食品中展青霉素的前處理及檢測(cè)方法研究進(jìn)展

鄧健康，吳曈，扈婧，王青華，張迪，趙娟娟，吳榮榮*

（1.河北省濕地生態(tài)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北衡水053000；2.衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北衡水053000）

展青霉素（patulin，PAT）又名棒曲霉素，是一種由曲霉和青霉等真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，同時(shí)也是一種神經(jīng)毒素。目前發(fā)現(xiàn)約有60種微生物都能產(chǎn)生展青霉素，包括曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium），毛霉屬（Mucor）、鐮胞屬（Fusarium）、絲衣霉屬（Byssochlamys）[1]。展青霉素在生活中并不少見(jiàn)，廣泛存在于各種霉變水果和青貯飼料中，主要污染水果及其制品，尤其是蘋(píng)果、山楂、梨、番茄、蘋(píng)果汁和山楂片等[2]。研究表明，在137個(gè)水果制品中，有30.7%的樣品展青霉素濃度在10.0 g/kg～276.9 g/kg[3]。展青霉素對(duì)胃具有刺激作用。毒理學(xué)試驗(yàn)表明，展青霉素具有影響生育、致癌和致畸等毒理作用，嚴(yán)重可導(dǎo)致呼吸和泌尿等系統(tǒng)的損害，甚至導(dǎo)致神經(jīng)麻痹、肺水腫、腎功能衰竭，對(duì)人體有很大的潛在危害[4]。許多國(guó)家和組織規(guī)定了食品中展青霉素的最大限量，GB 2761—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》中規(guī)定水果及其制品中展青霉素限量標(biāo)準(zhǔn)為50 μg/kg，國(guó)際組織尤其是歐盟等規(guī)定果汁類產(chǎn)品中展青霉毒素的最大含量低于50 μg/kg，兒童和嬰兒食品中展青霉素的限量更低，不得高于 10 μg/kg[2，5]。

對(duì)展青霉素實(shí)現(xiàn)高靈敏、特異性和快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，是控制展青霉素污染的關(guān)鍵。食品中展青霉素的傳統(tǒng)定量分析方法主要包括：高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS）、薄層色譜法（thin-layer chromatography，TLC）、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 和毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）等。近幾年已經(jīng)有多篇綜述回顧和總結(jié)了以上一種或幾種檢測(cè)方法的進(jìn)展[2，6-9]。本文從樣品前處理方法、分子印跡技術(shù)和適配體傳感器等方面的最新進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，以期為展青霉素檢測(cè)和質(zhì)量控制提供參考和支撐。

1 前處理方法

傳統(tǒng)檢測(cè)方法中通常會(huì)遇到雜質(zhì)干擾等問(wèn)題，需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理，從而獲得更準(zhǔn)確的定性和定量信息。前處理方法通常包括液液萃取、固相萃取和分散 固 相 萃 ?。╭uick、easy、cheap、rugged、safe，QuECh-ERS），此外基于先進(jìn)納米材料的前處理方法也是研究的前沿。

1.1 液液萃取

液液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）又稱溶劑萃取，已經(jīng)廣泛用于食品中展青霉素的前處理。GB 5009.185—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中展青霉素的測(cè)定》中采用乙酸乙酯作為溶劑萃取展青霉素[10]。但是LLE耗費(fèi)較多有機(jī)溶劑、成本較高。因此研究者正開(kāi)發(fā)更多方法用于展青霉素的提取和分離。在分散液液微萃取（dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）方法中，萃取溶劑在分散溶劑的輔助下形成微小液滴，均勻分散在水樣中，將展青霉素不斷地萃取到有機(jī)相中，最后在水樣和微量萃取劑之間達(dá)到平衡。乳濁液體系經(jīng)離心后，收集沉淀中的展青霉素。該方法用于蘋(píng)果汁和濃縮果汁樣品中展青霉素的定量分析，具有低基質(zhì)效應(yīng)、操作方便、富集效率高和萃取劑使用量少的優(yōu)點(diǎn)[11]。MAHAM等[12]提出了二元溶劑分散液-液微萃取法（binary solvents-based dispersive liquid-liquid microextraction，BS-DLLME）分離蘋(píng)果汁中展青霉素。乙腈為分散溶劑、乙酸乙酯/氯仿為萃取溶劑，與DLLME相比，BS-DLLME提取效率更高。Li等[13]將單滴液-液-液微萃取（single-drop liquid-liquid-liquid microextraction，SDLLLME）-同位素稀釋-超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（isotope dilution ultra performance liquid chromatography mass spectrometry，ID-LC-MS/MS）技術(shù)應(yīng)用于蘋(píng)果汁中展青霉素分析，大大降低了蘋(píng)果汁中富糖基質(zhì)的干擾，為高糖復(fù)合基質(zhì)中痕量污染物的富集開(kāi)辟了新的前景。盡管DLLME技術(shù)簡(jiǎn)便快速、成本低，但是仍然用到有毒有機(jī)試劑、需要蒸發(fā)過(guò)程等。鹽析-旋渦輔助液-液微萃?。╲ortex-assisted liquid-liquid microextraction，VALLME）是在 DLLME 基礎(chǔ)上的進(jìn)一步發(fā)展，VALLME的一個(gè)重要特性是將萃取溶劑分散到水溶液樣品中，通過(guò)渦旋獲得乳濁液。無(wú)需分散溶劑，只需200μL己醇作為萃取溶劑，漩渦45s，即可提取5 mL樣品中的展青霉素和糠醛[14]。

