鯪魚糜致腐微生物分離及其復(fù)合生物防腐劑研究

柏建玲，王惠惠，蔡淑珍，莫樹平，楊小鵑，何瑩龍，蘇悅，吳清平

（廣東省科學(xué)院微生物研究所華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室廣東省微生物安全與健康重點實驗室，廣東廣州510070）

魚類含有豐富的蛋白質(zhì)且肉質(zhì)細(xì)膩，在貯藏、運(yùn)輸、加工及銷售過程中極易腐敗變質(zhì)，從而導(dǎo)致資源浪費和環(huán)境污染[1-2]。鯪魚（Cirrhinus molitorella）是廣東省大宗淡水養(yǎng)殖產(chǎn)品，它具有生長快、養(yǎng)殖成本低、產(chǎn)量大、肉質(zhì)細(xì)嫩、營養(yǎng)豐富等特點。鯪魚個體小、骨刺多，因此一般被制作成魚糜、魚丸等產(chǎn)品銷售[3-4]。國內(nèi)外學(xué)者通過對水產(chǎn)食品腐敗微生物研究發(fā)現(xiàn)，水產(chǎn)食品所含微生物中只有部分微生物參與腐敗過程，因此提出了特定腐敗菌的概念，特定腐敗菌的生長繁殖在很大程度上起著主導(dǎo)腐敗變質(zhì)的作用[5-7]。魚類防腐保鮮主要通過低溫冷凍和添加化學(xué)防腐劑，低溫冷凍成本高且影響產(chǎn)品品質(zhì)，化學(xué)防腐劑存在嚴(yán)重安全隱患[8-9]。而多數(shù)魚肉產(chǎn)品天然生物防腐劑仍處于研究階段[10]。

ε-聚賴氨酸（ε-polylysine，ε-PL）是一種天然防腐劑，具備廣譜、水溶性及穩(wěn)定性好等優(yōu)點，我國已批準(zhǔn)其在部分食品中使用[11-13]。將具備抑菌效果的物質(zhì)按照一定比例復(fù)配使用，可以提高水產(chǎn)品及其制品的保鮮效果[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，將乙二胺四乙酸二鈉、乳酸鏈球菌素（Nisin）和納他霉素復(fù)合使用，可抑制水產(chǎn)品中革蘭氏陰性菌的生長[16-17]；此外，利用殼聚糖成膜特性，與ε-聚賴氨酸復(fù)合使用可以延長南美對蝦的儲存期[18]。關(guān)于復(fù)合生物防腐劑的研究報道較多，然而復(fù)配劑在食品防腐中所起的作用未引起人們的足夠重視，且針對其防腐增效機(jī)理和抑菌譜擴(kuò)展機(jī)理缺乏系統(tǒng)的研究[19-23]。因此，本文應(yīng)用微生物學(xué)方法從鯪魚魚糜中分離腐敗微生物，將其作為研究對象，應(yīng)用ε-聚賴氨酸和不同增效劑進(jìn)行抑菌試驗研究，篩選最佳配比控制水產(chǎn)品中腐敗微生物的生長，以達(dá)到防腐保鮮、延長食物貨架期的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

鯪魚魚糜：市售，放置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?；?聚賴氨酸：浙江新銀象生物工程有限公司；甘氨酸（生物試劑，99%）、L-丙氨酸（生物試劑，98.5%）：上海源葉生物科技有限公司；L-蘋果酸（生物試劑，98%）：大連美侖生物技術(shù)有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraa-cetic acid disodium salt，EDTA-2Na）、乳酸鈉、檸檬酸鈉（分析純）：廣州化學(xué)制劑廠；肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 試驗菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC2593）、銅綠假單胞菌（Pseudmonas aeruginosa CMCC10104）、大腸桿菌（Escherichia coli ATCC25922）：廣東省科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心提供；庫爾特氏桿菌（Kurthia gibsonii YB12）、小穗葡萄球菌（Staphylococcus sciuri YB13）、溶酪大球菌（Macrococcus caseolyticus YM14）、黃體微球菌（Micrococcus luteus YM31）、喜馬偕爾邦考克氏菌（Kocuria himachalensis YM35）：廣東省科學(xué)院微生物研究所微生物安全與健康中心實驗室分離鑒定保存。

1.3 致腐微生物分離鑒定方法

輕度腐敗的鯪魚魚糜樣品均質(zhì)處理后，采用稀釋平板分離法，取0.1 mL菌懸液分別稀釋后（10-1、10-2、10-3）涂布于肉湯培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48 h。對分離得到的單菌落通過菌株培養(yǎng)特征、生理生化試驗及16S rRNA分子鑒定法進(jìn)行鑒定。

