),且樣品對(duì)熱比較穩(wěn)定,首選溶液直接進(jìn)樣法。

    3.溶劑沸點(diǎn)低(沸點(diǎn)小于150℃),且樣品對(duì)熱不穩(wěn)定,首選頂空進(jìn)樣法。

    4.頂空進(jìn)樣法可消除因溶液直接進(jìn)樣會(huì)產(chǎn)生降解雜質(zhì)峰而干擾目標(biāo)峰(進(jìn)樣口溫度大于200℃),采用頂空進(jìn)樣方法還可以減少對(duì)樣品的預(yù)處理。

    5.基因毒雜質(zhì)方法開發(fā),優(yōu)先選擇溶液直接進(jìn)樣法(限度低,主要考慮提高靈敏度);樣品雜質(zhì)分離選擇使用溶液直接進(jìn)樣法。

    6.對(duì)于基因毒雜質(zhì)限度小于2 ppm以下方法開發(fā),優(yōu)先選擇GC-MS溶液直接進(jìn)樣法。

    7.查看CH含量%比值選擇進(jìn)樣方法:

    ①CH含量%比值高:對(duì)于殘留溶劑檢測(cè)選擇頂空進(jìn)樣法,對(duì)于雜質(zhì)分離/控制或基因毒雜質(zhì)控制選擇溶液直接進(jìn)樣法時(shí),可開發(fā)低濃度供試品溶液。

    ②CH含量%比值低:對(duì)于殘留溶劑檢測(cè)選擇溶液直接進(jìn)樣法,對(duì)于雜質(zhì)分離/控制或基因毒雜質(zhì)控制選擇溶液直接進(jìn)樣法時(shí),可開發(fā)高濃度供試品溶液。

    步驟五、確定定量方法

    1.外標(biāo)法:殘留溶劑、含量(準(zhǔn)確)。

    2.內(nèi)標(biāo)法:殘留溶劑(主要針對(duì)易揮發(fā)烷烴類)。

    3.面積歸一化法:樣品雜質(zhì)分離及純度。

    步驟六、樣品預(yù)處理方法

    1.氣相色譜儀能直接分析的樣品通常是氣體或液體,固體樣品在分析前應(yīng)先溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲?,而且還要保證樣品中不含GC不能分析的組分(如無機(jī)鹽:進(jìn)樣口溫度不能保證鹽汽化),往往會(huì)聚集在進(jìn)樣口襯管或分流平板導(dǎo)致污染/堵塞,還有可能通過載氣進(jìn)入色譜柱中,損壞色譜柱的填料。

    2.樣品預(yù)處理/溶解原則:根據(jù)相似相溶原理。

    3.樣品分類:氣體樣品、液體樣品、固體樣品。

    4.氣體/液體樣品預(yù)處理方法:

    ①直接進(jìn)樣分析(純度分析與檢測(cè)),如:甲烷、乙醇;

    ②脂溶性液體樣品(雜質(zhì)),通常需要用脂溶性有機(jī)溶劑溶解樣品,如:甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、正己烷、DMSO、DMF;

    ③進(jìn)樣方式:溶液直接進(jìn)樣、頂空進(jìn)樣。

    5.固體樣品(含鹽)樣品預(yù)處理方法:

    ①樣品性質(zhì):易溶于水,難溶于有機(jī)溶劑,樣品熔點(diǎn)高,難汽化,如:鈉鹽/鉀鹽/鹽酸鹽/硫酸鹽/磷酸鹽/富馬酸鹽;

    ②如果選擇水作溶劑-盡量使用頂空進(jìn)樣方法;

    ③靈敏度不理想且限度低(1~10 ppm)-可使用水溶解二氯甲烷/正己烷萃取法來進(jìn)行預(yù)處理樣品,這樣既可以使用溶液直接進(jìn)樣又可以使用頂空進(jìn)樣,檢測(cè)雜質(zhì)/殘留/基因毒通用。

