EB病毒血清免疫球蛋白A檢測在鼻咽癌篩查中的應用△

龔一帆 唐冰花 宋新貌 湯荔 王朱健 曹文俊

（1.復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院檢驗科 上海 200031；2.復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院放療科 上海 200031）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是源于鼻咽部上皮組織的一種頭頸部惡性腫瘤，大部分患者發(fā)現(xiàn)時已為晚期，預后較差。全世界約80%的NPC 患者在中國，早期診斷、早期治療是提高NPC患者生存率及降低死亡率的重要手段。然而NPC早期癥狀隱匿，容易被誤診、漏診[1]。大量研究表明，EB 病毒感染及其導致的一系列表觀遺傳學改變與NPC 發(fā)病有著密切關系[2-3]，聯(lián)合多項EB 病毒抗體檢測對NPC 的診斷有臨床意義[4-6]；然而各方報道在項目組合及結果解讀上仍存在爭議，并缺少大樣本、多中心的臨床研究。本研究通過酶聯(lián)免疫 吸 附 測 定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測662 例初診NPC 患者和731 例健康成人血清中EB 病毒的免疫球蛋白A（immunoglobulin A,IgA）抗體，包括Z 反式激活因子（Z trans activator,Zta）/IgA、EB 病毒核抗原1（EB virus nuclear antigen 1,EBNA1）/IgA、衣殼抗原（viral capsid antigen,VCA）/IgA，總結并分析EB 病毒IgA 不同結果模式對NPC診斷的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 資料 NPC 組：2016～2019 年在我院就診、經(jīng)鼻咽活檢病理確診、未經(jīng)治療的NPC 患者662 例，年齡12～88 歲，平均53.34 歲，中位年齡為55 歲；男性471 例、女性191 例。健康對照組：同期健康體檢人群731 例，其中男性475 例、女性256 例；年齡18～76 歲，平均44.27 歲，中位年齡為43 歲。臨床篩查組：同期因有NPC 癥狀，來我院就診排除NPC 的患者157 例，男性96 例、女性61 例；年齡12～86 歲，平均48.46 歲，中位年齡為47 歲。3組患者的性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究遵循《赫爾辛基宣言》的原則。本研究的設計和實施經(jīng)我院倫理委員會批準，所有研究對象均已簽署知情同意書。

1.2 方法 采集患者靜脈血4 mL 于真空管中，30 min 凝固后以3 000 轉/min 離心10 min，之后分離血清標本檢測。Zta/IgA、EBNA1/IgA 抗體檢測試劑盒購自中山生物有限公司，VCA/IgA 抗體檢測試劑盒購自歐蒙（德國）醫(yī)學實驗診斷股份有限公司。均采用ELISA 檢測，根據(jù)試劑說明書進行操作。酶標儀型號為Tecan（瑞士）貿(mào)易有限公司Sunrise 酶標儀?？贵w水平以標本吸光度（optical density，OD）值/ Cutoff 值計算相對吸光度值表示。相對吸光度值大于診斷界值時定為陽性，低于或等于診斷界值時為陰性。

1.3 統(tǒng)計學處理 本研究應用GraphPad Prism 5 繪制受試者操作特征（receptor operation characteristic，ROC）曲線，MedCalc14 及軟件進行t檢驗及卡方檢驗，以ROC 曲線計算出最佳診斷界值，并計算各抗體的敏感度、特異度、約登指數(shù)及曲線下面積（area under the curve,AUC）。

2 結果

NPC 患者血清中Zta/IgA、EBNA1/IgA、VCA/IgA 3種抗體的水平分別為3.344±3.422、3.674±2.746、5.676±3.889，健康人群中3 種抗體的水平分別為0.165±0.395、0.318±0.627、0.709±0.835，NPC 患者EB 病毒抗體水平均顯著高于健康對照組（P值均＜0.001）。3 種抗體的ROC 曲線見圖1。3 種抗體根據(jù)ROC 曲線計算出的最佳臨界值，靈敏度、特異度、約登指數(shù)、AUC 及陽性預測值比較見表1。

圖1 NPC患者3種抗體ROC曲線 A.Zta/IgA；B.VCA/IgA；C.NA1/IgA。

表1 NPC患者3種抗體的最佳臨界值、靈敏度、特異度、約登指數(shù)及AUC比較

EB 病 毒Zta/IgA、EBNA1/IgA、VCA/IgA 3 種抗體組合的8 種不同結果模式在健康對照組、NPC組及臨床篩查組中出現(xiàn)的比例見表2。可以看出：NPC 組出現(xiàn)單獨1 種抗體陽性結果模式的比例顯著低于健康對照組，而2 種或3 種抗體陽性的結果比例顯著高于健康對照組，3 種抗體全陽的結果模式在NPC 組中出現(xiàn)的概率最高，可達74.77%，而健康對照組則只有6 例，全陽的結果模式有著最高的陽性預測值率，達98.82%。臨床篩查組中，除單獨Zta/IgA、EBNA1/IgA 及Zta/IgA+EBNA1/IgA 陽性的 結果模式，其他模式比例均高于健康對照組。

表2 各抗體結果模式在健康對照組、NPC組及臨床篩查組中出現(xiàn)的比例[n（%）]