1.2 固相萃取

固相萃?。╯olid-phase extraction，SPE）是食品樣品制備的最常用的工具之一。食品樣品基質(zhì)復(fù)雜、干擾物質(zhì)多，展青霉素與5-羥甲基糠醛的光譜圖接近，難以從光譜圖上進(jìn)行有效區(qū)分。因此研究者們常采用固相萃取或質(zhì)譜技術(shù)提高方法的檢測(cè)性能。Seo等[15]對(duì)比了 4 種固相萃取柱 HLB SPE、C18 SPE、Silica SPE、EASIMIPTM展青霉素分子印跡固相萃取柱去除雜質(zhì)和抑制離子化效率波動(dòng)的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HLB SPE效果最佳，ID-LC-MS/MS檢測(cè)，展青霉素含量在3 μg/kg～40 μg/kg方法擴(kuò)展不確定度約1%。隨著痕量殘留物提取和凈化技術(shù)，以及高分辨率質(zhì)譜等分析技術(shù)的不斷進(jìn)步，使得展青霉素高通量檢測(cè)成為可能。Yang等[16]采用Oasis MAX 96孔板純化離心果汁的上清液，超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography tandem quadrupole mass spectrometry，UPLC-MS/MS）檢測(cè)，可以實(shí)現(xiàn)展青霉素的快速高通量檢測(cè)，該方法可用于常規(guī)大量樣品的檢測(cè)工作。My-AflaPat多功能凈化柱無(wú)需活化、上樣、洗脫等步驟，樣品加入凈化柱后，提取液通過(guò)固定相進(jìn)入套管中，即可實(shí)現(xiàn)提取液中的雜質(zhì)與展青霉素的一步分離，操作快捷、方便[17]。毛細(xì)管開(kāi)管柱內(nèi)固相微萃取技術(shù)是一種新型的固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）技術(shù)。Zhang等[18]采用化學(xué)鍵合的方法將金納米顆粒修飾至硅烷化石英毛細(xì)管內(nèi)壁，再將適配體修飾在金納米顆粒表面，將適配體修飾在毛細(xì)管柱內(nèi)壁，該技術(shù)成功地將適配體的高特異性和高親和力的優(yōu)點(diǎn)與管內(nèi)固相微萃取的快速高效的特點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)展青霉素的高效分離。

磁性固相萃取是以磁性材料作為吸附劑的一種固相萃取技術(shù)，此技術(shù)已經(jīng)廣泛用于真菌毒素的分析。Wang等[19]采用溶劑熱法制備了氧化石墨烯基磁性納米復(fù)合材料（graphene oxide based magnetic nanomaterials，MGO），并對(duì)吸附劑 MGO 用量、洗脫時(shí)間、樣品pH值、離子強(qiáng)度、洗脫溶劑和體積等進(jìn)行了優(yōu)化。在最優(yōu)萃取條件下，對(duì)蘋(píng)果汁中展青霉素進(jìn)行萃取富集，HPLC法測(cè)定，該方法檢出限為2.3 μg/kg，回收率為68.7%～83.6%。Yu等[20]以苯并呋喃-2-羧酸為載體的磁性納米復(fù)合材料，用于蘋(píng)果汁中展青霉素的預(yù)濃縮。傳統(tǒng)固相萃取柱重復(fù)使用時(shí)存在交叉污染和吸附能力過(guò)限等問(wèn)題，Yu等合成的磁性納米復(fù)合材料可以多次重復(fù)使用，富集能力強(qiáng)。磁性納米材料有望成為未來(lái)固相萃取的理想材料，目前用于固相萃取的磁性納米材料仍面臨回收率低、合成復(fù)雜等問(wèn)題。

