甘肅省慶陽(yáng)市辣椒鐮孢菌根腐病病原鑒定及生物學(xué)特性

連蕓蕓，李煥宇，李惠霞，姜偉，李金鴻，石明明，韓變

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

辣椒(CapsicumannuumL.)是茄科辣椒屬植物，原產(chǎn)于中拉丁美洲熱帶地區(qū)，現(xiàn)于世界各國(guó)普遍種植[1-2]，既可作調(diào)料、蔬菜和觀賞植物，還可用作藥物、天然色素、化妝品和驅(qū)蟲劑活性成份的提取原料[3].辣椒根腐病是一種常見的土傳病害[4]，在國(guó)外已有報(bào)道[5]，國(guó)內(nèi)自20世紀(jì)50年代俞大紱首次報(bào)道以來(lái)[6]，現(xiàn)已遍及全國(guó).已報(bào)道的辣椒根腐病致病菌有鐮孢屬[7]、疫霉屬[8]和腐霉屬[9]等，其中鐮孢菌是引起辣椒根腐病的主要病原菌.由鐮孢菌引起的辣椒根腐病發(fā)生周期長(zhǎng)，在幼苗期及生長(zhǎng)期均能發(fā)生，主要侵染辣椒根及根莖部，導(dǎo)致辣椒減產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失.鐮孢菌產(chǎn)生的毒素等次生代謝產(chǎn)物可引起人畜中毒，嚴(yán)重時(shí)甚至造成死亡[10].郝蓉蓉等[11]發(fā)現(xiàn)引起西藏地區(qū)辣椒根腐病的鐮孢菌是尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporum)，蔡高磊等[12]報(bào)道了湖北省十堰市的辣椒根腐病是由茄鐮孢菌(F.solani)引起的，黃建都等[13]認(rèn)為茄鐮孢菌(F.solani)是福州地區(qū)辣椒根腐病的致病菌，但對(duì)甘肅省慶陽(yáng)市辣椒根腐病菌的研究尚未見報(bào)道.

本試驗(yàn)以慶陽(yáng)地區(qū)辣椒根腐病2株代表性菌株67R5c和68R5b為材料，通過(guò)致病性測(cè)定、基于形態(tài)學(xué)和翻譯延伸因子TEF-1α基因序列分析病原菌種類，并測(cè)定其生物學(xué)特性，為明確其病原菌組成和該病害的有效防治提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：菌株67R5c和68R5b保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病原真菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室.

供試培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，自來(lái)水1 L；WA培養(yǎng)基：瓊脂粉20 g，自來(lái)水1 L；CLA培養(yǎng)基：瓊脂粉20 g，自來(lái)水1 L，培養(yǎng)皿在倒入培養(yǎng)基前加入10～12片無(wú)菌康乃馨葉片(3～5 mm2)；查氏培養(yǎng)基：NaNO32.0 g，KCl 0.5 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，蔗糖30 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 L.

以上4種培養(yǎng)基在121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min后備用.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌純化 供試病原菌在PDA培養(yǎng)基上活化后，按常規(guī)方法在WA平板上單孢純化[14]，純化菌株保存于4 ℃冰箱備用.

1.2.2 病原菌致病性測(cè)定 采用改良平皿法[15]測(cè)定供試菌的致病性.將直徑5 mm菌餅接于WA培養(yǎng)基小燒杯中，蓋上滅菌鋁箔培養(yǎng)3 d.將發(fā)芽的辣椒種子均勻插入菌餅周圍，置于25 ℃光照培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)15 d后觀察發(fā)病情況.以相同條件下培養(yǎng)的辣椒為對(duì)照.試驗(yàn)重復(fù)3次，每重復(fù)15株.

1.2.3 形態(tài)學(xué)鑒定 菌株接種于PDA培養(yǎng)基后，置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d后觀察菌落性狀.菌株接種CLA培養(yǎng)基后，于25 ℃人工智能培養(yǎng)箱內(nèi)12 h，光照/黑暗交替培養(yǎng)，14 d后觀察形態(tài)特征，并拍照記錄.根據(jù)菌株形態(tài)特征進(jìn)行病原鑒定[16-18].