157 例臨床篩查組的Zta/IgA、EBNA1/IgA、VCA/IgA 陽性率分別為24.84%，29.93%和40.76%，顯著高于健康對照組，低于NPC 組（P＜0.0001），其中有42 例患者進行了病理活檢，最終確診17 例。42 例抗體結果為全陰的患者有12 例，無NPC 病理結果；單抗體陽性13 例，有4 例病理確診NPC；9例雙抗體陽性的患者中，有5 例病理診斷NPC；8 例 3 種抗體全陽的患者最終均經(jīng)病理確診為NPC。

3 討論

有文獻[7]報道，NPC 經(jīng)放射化學治療（簡稱放化療）后，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的5 年無復發(fā)生存率分別為95.7%、64.7%、54.5%、41.1%，認為早期診斷及對高危人群的跟蹤隨訪是提高NPC 治愈率,獲得良好預后的關鍵。作為診斷金標準的病理檢查往往由于受病程、病變部位及采樣因素的影響，而無法早期確診。在世界衛(wèi)生組織（WHO）的NPC 專著中，有研究[8]認為組合應用ELISA 血清學可輔助診斷NPC，并在國內(nèi)得到證實。然而，90%以上的世界人口存在EBV 的潛伏感染[9]，造成EB 病毒抗體血清檢查在NPC 的篩查中存在相當比例的假陽性及假陰性，進而引起臨床醫(yī)師及患者的疑慮[10]。因此，如何選擇高靈敏度及特異度的抗體組合并對結果進行準確分析及判斷，幫助臨床更準確地評估疾病風險成為目前急需解決的問題。

EB 病毒感染宿主后，多數(shù)細胞中的DNA 病毒處于潛伏狀態(tài)，并合成EBNA1，部分病毒可進入溶解感染期，最終宿主細胞裂解，病毒顆粒釋放，細胞合成溶解早期蛋白Zta、溶解晚期合成VCA 等相關蛋白[11-12]，這些抗原與免疫系統(tǒng)反應產(chǎn)生相應抗體。由于IgA抗體與IgG相比具有更短的血清半衰期，因此我們分析不同人群中EB 病毒Zta/IgA、EBNA1/IgA、VCA/IgA 3 種抗體的結果模式來研究3 種抗體聯(lián)合檢測對于NPC 診斷的臨床意義。結果顯示，3種抗體均具有較好的特異度、靈敏度、約登指數(shù)、AUC 及陽性預測值，與國內(nèi)采用相同方法學的研究結果一致[13-15]。我們通過大樣本研究進一步證實了3 種抗體對于NPC 具有較高的診斷效能，認為3 種抗體與NPC 患者EB 病毒各感染期活躍的免疫應答密切相關，是NPC 血清學診斷的可靠指標。

3 種抗體聯(lián)合檢測的各種結果模式在NPC 組及健康對照組中出現(xiàn)的比例均存在顯著差異（P值均＜0.05）。所有的單抗體陽性模式在健康對照組中出現(xiàn)的比例較NPC 組高，而2 種或3 種抗體陽性的結果模式則更多出現(xiàn)在NPC 組中，提示EB 病毒感染在NPC 患者中存在著與正常人群截然不同的免疫反應。我們發(fā)現(xiàn)，662 例NPC 患者中3 種抗體全陽的結果模式占74.77%，而731 例健康對照人群中僅有6 例，陽性預測值可達98.82%，即3 種抗體陽性的樣本中98.82%為確診NPC 患者。結果表2 中雙抗體陽性的陽性預測值為64.29%～84.78%，單抗體陽性結果模式的陽性預測值較低，為10.81%～24.66%，而3 種抗體全陰的患病風險僅為1.42%。在臨床篩查組中也有相同的表現(xiàn)，抗體陽性數(shù)越多，病理確診率越高，證實聯(lián)合檢測3 種EB 病毒IgA 抗體，可以有效提高疾病診斷的準確性，與單獨抗體檢測相比具有更高的特異度、靈敏度及陽性預測值，通過結果模式的分析可以幫助臨床進行風險分級，對高危人群進行跟蹤隨訪，有助于疾病的早期診斷。

由于我們的研究只檢測EB 病毒相關抗體，因此檢測結果容易受到個體免疫因素或EB 病毒免疫逃避機制的影響。此外，一些病理類型的NPC 與EB 病毒關系不密切[16]，也影響了抗體檢測對診斷的靈敏度。在抗體全陰性的6 例NPC 患者中有2 例病理分型為中低分化型鱗癌，1 例在治療后隨訪出現(xiàn)抗體陽性。這是由于大部分情況下抗體早于病變出現(xiàn)，但是免疫逃避使得抗體出現(xiàn)滯后于病變，因此需要進一步研究與其他腫瘤相關標志物的聯(lián)合檢測來提高診斷的準確性。

EB 病毒Zta/IgA、EBNA1/IgA、VCA/IgA 3 種抗體聯(lián)合檢測方法簡便、經(jīng)濟，相對于EB 病毒DNA檢測更易于推廣，可進行大樣本的篩查，并幫助臨床更好地評估疾病風險，有助于NPC 的早期診斷。