1.3 QuEChERS

基于QuEChERS方法的樣品制備步驟包括乙腈溶液提取，加入氯化鈉和硫酸鎂使乙腈和水分層，取上清液加入硫酸鎂、N-丙基乙二胺（primary-secondary amine，PSA）吸附劑和C18吸附劑進(jìn)行分散固相萃取，去除色素、有機(jī)酸、金屬離子等雜質(zhì)干擾[21]。盡管QuEChERS有眾多優(yōu)點(diǎn)，但應(yīng)用于含水量低的樣品或色素和脂肪含量高的樣品仍然存在復(fù)雜基質(zhì)干擾等問(wèn)題。為此近年來(lái)更多改進(jìn)方法逐漸出現(xiàn)在視野中。例如將QuEChERS與SPE策略相結(jié)合，可有效去除樣品基質(zhì)干擾和濃縮展青霉素，以13C7展青霉素同位素內(nèi)標(biāo)，可以應(yīng)用于多種實(shí)際樣品中展青霉素的檢測(cè)。對(duì)所測(cè)多種基質(zhì)，該方法的重復(fù)性低于10%[22]。Sadok等[23]進(jìn)一步改進(jìn)QuEChERS，以1%乙酸酸化的乙腈為提取溶劑，加入硫酸鎂、氯化鈉和檸檬酸鹽緩沖液，隨后采用PSA吸附劑和石墨化碳為分散固相萃取劑。

2 基于分子印跡材料的展青霉素檢測(cè)方法

傳統(tǒng)的檢測(cè)方法普遍需要大型精密儀器設(shè)備以及專業(yè)技術(shù)人員，限制了這些檢測(cè)方法的廣泛使用。因此發(fā)展簡(jiǎn)便、檢測(cè)速度快、靈敏度高的檢測(cè)方法變得至關(guān)重要?；诩{米材料的傳感器可以實(shí)現(xiàn)上述要求，逐漸成為展青霉素分析的有力工具。分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）中特定的結(jié)合位點(diǎn)與靶標(biāo)的特異性結(jié)合。這些結(jié)合位點(diǎn)的形狀，大小以及特定官能團(tuán)，賦予其識(shí)別靶標(biāo)的特異性。與其它功能化材料相比，MIPs具有成本低，親和力和特異性強(qiáng)，化學(xué)和物理特性高度穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。MIPs的這些突出優(yōu)點(diǎn)使它們可以廣泛用于各個(gè)領(lǐng)域，例如分離[24]、化學(xué)/生物傳感[25]等。

2.1 分子印跡材料和色譜檢測(cè)方法結(jié)合

Anene等[26]采用兩步法制備了新型分子印跡聚合物。首先，將3-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（γmethacryloxy propyl trimethoxyl silane，γ-MPTS）與四乙氧基硅烷（tetraethyl orthosilicate，TEOS）混合得到 SiO2-γ-MPTS。在SiO2-γ-MPTS基礎(chǔ)上以展青霉素為模板，馬來(lái)酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯作為交聯(lián)劑，2，2’-偶氮二異丁腈作為前體，乙腈作為成孔劑，最終得到SiO2MA@MIP。采用新型MIP@SPE提取展青霉素，HPLC分析，檢測(cè)限和定量限低至8.6 μg/L和28.6 μg/L。對(duì)于高色素含量的樣品，分子印跡親和柱能更好地去除色素干擾。除此之外有研究表明與SPE和QuEChERS相比，分子印跡固相萃取小柱能明顯提高回收率[27]。但分子印跡材料合成過(guò)程中完全去除模板分子存在一定困難，易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。通過(guò)設(shè)計(jì)假模板分子可以解決上述問(wèn)題。Yang等[28]采用與展青霉素結(jié)構(gòu)相似的2-吲哚酮作為假模板分子，表面印跡與溶膠凝膠法結(jié)合制備出一種對(duì)展青霉素具有特異性吸附的MIPs。將MIPs作為在線固相萃取吸附劑。在最優(yōu)富集條件下，在線固相萃取柱對(duì)展青霉素的富集倍數(shù)為125倍。Zhang等[29]的研究以雙模板合成MIPs，此MIPs作為SPE填料，可以有效吸附和濃縮展青霉素。Zhao等[30]在后續(xù)研究中，通過(guò)表面印跡技術(shù)制備了一種新型磁性分子印跡聚合物。分子印跡聚合物與磁性納米粒子耦合后對(duì)展青霉素的吸附能力高于常規(guī)MIPs。在 Moreno-González等[31]的最新研究中，通過(guò)在線分子印跡固相萃取-毛細(xì)管區(qū)帶電泳-質(zhì)譜技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了展青霉素檢測(cè)儀器的小型化和自動(dòng)化，并且可以有效避免5-羥甲基糠醛的干擾，為未來(lái)分子印跡材料與傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)的結(jié)合提供了新的思路。