    6.固體樣品(不含鹽)樣品預(yù)處理方法:根據(jù)相似相溶原理。

    步驟七、溶劑系統(tǒng)選擇

    1.如果是溶液直接進(jìn)樣法,優(yōu)先考慮溶劑選擇,溶解樣品的溶劑和最大溶解限度;如果是頂空進(jìn)樣法,可根據(jù)樣品和溶劑都能溶解;

    2.原則上水溶性樣品優(yōu)先選擇水,非水溶性樣品可選擇酯/醇、DMF、DMSO、NMP、DMAC;

    3.溶液直接進(jìn)樣-樣品溶劑選擇考慮:

    ①化學(xué)穩(wěn)定(水解/醇解),優(yōu)先選擇水(水溶性)/醇/酯(脂溶性)作為溶劑;反之選擇烷烴、質(zhì)子溶劑(萬能溶劑:DMF、DMSO、NMP、DMAC)作為溶劑;

    ②樣品具有酸/堿性,但是檢測(cè)殘留溶劑或雜質(zhì)也具備酸/堿性,可根據(jù)待測(cè)物質(zhì)酸/堿性質(zhì)選擇酸堿中和樣品;如鹽酸/硫酸/富馬酸鹽等產(chǎn)品檢測(cè)胺類,需要單獨(dú)使用堿性溶劑進(jìn)行中和解離,同樣反之,如吡啶/鈉/鉀鹽等產(chǎn)品檢測(cè)酸類,需要單獨(dú)使用酸性溶劑進(jìn)行中和解離,具體溶劑選擇需要進(jìn)行加標(biāo)回收驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

    ③供試品溶液要澄清,不與樣品及待測(cè)物質(zhì)反應(yīng)或結(jié)合。

    4.頂空進(jìn)樣-樣品溶劑選擇考慮:

    ①化學(xué)穩(wěn)定(水解/醇解),優(yōu)先選擇水(水溶性)作為溶劑;反之選擇質(zhì)子溶劑(萬能溶劑:DMF、DMSO、NMP、DMAC);

    ②樣品具有酸/堿性,同上“3.②”。

    ③樣品溶解完全沒要求,頂空進(jìn)樣氣體(溶劑殘留)。

    5.對(duì)于低限度燃燒值大的物質(zhì),可選用鹽析溶劑系統(tǒng),如:苯殘留、三氯甲烷。

    6.樣品溶解溶劑選擇,也要考慮殘留溶劑的溶解度(如:烷、醚類不溶解水)。

    7.大部分溶劑系統(tǒng)優(yōu)先選擇DMSO、NMP、DMF,因?yàn)榧饶苋芙鈽悠酚帜苋芙馊軇?/p>

    步驟八、柱溫開發(fā)研究

    1.等溫:對(duì)于溶劑個(gè)數(shù)少(1~3個(gè)),且各溶劑沸點(diǎn)差異不算很大,此時(shí)可選擇等溫法,比如50℃保持10~15分鐘,適合殘留溶劑檢測(cè)、基因毒雜質(zhì)檢測(cè)、含量測(cè)定。

    2.程序升溫:對(duì)于溶劑個(gè)數(shù)多(大于5個(gè)),且各溶劑沸點(diǎn)差異較大,此時(shí)可選擇程序升溫法,比如40℃保持10分鐘,以10℃/min速率升至180℃,保持5分鐘,適用于產(chǎn)品雜質(zhì)分離、殘留溶劑檢測(cè),表3、表4展示了經(jīng)典的程序升溫。

    表3 經(jīng)典程序升溫(殘留溶劑、雜質(zhì)分離)

    表4 雜質(zhì)分離的程序升溫

    3.極端分離:對(duì)于大部分沸點(diǎn)低溶劑(當(dāng)使用DB-624)且考慮分析時(shí)長(zhǎng)時(shí),可選用低溫程序升溫法,比如初始溫度為35~40℃,分析環(huán)境一定要保證溫度<25℃。

    步驟九、頂空條件方法選擇和研究

    1.爐溫(加熱-頂空瓶平衡溫度):

    ①以水為溶劑,溫度范圍選擇75~90℃,最高選擇90℃;