1.2.4 分子生物學(xué)鑒定 將菌株接種于PD培養(yǎng)液后，在(25±0.5)℃ 120 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)7 d，過(guò)濾菌液獲得菌絲.取新鮮菌絲100 mg，加入液氮后充分研磨后轉(zhuǎn)移至1.5 mL無(wú)菌離心管中，用試劑盒E.Z.N.A.TMHP Fugal DNA Kit(OMEGA)提取基因組DNA，用引物EF1(5′-ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3′)和EF2(5′-GGARGTACCAGTSATCATG-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[19].擴(kuò)增體系為25.0 μL：DNA模板1.0 μL、Taq酶0.25 μL、上下游引物各1.0 μL(10 μmol/L)、10×Buffer(Mg+)2.5 μL、dNTP(10 mM)0.5 μL，ddH2O 18.75 μL.PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行34個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸10 min.

電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物后，將有特異性條帶的PCR擴(kuò)增樣品送至北京擎科生物科技有限公司西安分公司測(cè)序.將獲得的序列校對(duì)拼接后，在GenBank中進(jìn)行BLAST搜索并下載相似度較高的序列，經(jīng)序列比對(duì)后用PAUP軟件以最大簡(jiǎn)約法(MP)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.2.5 病原菌生物學(xué)特性研究

1.2.5.1 不同培養(yǎng)溫度、光照條件對(duì)病原菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，接種后分別放置于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；放置于全光照、全黑暗、光暗交替(各12 h)的培養(yǎng)箱中25 ℃暗培養(yǎng).每處理3次重復(fù).病原菌培養(yǎng)5 d后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，培養(yǎng)12 d時(shí)，以每皿5 mL 0.1%吐溫洗脫孢子，采用血球計(jì)數(shù)板法測(cè)量病原菌產(chǎn)孢量.

1.2.5.2 不同碳、氮源對(duì)病原菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 稱取與蔗糖等量的葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇和淀粉制成Czapek培養(yǎng)基，以不加碳的為對(duì)照培養(yǎng)基.選用與硝酸鈉等量的硫酸銨、牛肉膏、蛋白胨、硝酸鉀和硝酸銨制成Czapek培養(yǎng)基，以不加氮的為對(duì)照培養(yǎng)基.將病原菌接種于不同碳氮源培養(yǎng)基后，25 ℃暗培養(yǎng).每處理重復(fù)3次.測(cè)定菌落直徑和產(chǎn)孢量同1.2.5.1.

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)用Excel 2010進(jìn)行整理，用SPSS 22.0進(jìn)行差異顯著性統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株的致病性

辣椒種子接種供試病原菌15 d后的發(fā)病情況如圖1所示.對(duì)照辣椒幼苗健康不發(fā)病，根部無(wú)任何癥狀.接種菌株68R5b的辣椒苗莖基部及根部有黑色或褐色病斑，后期呈水漬狀，辣椒葉片有萎蔫癥狀.接種菌株67R5c的辣椒幼苗莖基部有黑色或褐色病斑，病斑面積小，后期呈水漬狀.表明2個(gè)菌株均能侵染辣椒根部及莖基部，引起辣椒根腐，菌株68R5b致病力強(qiáng)于菌株67R5c.

A:對(duì)照;B:接種菌株為68R5b;C:接種菌株為67R5c.

2.2 病原形態(tài)特征

菌株68R5b在PDA平板上生長(zhǎng)較快，菌落平展，邊緣圓形，菌絲較稠密，菌落正反面淺紫色，菌絲稀疏呈卷毛狀；產(chǎn)孢細(xì)胞結(jié)構(gòu)為單瓶梗；大孢子數(shù)目多，1～6隔，大小為(16.1～39.7)μm×(3.5～6.3)μm，紡錘形，基胞足跟較尖，呈鉤狀；小孢子0～1隔，大小為(5.4～14.8)μm×(2.8～5.2)μm，橢圓形或卵形或腎形；厚垣孢子單生或串生，壁光滑(圖2).