2.2 分子印跡熒光傳感器

分子印跡熒光傳感器結(jié)合了MIPs的高親和力和高選擇性以及熒光傳感器的高靈敏度，成為分子印跡傳感器領(lǐng)域的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一[32]。量子點(diǎn)（quantum dots，QDs）是一種半導(dǎo)體熒光納米材料。QDs的尺寸可調(diào)，熒光強(qiáng)度高，熒光穩(wěn)定性好，使其得以應(yīng)用在很多領(lǐng)域。非鎘基量子點(diǎn)可以減少環(huán)境毒性，是目前的研究熱點(diǎn)。錳摻雜ZnS量子點(diǎn)（Mn-ZnS QDs）是研究最多的量子點(diǎn)之一。Zhang等[33]合成了Mn：ZnS量子點(diǎn)表面包覆分子印跡材料應(yīng)用于展青霉素檢測(cè)。Mn-ZnS QDs表面印跡材料通過(guò)溶膠凝膠法制備而成，假模板分子（6-羥基煙酸）脫去后，形成識(shí)別空腔選擇性識(shí)別展青霉素。展青霉素與印跡空腔結(jié)合導(dǎo)致Mn-ZnS QDs光強(qiáng)度降低，但該方法的靈敏度和抗干擾性能有待于提高。

上轉(zhuǎn)換納米材料（upconversion nanoparticles，UCNPs）作為新一代納米熒光探針，UCNPs具有高度的光化學(xué)穩(wěn)定性，尖銳的發(fā)射帶寬和大的反斯托克斯位移（高達(dá)500 nm），這些優(yōu)點(diǎn)使其適合用于制備復(fù)合熒光納米探針。在過(guò)去幾年中，人們對(duì)UCNPs在食品分析領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了廣泛探索。常潔[34]利用溶劑熱法制得油溶性上轉(zhuǎn)換納米晶 β-NaYF4：Yb3+，Er3+，再用 TritonX-100和堿水解法對(duì)其進(jìn)行水溶性改性和SiO2包覆，合成一種兼具支撐載體和信號(hào)輸出功能的新型熒光載體UCNPs@SiO2，然后運(yùn)用表面印跡技術(shù)制備出對(duì)痕量展青霉毒素具有高選擇性的熒光分子印跡聚合材料UCNPs@MIPs。隨著展青霉素濃度的增加UCNPs@MIPs的熒光淬滅程度不斷增加。制備過(guò)程如圖1所示。

圖1 銀納米顆粒-金屬有機(jī)框架材料-展青霉素-分子印跡聚合物的制備過(guò)程Fig.1 Schematic image for synthesis of MIP-capped AgNPs@ZnMOF

如圖1所示，Bagheri等[35]合成了銀納米顆粒-金屬有機(jī)框架材料（AgNPs@ZnMOF），以AgNPs@ZnMOF為載體，合成分子印跡聚合物（MIP-AgNPs@ZnMOF）。MIP-AgNPs@ZnMOF具有高過(guò)氧化物酶活性，催化過(guò)氧化氫-對(duì)苯二甲酸產(chǎn)生熒光產(chǎn)物。展青霉素通過(guò)氫鍵或與氨基發(fā)生親電相互作用進(jìn)入MIP位點(diǎn)，抑制MIP-AgNPs@ZnMOF的催化活性，從而實(shí)現(xiàn)定量分析。