1.4 增效劑篩選

1.4.1 復(fù)合生物防腐劑配制

選擇7種可能對生物防腐劑具有增效作用的增效劑進(jìn)行篩選試驗，將增效劑按照比例分別與ε-PL復(fù)配形成復(fù)合生物防腐劑，具體配方為配方1（ε-PL0.5g/kg、EDTA-2Na 0.5 g/kg）、配方 2（ε-PL 0.5 g/kg、檸檬酸鈉0.5 g/kg）、配方 3（ε-PL 0.5 g/kg、L-丙氨酸 0.5 g/kg）、配方4（ε-PL 0.5 g/kg、甘氨酸 0.5 g/kg）、配方 5（ε-PL 0.5g/kg、L-蘋果酸0.5g/kg）、配方 6（ε-PL0.5g/kg、乙酸鈉 0.5g/kg）、配方 7（ε-PL 0.5 g/kg、乳酸鈉 0.5 g/kg），CK1（空白）、CK2（0.5 g/kg ε-PL）。通過防腐試驗，篩選最佳螯合增效劑及合適濃度。

1.4.2 復(fù)合生物防腐劑的抑菌測定

復(fù)合生物防腐劑對試驗菌株的抑菌測定采用牛津杯法。配制培養(yǎng)基，倒平板，制備指示菌菌懸液，取適量指示菌菌懸液涂布于指示菌平板上，放置牛津杯，分別添加125 μL1.4.1配制好的7種復(fù)合生物防腐劑及 CK1、CK2，在 30 ℃條件下培養(yǎng) 24 h～72 h，觀察結(jié)果，測量并記錄抑菌圈直徑。

TWEAK上游引物5′-ATCGCAGCCCATTATGAAGT-3′、下游引物 5′-GAAGAGTCCGAAGTAGGTGAGG-3′，p38MAPK 上游引物 5′-TCGAGACCGTTTCAGTCCAT-3′、下游引物5′-CCACGGACAAATATCCACT-3′，GAPDH上游引物5′-ATCACCATCTTCCAGGAGCGA-3′、下游引物5′-CCTTCTCCATGGTGGTGAAGA-3′均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 鯪魚魚糜防腐應(yīng)用試驗

1.5.1 鯪魚魚糜防腐處理方法

分別將復(fù)合生物防腐劑添加至鯪魚魚糜樣品中，不添加復(fù)合生物防腐劑作為對照組。經(jīng)過處理的魚糜樣品放置在4℃冰箱進(jìn)行貯藏試驗，每天取樣測定揮發(fā)性鹽基氮和菌落總數(shù)。每個處理重復(fù)3次。復(fù)合生物防腐劑配制見表1。

表1 復(fù)合生物防腐劑配制Table 1 Compound bio-preservation preparation

1.5.2 檢測項目

揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）：按照GB 5009.228—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮》方法進(jìn)行測定；菌落總數(shù)：按照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)》方法進(jìn)行測定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有結(jié)果均使用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用SigmaPlot 12.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鯪魚魚糜致腐微生物的分離鑒定

從市售的鯪魚魚糜中分離致腐微生物9株，將菌株 編 號 為 YB12、YM15、YB13、YM13、YM14、YM31、YM35、YM32、YM36，菌落形態(tài)見圖 1。

圖1 鯪魚魚糜致腐微生物的菌落形態(tài)Fig.1 The colony morphology of mud carp surimi spoilage microorganisms

從圖1可以看出，分離篩選致腐微生物主要為細(xì)菌，菌落形狀均為圓形，具有光澤，菌落表面呈隆起狀。菌落邊緣呈圓潤光滑狀，菌落不透明，顏色主要為黃色和乳白色。

表2 鯪魚魚糜致腐微生物鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of spoilage microorganisms in mud carp surimi

如表2所示，分離鑒定了9株優(yōu)勢腐敗菌，分別為YB12、YM15、YB13、YM13、YM14、YM31、YM35、YM32、YM36。其中革蘭氏陽性菌6個，占66.7%；革蘭氏陰性菌3個，占33.3%。

2.2 增效劑的篩選

根據(jù)鯪魚魚糜優(yōu)勢致腐微生物鑒定結(jié)果，選擇分離鑒定的 5 株優(yōu)勢致腐微生物：YB12、YB13、YM14、YM31、YM35和3株標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC2593）、銅綠假單胞菌（Pseudmonas aeruginosa CMCC10104）、大腸桿菌（Escherichia coli ATCC25922）作為指示菌，進(jìn)行生物防腐劑ε-PL增效劑的篩選。將7種增效劑分別與ε-PL復(fù)配，測試其對指示菌的抑制情況，測量并記錄抑菌圈直徑，結(jié)果見圖2。

圖2 螯合增效劑分別與ε-聚賴氨酸復(fù)合對指示菌的抑制作用結(jié)果Fig.2 The results of the inhibitory effects of synergist agent compounded with ε-polylysine on indicator bacteria