A:菌落性狀;B:分生孢子;C:分生孢子梗;D:厚垣孢子.

菌株67R5c在PDA平板上生長(zhǎng)快，菌落平展，邊緣為毛狀，菌落正反面為白色或灰白色，菌絲稠密呈絮狀；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)為單瓶梗；大孢子數(shù)目多，1～5隔，大小為(16.9～30.0)μm×(3.3～5.5)μm，馬特型，兩端鈍，頂胞稍尖，基胞有圓形足跟；小孢子數(shù)目較多，0～1隔，大小為(6.1～14.9)μm×(2.2～4.3)μm，卵形或橢圓形或腎形；厚垣孢子單生或串生，壁粗糙(圖3).

A:菌落性狀;B:分生孢子;C:分生孢子梗;D:厚垣孢子.

2.3 病原菌系統(tǒng)發(fā)育分析

在基于TEF-1α序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中(圖4)，病原菌68R5b與數(shù)據(jù)庫(kù)中尖孢鐮孢菌(登錄號(hào)為DQ837693、AF008481、MT630354、KT239473、FJ985374等)序列相似度達(dá)99%以上，聚在同一支；病原菌67R5c與數(shù)據(jù)庫(kù)中茄鐮孢菌(登錄號(hào)為MN652888、MN152326、MN652893、MN650108等)序列相似度達(dá)99%以上，聚在同一支.結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定結(jié)果，將菌株68R5b鑒定為尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)，菌株67R5c鑒定為茄鐮孢菌(F.solani).

本試驗(yàn)中供試菌株以粗體字表示，//表示分支進(jìn)行了縮短，標(biāo)尺指示10步變化.

2.4 病原菌的生物學(xué)特性

2.4.1 培養(yǎng)溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 由表1可知，2種病原菌在40 ℃高溫和5 ℃低溫下幾乎不生長(zhǎng).尖孢鐮孢菌生長(zhǎng)適宜溫度范圍為25～30 ℃，最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃，菌落直徑達(dá)49.67 mm.茄鐮孢菌最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃，菌落直徑為59.00 mm，顯著高于其他溫度處理.在25 ℃時(shí)，尖孢鐮孢菌產(chǎn)孢最多，為13.92×106個(gè)/mL.在30 ℃時(shí)，茄鐮孢菌產(chǎn)孢最多，達(dá)到4.23×106個(gè)/mL，均顯著高于其他處理.40 ℃高溫條件下2種病原菌均不產(chǎn)孢，且低溫抑制病原菌產(chǎn)孢.

表1 培養(yǎng)溫度對(duì)供試病原菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

2.4.2 光照條件對(duì)病原菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 由表2可知，不同光照條件對(duì)尖孢鐮孢菌的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，全光照條件下菌落直徑最大，為42.67 mm，且產(chǎn)孢量最大，為4.91×106個(gè)/mL，顯著高于全黑暗和光暗交替.全黑暗條件下有利于茄鐮孢菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，菌落直徑為42.67 mm，產(chǎn)孢量為3.73×106個(gè)/mL，而全光照和光暗交替則不利于菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢.

表2 光照條件對(duì)供試病原菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

2.4.3 碳源對(duì)病原菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 2種病原菌在供試的6種碳源培養(yǎng)基上均生長(zhǎng)良好，而在對(duì)照培養(yǎng)基上菌絲非常稀疏或幾乎不生長(zhǎng)(表3).尖孢鐮孢菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的最適碳源分別是淀粉和蔗糖，菌落直徑為62.50 mm，產(chǎn)孢量為12.7×106個(gè)/mL，均顯著高于其他碳源培養(yǎng)基.茄鐮孢菌生長(zhǎng)的最適碳源是淀粉，菌落直徑為52.83 mm，其次為乳糖、甘露醇、麥芽糖和葡萄糖；產(chǎn)孢的最適碳源是葡萄糖和蔗糖，產(chǎn)孢量在2.51×106～2.71×106個(gè)/mL之間，與其他4種碳源培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量差異顯著.