2.3 分子印跡電化學(xué)傳感器

分子印跡電化學(xué)傳感器是基于分子印跡材料和電化學(xué)技術(shù)的具有特異識(shí)別能力的電化學(xué)傳感器，具有高特異性、簡(jiǎn)便和高效的特點(diǎn)。構(gòu)建理想的電化學(xué)傳感器，需要修飾電極表面以獲得更高的電活性。Guo等[36]利用分子印跡技術(shù)結(jié)合碳點(diǎn)、殼聚糖和金納米粒子修飾玻碳電極表面，循環(huán)伏安法和差分脈沖伏安法監(jiān)控電聚合過(guò)程。碳點(diǎn)、殼聚糖和金納米粒子沉積在玻碳電極表面，電極表面積增加，電極導(dǎo)電率增大。此傳感器的線性范圍為 1×10-12mol/L～1×10-9mol/L，檢出限為7.57×10-13mol/L。Huang等[37]提出了一種表面功能單體誘導(dǎo)策略構(gòu)建展青霉素分子印跡電化學(xué)傳感器。硫堇作為分子印跡聚合物的功能單體和信號(hào)指示劑，將鉑納米顆粒、氮摻雜石墨烯和硫堇的優(yōu)良導(dǎo)電性與信號(hào)放大相結(jié)合，提高了靈敏度。此外，該傳感器具有良好的穩(wěn)定性、可重復(fù)性和選擇性。

綜上，多種分析技術(shù)與分子印跡材料結(jié)合，擴(kuò)展了現(xiàn)有技術(shù)的應(yīng)用范圍，提高了靈敏度、特異性等?；诜肿佑≯E材料的傳感手段已經(jīng)取得了許多成果，并且部分成果已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化和實(shí)際應(yīng)用。但仍然存在以下問(wèn)題：高通量檢測(cè)是實(shí)現(xiàn)快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的重要因素，基于MIPs的高通量快速檢測(cè)傳感器的研究處于初步階段；MIPs制備過(guò)程復(fù)雜，開(kāi)發(fā)合成簡(jiǎn)便、高效的MIPs迫在眉睫；部分MIPs局限在非極性環(huán)境中，水相中有效吸附和識(shí)別展青霉素這一問(wèn)題依然有待解決。

3 適配體傳感器用于展青霉素檢測(cè)

當(dāng)今國(guó)際科研領(lǐng)域，適配體傳感器（Aptasensor）的研究已成為最為活躍的前沿科學(xué)之一。核酸適配體（Aptamer）可以特異性結(jié)合目標(biāo)分子如蛋白質(zhì)、氨基酸、有機(jī)小分子和無(wú)機(jī)離子等[38]。適配體和真菌毒素等目標(biāo)分子的結(jié)合具有很強(qiáng)的專一性和選擇性。相對(duì)抗體來(lái)說(shuō)，核酸適配體不依賴于動(dòng)物或細(xì)胞，可以直接通過(guò)人工合成獲得。適配體的穩(wěn)定性和耐受性好，且其變性是可逆的，適合長(zhǎng)期貯存和在常溫下運(yùn)輸。適配體傳感器具有特異性好、制備過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)多種場(chǎng)合的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[39-41]。因此，研究檢測(cè)展青霉素的適配體傳感器具有重要意義。然而，適配體傳感器檢測(cè)展青霉素存在一個(gè)障礙，那就是食品或環(huán)境中殘存的展青霉素往往是微量，甚至是痕量的。一般情況下，樣品前處理過(guò)程會(huì)對(duì)待測(cè)物造成損失或稀釋，檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限需低于限量標(biāo)準(zhǔn)1個(gè)數(shù)量級(jí)才能保證對(duì)待測(cè)物的準(zhǔn)確檢測(cè)。

Wu等[42]通過(guò)氧化石墨烯輔助的指數(shù)富集（systemic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）過(guò)程，篩選得到與展青霉素特異性結(jié)合的、高親和力適配體。在候選適配體中，PAT-11序列與展青霉素結(jié)合，親和力更高，選擇性更好，解離常數(shù)（kd）為（21.83±5.02）nmol/L。氧化石墨烯（rGO-Fe3O4）吸附后導(dǎo)致羧基熒光素（carboxyfluorescein，F(xiàn)AM）熒光淬滅，在展青霉素存在時(shí)，適配體與靶標(biāo)結(jié)合，使熒光恢復(fù)。DNase I不能水解rGO-Fe3O4上的適配體，但能夠水解未吸附的適配體-展青霉素復(fù)合體，釋放FAM和展青霉素，引發(fā)循環(huán)放大。rGO-Fe3O4吸附適配體后經(jīng)磁分離，可以降低背景信號(hào)干擾，顯著降低檢測(cè)限[42]。