由圖2可知，L-丙氨酸、甘氨酸、L-蘋果酸對ε-PL具有較強(qiáng)的增效作用，與ε-PL形成的復(fù)合生物防腐劑對魚糜中幾種指示菌及標(biāo)準(zhǔn)菌株均有不同程度的抑制作用，復(fù)合生物防腐劑可能破壞了指示菌細(xì)胞膜的完整性，引起細(xì)胞膜的通透性增加，造成胞內(nèi)物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)等成分泄漏，細(xì)胞凋亡率增加，從而達(dá)到抑菌效應(yīng)。根據(jù)試驗結(jié)果，結(jié)合對魚肉風(fēng)味的影響，選取L-丙氨酸、甘氨酸、L-蘋果酸3種增效劑進(jìn)行后續(xù)試驗研究。

2.3 復(fù)合生物防腐劑對鯪魚魚糜致腐微生物抑菌試驗

通過最佳配方研究獲得復(fù)合生物防腐劑配方2個（1#、2#），以本實驗室分離保存的3株標(biāo)準(zhǔn)菌株及分離的5株鯪魚魚糜優(yōu)勢致腐微生物為指示菌，測定復(fù)合生物防腐劑的抑菌效果見圖3。

圖3 研制復(fù)合生物防腐劑對分離冷鮮魚致腐微生物抑制效果Fig.3 The inhibitory effects of the developed compound biological preservation on the decaying microorganisms of separated chilled fish

由圖3可知，2種復(fù)合生物防腐劑對3株標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離的5株冷鮮魚優(yōu)勢致腐微生物菌株均具有較好的抑制作用，抑菌效果明顯優(yōu)于單獨使用ε-聚賴氨酸。

2.4 樣品菌落總數(shù)的測定

鯪魚魚糜樣品經(jīng)復(fù)合生物防腐劑處理后，4℃冰箱貯藏過程中菌落總數(shù)變化見圖4。

圖4 魚糜樣品菌落總數(shù)變化情況Fig.4 Changes in the total number of colonies of mud carp surimi

由圖4可知，隨著貯藏時間的增加，CK1與CK2組的魚糜樣品菌落總數(shù)均呈現(xiàn)上升趨勢；CK1在第7天時菌落總數(shù)達(dá)到 7.40 lg（cfu/g），而添加 1#、2# 復(fù)合生物防腐劑的魚糜樣品在貯藏前7 d菌落總數(shù)整體均處于一個較低的水平。魚糜樣品貯藏至第10天，1#、2#處理組菌落總數(shù)出現(xiàn)明顯的上升，分別為6.79 lg（cfu/g）和5.43 lg（cfu/g）。結(jié)果表明，2#復(fù)合生物防腐劑處理的魚糜樣品菌落總數(shù)均最低，防腐效果最好。

2.5 樣品揮發(fā)性鹽基氮的測定

揮發(fā)性鹽基氮是評價魚肉鮮度的主要指標(biāo)，魚糜在貯藏過程中，微生物和酶會引起蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生氨以及胺類等含氮物質(zhì)，其含量越高，表明氨基酸被破壞的越多，魚糜腐敗程度越為嚴(yán)重[21]。各處理組中揮發(fā)性鹽基氮含量如圖5所示。

圖5 魚糜樣品揮發(fā)性鹽基氮變化情況Fig.5 Changes of volatile based nitrogen in mud carp surimi

由圖5可知，隨著貯藏時間的增加，對照組與添加復(fù)合生物防腐劑的魚糜樣品揮發(fā)性鹽基氮均呈現(xiàn)上升趨勢；添加1#和2#復(fù)合生物防腐劑的魚糜樣品揮發(fā)性鹽基氮含量整體均低于CK1和CK2，與魚糜樣品菌落總數(shù)變化情況趨勢一致。其中，2#處理魚糜樣品中揮發(fā)性鹽基氮含量在第8天時為25.42 mg/100 g，而對照組CK1達(dá)到32.35 mg/100 g，表明ε-PL、甘氨酸、L-蘋果酸復(fù)配使用能明顯抑制腐敗菌的生長，延長魚糜產(chǎn)品的貯藏時間。

3 結(jié)論

鯪魚魚糜具有肉質(zhì)細(xì)嫩、營養(yǎng)豐富、水分含量高等特點，在貯藏、運(yùn)輸、加工處理及銷售過程中極易腐敗變質(zhì)，從而導(dǎo)致資源浪費和環(huán)境污染。本文采用微生物學(xué)方法從魚糜中分離篩選出9株優(yōu)勢致腐微生物，通過分子鑒定，造成魚糜腐敗多為革蘭氏陽性菌。應(yīng)用不同生物增效劑與ε-PL復(fù)配使用，研究復(fù)合生物防腐劑對3種標(biāo)準(zhǔn)菌株及5株優(yōu)勢致腐微生物菌株的抑菌效應(yīng)，通過篩選優(yōu)化復(fù)配劑，采用ε-PL、甘氨酸、L-蘋果酸復(fù)配使用能明顯抑制致腐微生物的生長，降低貯藏期間魚糜中菌落總數(shù)及游離氨基氮的產(chǎn)生。本研究為延長魚糜的貯藏時間，為魚糜的保鮮技術(shù)應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。