表3 碳源對(duì)供試病原菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

2.4.4 氮源對(duì)病原菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 由表4可以看出，與對(duì)照相比，2種病原菌在供試的6種氮源培養(yǎng)基上均生長(zhǎng)良好.尖孢鐮孢菌生長(zhǎng)的最適氮源為蛋白胨，菌落直徑為57.00 mm，硝酸鈉次之，與其他4種氮源培養(yǎng)基差異顯著；氮源為硝酸鉀和蛋白胨時(shí)產(chǎn)孢量無(wú)顯著差異，平均產(chǎn)孢量為6.31×106～6.43×106個(gè)/mL，但顯著高于其他4種氮源培養(yǎng)的病原菌產(chǎn)孢量.茄鐮孢菌生長(zhǎng)的最適氮源是蛋白胨，菌落直徑為53.83 mm，顯著高于其他5種氮源；在硝酸銨、硝酸鈉、牛肉膏和蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上，產(chǎn)孢量差異不顯著，硝酸銨為氮源時(shí)產(chǎn)孢量最大，為3.65×106個(gè)/mL.

表4 氮源對(duì)供試病原菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

3 討論

鐮孢菌根腐類病是一類危害嚴(yán)重的真菌性病害，可侵染辣椒[20]、黃瓜[21]、番茄[22]和胡蘿卜[23]等蔬菜作物，其病原形態(tài)復(fù)雜且種類繁多，變異幅度大，僅以形態(tài)特征很難鑒定病原種類.因此，在形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上結(jié)合分子生物學(xué)鑒定鐮孢菌的方法已被廣泛應(yīng)用.胡蘭等[24]研究報(bào)道TEF-1α基因序列在鐮孢菌種水平上對(duì)親緣關(guān)系近的種有高分辨率，可以較好地表現(xiàn)鐮孢菌在種一級(jí)的關(guān)系；而且TEF-1α基因序列的通用引物易于設(shè)計(jì)、含有豐富的信息量并且還未發(fā)現(xiàn)不存在該基因序列的鐮孢菌類群[25]，本研究采用TEF-1α基因序列結(jié)合病原菌形態(tài)特征將供試病原菌鑒定為尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporum)和茄鐮孢菌(F.solani).

本試驗(yàn)結(jié)果表明2種鐮孢菌對(duì)辣椒均有致病性，但辣椒致病力存在差異，其中尖孢鐮孢菌致病力強(qiáng)于茄鐮孢菌，是引起辣椒根腐病的主要致病菌.方曉翠等[26]報(bào)道了新疆加工辣椒根腐病病原為尖孢鐮孢菌和茄鐮孢菌，尖孢鐮孢菌是優(yōu)勢(shì)菌的試驗(yàn)結(jié)果與本研究一致；張亭亭等[27]發(fā)現(xiàn)，尖孢鐮孢菌和串珠鐮孢菌是引起遼寧省辣椒根腐病的主要致病菌，表明地域環(huán)境、寄主品種、生態(tài)條件和土壤類型的不同，引起辣椒根腐病致病菌菌群和優(yōu)勢(shì)菌存在差異.

生物學(xué)特性的研究是病原菌的基礎(chǔ)研究，可為抗病育種和生物防治提供理論依據(jù).本研究結(jié)果顯示，引起辣椒根腐病的尖孢鐮孢菌和茄鐮孢菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢對(duì)溫度、光照、碳源和氮源需求都有一定的差異，表明這2種病原菌雖可同時(shí)存在于發(fā)病植株內(nèi)，但在不同的環(huán)境條件下，它們侵染寄主以及在寄主體內(nèi)的擴(kuò)展能力可能不同，亦或許是優(yōu)勢(shì)病原物種不同所致，對(duì)此還需要進(jìn)一步深入研究.

4 結(jié)論

本研究首次報(bào)道了發(fā)生在甘肅省慶陽(yáng)市的辣椒根腐病由尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)和茄鐮孢菌(F.solani)引起，致病性測(cè)定表明二者均為致病菌.生物學(xué)特性研究表明，2種病原菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢時(shí)對(duì)溫度、光照條件、碳源和氮源的需求存在差異.