    ②以DMSO、DMF等為溶劑,溫度范圍選擇80~145℃,最高選擇140℃;溫度過高要考慮高溫時(shí)長(zhǎng)導(dǎo)致溶劑反應(yīng)降解產(chǎn)生新的未知雜峰;

    ③考慮溫度過高有爆瓶危險(xiǎn),特別在使用鹽析方法時(shí)(因?yàn)槿軇┫到y(tǒng)里有水分存在)爆瓶概率增加;

    ④加熱溫度研究最高溫度一般低于溶劑10℃(在考慮靈敏度情況下)。

    2.定量環(huán)溫度:溫度要大于爐溫10℃。

    3.傳輸線溫度:溫度要大于定量環(huán)溫度10℃。

    4.頂空瓶(加熱)平衡時(shí)間:根據(jù)大部分溶劑沸點(diǎn),沸點(diǎn)都相對(duì)高平衡時(shí)間就長(zhǎng),沸點(diǎn)都相對(duì)低平衡時(shí)間就短;常規(guī)平衡時(shí)間為30~60分鐘,經(jīng)典平衡時(shí)間為30分鐘。

    十、檢測(cè)器選用

    1.90%分析方法工作優(yōu)先選用FID檢測(cè)器:含碳?xì)浠衔铩?/p>

    2.基因毒雜質(zhì)選用FID-MS檢測(cè)器。

    3.如含電負(fù)性基團(tuán)(F/Cl/Br)且含CH量少,選用ECD電子捕獲檢測(cè)器,如三氯甲烷無H物質(zhì)。

    4.含有非碳?xì)浠衔锝M分時(shí),且對(duì)檢測(cè)靈敏度要求不高,通常選擇TCD檢測(cè)器,主要是氣體檢測(cè),如輔材:氮?dú)狻?/p>

    5.其他:N/P(氮/磷)檢測(cè)器。

    步驟十一、方法建立

    1.進(jìn)樣口溫度:一般選擇200~230 ℃,進(jìn)樣口溫度要大于傳輸線溫度,可根據(jù)樣品性質(zhì)研究選用中高溫,如150~180 ℃(考慮樣品不被熱解)。

    2.檢測(cè)器溫度:一般選擇230~260℃。檢測(cè)器溫度要大于進(jìn)樣口和色譜柱溫度。

    3.流速:3.0~5.0 mL/min,經(jīng)典流速為:4 mL/min和5 mL/min。

    4.分流比:①5:1-50:1;②選擇規(guī)則:響應(yīng)值高,使用大分流比,反之,則使用小分流比;③經(jīng)典分流比為5:1(頂空進(jìn)樣)和50:1(溶液直接進(jìn)樣)。

    5.進(jìn)樣量:頂空進(jìn)樣為1 mL,溶液直接進(jìn)樣為0.2-1 uL,也可根據(jù)進(jìn)樣峰型進(jìn)行改進(jìn)。

    6.樣品濃度/配制開發(fā)研究:

    ①頂空進(jìn)樣:0.2~1 g(根據(jù)限度/靈敏度要求進(jìn)行研究),對(duì)于大濃度要考察樣品提取平衡;濃度一般控制在0.1~0.4 g/mL(頂空裝量控制在1~5 mL);

    ②溶液直接進(jìn)樣:一定要考慮溶解完全,濃度可根據(jù)限度/靈敏度要求進(jìn)行開發(fā)研究;一般控制在0.5~200 mg/mL;

    ③開發(fā)研究合適的樣品濃度,一定要根據(jù)雜質(zhì)限度/靈敏度做相應(yīng)研究調(diào)整。

    7.對(duì)于雜質(zhì)分離(溶液直接進(jìn)樣法),在方法開發(fā)同時(shí)也要考察殘留問題,可增加清洗老化色譜柱方法程序,也可增加清洗進(jìn)樣針方法;還有對(duì)于對(duì)氣相管路有吸附殘留性質(zhì)也可增加清洗程序(如胺類、>150 ℃高沸點(diǎn)物質(zhì)),增加程序一定要作為分析方法的一部分,且一定要經(jīng)過驗(yàn)證驗(yàn)收。

    8.方法開發(fā)時(shí)遇到難點(diǎn):分離度、靈敏度、峰型。

    分離度優(yōu)化研究:

    ①極性色譜柱與非極性色譜柱的轉(zhuǎn)換使用(DB-Wax與DB-624轉(zhuǎn)換);

    ②使用程序升溫(速率可低至3~5 ℃/min,但是分析時(shí)長(zhǎng)增加,靈敏度減?。?;

    ③使用長(zhǎng)色譜柱(如30 m→45 m→75 m);

    ④使用小粒徑色譜柱(3 um→1.8 um→1 um);

    ⑤降低流速(變流速如:3→1 mL/min);

    ⑥使用程序降溫(120→40℃,速率10-20 ℃/min)。

    靈敏度優(yōu)化研究:

    ①增加進(jìn)樣量(1→2uL);

    ②增大流速;

    ③增加頂空瓶裝樣量(最大5 mL,可研究6~8 mL);

    ④使用小粒徑色譜柱(3 um→1.8 um→1 um);

    ⑤使用鹽析方法(成功典型:苯、三氯甲烷);

    ⑥頂空方法:適當(dāng)增加頂空瓶加熱溫度和時(shí)長(zhǎng)(進(jìn)行對(duì)比研究)。

    峰型優(yōu)化研究:

    ①使用小粒徑色譜柱;

    ②增大柱流量;

    ③使用專屬柱(如胺類分析柱、醇類分析柱);

    ④升高柱溫。

    9.系統(tǒng)干擾考察研究:先走空白2針:樣品1針、對(duì)照1針,查看空白、樣品溶液的干擾情況,空白與樣品應(yīng)無干擾峰出現(xiàn)(方法驗(yàn)證-專屬性),且對(duì)LOQ和LOD測(cè)試無干擾,基本能通過LOQ和LOD驗(yàn)證(方法好壞體現(xiàn)在系統(tǒng)與溶劑對(duì)測(cè)試的干擾)。

    10.系統(tǒng)有干擾可通過換溶劑或調(diào)整程序升溫來消除對(duì)目標(biāo)峰的干擾。

    11.進(jìn)行LOQ考察:只確認(rèn)靈敏度(響應(yīng)值)最小的2個(gè),將LOQ試驗(yàn)出來,LOQ對(duì)應(yīng)濃度是否合格(LOQ含量不得高于限度的50%)。

    12.最 后 進(jìn) 行100%加 標(biāo)回收測(cè)試,回收結(jié)果如果滿足90%~105%,方法基本確定。

    步驟十二、分析方法評(píng)價(jià)與挑戰(zhàn)

    1.分析方法開發(fā)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn):

    ①空白考察:空白溶液無干擾峰出現(xiàn),應(yīng)該對(duì)測(cè)試無影響(最小干擾<LOD);

    ②分離度:最低分離度標(biāo)準(zhǔn)為,各相鄰峰間分離度>2.0(最小1.5);

    ③LOQ:確認(rèn)靈敏度(響應(yīng)值)最小的2個(gè),將LOQ試驗(yàn)出來,LOQ對(duì)應(yīng)濃度是否合格(LOQ含量不得高于限度的50%),且LOQ的S/N要大于10;

    ④加標(biāo)回收標(biāo)準(zhǔn)(90%~110%);

    ⑤溶液穩(wěn)定性:100%加標(biāo)溶液考察0、2、4、8、24小時(shí)的穩(wěn)定性,主要考察峰面積RSD%(n=5)以及各溶劑的回收率%。

    2.分析方法簡(jiǎn)單預(yù)實(shí)驗(yàn)(預(yù)驗(yàn)證):

    ①線性:50%、100%、150%、200%(每點(diǎn)進(jìn)2針),R大于0.999;

    ②準(zhǔn)確度:50%、100%、200%(每點(diǎn)進(jìn)2針),回收率%應(yīng)在90%~110%;

    ③SST實(shí)驗(yàn):6針對(duì)照結(jié)果,各溶劑峰峰面積RSD%(n=6)均小于6.0%,且考察各溶劑峰的拖尾因子或?qū)ΨQ因子(0.9~1.1,最大不可超過2.0)。

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