生物傳感器的靈敏度通常依賴于目標(biāo)分析物濃度與信號(hào)之間建立的關(guān)系。只有單一信號(hào)輸出的熒光傳感器，基于檢測(cè)信號(hào)增高或檢測(cè)信號(hào)降低，有可能出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的檢測(cè)結(jié)果。而具有兩個(gè)檢測(cè)信號(hào)的比率型傳感器則可克服單一信號(hào)輸出的不足。靶分子的存在會(huì)引起一種熒光基團(tuán)信號(hào)增強(qiáng)，另一種熒光信號(hào)降低。該策略不僅可提高檢測(cè)靈敏度，還可增強(qiáng)特異性[43]。比率型熒光探針可以消除探針自身的不穩(wěn)定性，也可以削弱檢測(cè)環(huán)境帶來(lái)的誤差。例如Ahmadi等[40]利用FAM和羧基四甲基羅丹明（carboxytetramethylrhodamine，TAMRA）標(biāo)記的DNA構(gòu)建了展青霉素比率傳感器，F(xiàn)AM與TAMRA在490 nm激發(fā)下發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fuorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）現(xiàn)象，不僅避免了環(huán)境信號(hào)干擾問(wèn)題，而且提高了傳感器的靈敏度。通過(guò)DNA序列的精準(zhǔn)設(shè)計(jì)，進(jìn)一步提高了適體傳感器的靈敏度。在Zhang等[44]的最新研究中，聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子、酶輔助鏈置換信號(hào)放大和磁分離技術(shù)結(jié)合，相比Ahmadi等[40]的研究，靈敏度更高，檢測(cè)限達(dá)到0.042 ng/L。與商品化DNA標(biāo)記染料相比，TTAPE穩(wěn)定性更好，結(jié)合鏈置換信號(hào)放大和磁分離技術(shù)，使該傳感器成功應(yīng)用于蘋(píng)果和葡萄汁中展青霉素的檢測(cè)。Wu等[39]提出了一種新的基于FRET的展青霉素測(cè)定方法。稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料（upconversion nanoparticles，UCNPs）作為熒光供體，金納米顆粒（gold nanoparticles，AuNPs）作為熒光受體，適配體修飾在UCNPs表面，互補(bǔ)鏈pcDNA修飾在AuNPs表面，將二者孵育得到UCNPs-AuNPs復(fù)合結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致上轉(zhuǎn)換發(fā)光的猝滅。展青霉素存在時(shí)適配體與pcDNA解離，熒光恢復(fù)，通過(guò)熒光信號(hào)的差異實(shí)現(xiàn)展青霉素的定量檢測(cè)。采用核酸外切酶催化的靶循環(huán)策略，提高了FRET系統(tǒng)的靈敏度。分析過(guò)程僅需要50 min[45]。

電化學(xué)適配體傳感器是通過(guò)將適配體直接或間接連接在導(dǎo)電襯底上而開(kāi)發(fā)的傳感器，電化學(xué)阻抗法，伏安法（循環(huán)伏安法、微分脈沖伏安法、方波伏安法、線性掃描伏安法）和場(chǎng)效應(yīng)晶體管是最常見(jiàn)的檢測(cè)手段。電化學(xué)適配體傳感器具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快和成本低的特點(diǎn)，能在復(fù)雜體系中進(jìn)行在線連續(xù)監(jiān)測(cè)，廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生命科學(xué)、食品和環(huán)境等領(lǐng)域[45]。在大多數(shù)情況下，首先對(duì)電極表面進(jìn)行功能化，以使適量的適配體結(jié)合，并改善電子轉(zhuǎn)移特性[46]。納米材料和納米復(fù)合材料已被用于增加電活性區(qū)域，增加適配體的負(fù)載量。展青霉素適配體傳感器示意圖如圖2所示，將殼聚糖-氧化鋅-納米花修飾電極上，電沉積法將金納米顆粒AuNPs修飾在納米花表面，通過(guò)Au-S鍵連接互補(bǔ)單鏈DNA，適配體修飾的多孔金屬有機(jī)框架@亞甲基藍(lán)作為信號(hào)探針。由于氧化鋅納米花具有較大的比表面積，電極可以加載更多的信號(hào)探針和AuNPs來(lái)實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大[46]。展青霉素與適配體結(jié)合釋放互補(bǔ)單鏈DNA和信號(hào)探針，導(dǎo)致電信號(hào)降低。此傳感器具有可重復(fù)性、可再生性、長(zhǎng)期穩(wěn)定性和特異性的優(yōu)點(diǎn)[47]。Xu等[48]用黑磷納米片（black phosphorus nanosheets，BPNS） 對(duì)玻碳電極 （glassy carbon electrode，GCE）進(jìn)行修飾，靜電吸附展青霉素適配體。展青霉素與適配體結(jié)合，阻礙電極表面的電子轉(zhuǎn)移，為了提高傳感器的性能，用金納米顆粒對(duì)BPNSGCE進(jìn)行了進(jìn)一步的修飾，然后用巰基修飾適配體對(duì)其進(jìn)行修飾。修飾后的電極用于展青霉素檢測(cè)，具有更寬的線性范圍（0.1 nmol/L～10.0 μmol/L）和更低的檢測(cè)限（0.03 nmol/L）。

圖2 展青霉素適配體傳感器示意圖Fig.2 Schematic representation based aptamer sensor for DAT detection

目前篩選得到的展青霉素適配體序列較少，在穩(wěn)定性與親和力等方面仍需加強(qiáng)研究。在檢測(cè)食物樣品中展青霉素時(shí)，檢測(cè)體系中的基質(zhì)會(huì)影響適配體特異性和標(biāo)記染料的穩(wěn)定性。通過(guò)簡(jiǎn)化的樣品制備過(guò)程來(lái)降低基質(zhì)效應(yīng)，適配體與穩(wěn)定易標(biāo)記的納米材料相融合，是展青霉素適配體傳感器面臨的挑戰(zhàn)和今后發(fā)展的趨勢(shì)。近年來(lái)分子印跡材料和適配體技術(shù)有力推動(dòng)了展青霉素檢測(cè)方法，常見(jiàn)檢測(cè)方法如表1所示。

表1 近年基于分子印跡材料和適配體的展青霉素檢測(cè)方法匯總Table 1 Summary of patulin detecting methods based on MIPs or aptamer in recent years

4 前景與展望

傳統(tǒng)檢測(cè)方法中通常會(huì)遇到雜質(zhì)干擾等問(wèn)題，需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理，從而獲得更準(zhǔn)確的定性和定量信息。前處理方法通常包括液液萃取、固相萃取和QuEChERS，基于先進(jìn)納米材料的固相微萃取和磁性納米材料可以減少有機(jī)溶劑使用量、簡(jiǎn)化處理過(guò)程，有望成為未來(lái)固相萃取的理想手段。展青霉素分子印跡技術(shù)的建議合成方法、低毒材料的合成，分離和傳感的作用機(jī)理研究仍需不斷探索。分子印跡材料在水相中的展青霉素識(shí)別存在一定困難，需要加強(qiáng)在水相中的應(yīng)用。適配體傳感器具有特異性好、制備過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)多種場(chǎng)合的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。但目前展青霉素適配體序列較少，在穩(wěn)定性與親和力等方面仍需加強(qiáng)研究。在檢測(cè)食物樣品中展青霉素時(shí)，檢測(cè)體系中的基質(zhì)會(huì)影響適配體特異性和標(biāo)記染料的穩(wěn)定性。通過(guò)簡(jiǎn)化的樣品制備過(guò)程來(lái)降低基質(zhì)效應(yīng)，適配體與穩(wěn)定易標(biāo)記的納米材料相融合，是展青霉素適配體傳感器面臨的挑戰(zhàn)和今后發(fā)展的趨勢(shì)。

當(dāng)前，復(fù)雜食品基質(zhì)中展青霉素的檢測(cè)朝著準(zhǔn)確、快速、環(huán)保和高通量的方向發(fā)展，相信隨著納米技術(shù)、適配體和DNA技術(shù)的發(fā)展，未來(lái)分子印跡材料和適配體將在展青霉素樣品前處理和檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮更加積極的作用。