玉竹多糖對油酸誘導的HepG2脂肪堆積的改善作用及作用機制研究*

肖作奇，邱盼子，歐陽波

（湖南省婦幼保健院，湖南 長沙 410008）

脂代謝的紊亂會引起甘油三酯在肝臟內異常堆積，脂質堆積已經(jīng)成為誘發(fā)肥胖、糖尿病及脂肪肝的主要原因之一。近年來，中藥對高脂飲食導致的能量穩(wěn)態(tài)失衡的治療作用逐漸成為降脂護肝領域的關注熱點[1-3]。玉竹是我國藥食同源目錄中的常用中藥，臨床廣泛用于糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）的防治，同時作為藥膳其對糖脂代謝也有很好的調節(jié)作用[4]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，玉竹有抗糖尿病活性，如玉竹多糖（polysaccharides of polygonatum，POP）有改善胰島素抵抗的功能[5-6]，玉竹提取物具有抗炎和免疫調節(jié)作用[7]，且玉竹在抗氧化、護肝、抗腫瘤等方面都有潛在藥用價值[8-9]。玉竹對糖尿病的藥效作用明確，但其作用機制沒有闡明，脂質代謝異?？赡苁钦T發(fā)2型糖尿病胰島素抵抗的主要因素之一，而目前玉竹多糖對于正常個體和肥胖個體脂代謝調節(jié)作用還鮮有報道。因此，研究玉竹多糖的降脂作用對開發(fā)降脂天然產(chǎn)物和指導肥胖人群預防糖尿病均有重要意義。本研究將人肝癌細胞（HepG2）作為模式生物對玉竹多糖的降脂活性及其作用機制進行探討。脂肪變性的HepG2細胞可能產(chǎn)生顯著的氧化應激損傷，并使炎癥反應通路激活[10-11]。本實驗通過評價細胞脂質積累程度，以及氧化應激指標超氧化物歧化酶（SOD）和活性氧（ROS）水平，基于NF-κB信號通路探究了玉竹多糖對油酸誘導的HepG2脂肪堆積的改善作用及其作用機制。

1 材 料

1.1 細胞 HepG2細胞（細胞編號：BNCC316757）購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院。

1.2 藥物與試劑 玉竹（批號：20170503）購于衡東縣中藥飲片廠，經(jīng)湖南省婦幼保健院潘濤副主任中藥師鑒定為Polygonatum odoratum（Mill.）Druce的干燥根莖。玉竹多糖由湖南省婦幼保健院藥學制劑部制備，制備方法參照文獻，多糖含量為87.9%[12]。洛伐他汀（Sigma-Aladdin，批號：E2014103）；DMEM（貨號：Gibco-1056904）、FBS（貨號：Gibco-10099141C）、0.25%胰酶消化液（貨號：Gibco-25200072）均購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司；總膽固醇（TC）檢測試劑盒（批號：2017S2KE1015）、甘油三酯（TG）檢測試劑盒（批號：2017S2KE1013）、ROS檢測試劑盒（批號：2017S2KEC1300-2）、SOD酶法檢測試劑盒（批號：2017S1KE2011）、BCA 法蛋白定量試劑盒（批號：2017S2KP1513）均購于北京普利萊基因技術有限公司；CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號：12189170716）；油紅O染色試劑盒（南京建成科技有限公司，批號：20160821）；S-PAGE凝膠制備試劑盒（武漢賽維爾生物科技，批號：SW2017770801）。

1.3 主要儀器 BIO-RAD iMark酶標儀（美國Bio-Red公司）；ICO型CO2培養(yǎng)箱（德國Memmert公司）；SW-CJ-2D超凈工作臺（蘇州凈化）；DP72奧林巴斯顯微成像系統(tǒng)（日本OLYMPUS公司）；D-37520高速離心機（Thermo Fisher Scientific）；iBrightTMCL750凝膠成像系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific）。

2 方 法

2.1 細胞培養(yǎng) 使用T25培養(yǎng)瓶復蘇HepG2細胞，細胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)箱環(huán)境：5%CO2，37 ℃，飽和濕度。細胞經(jīng)過1∶3傳代3次后，經(jīng)過0.25%胰酶-EDTA消化，用含5%FBS的DMEM重懸細胞并調節(jié)細胞密度至2×105/mL用于細胞實驗。12孔板接種1 mL/孔。96孔板接種100 μL/孔或200 μL/孔。

2.2 油酸誘導的脂肪堆積模型 將100 μL油酸與215 μL DMSO混合均勻后，用含1%BSA的DMEM稀釋混合液配制成含油酸10 mmol/L（含DMSO 0.68%）的母液備用。96孔板接種過夜后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，分別用含油酸（高、中、低濃度，根據(jù)油酸細胞毒性結果確定）的DMEM（含1% BSA，不含血清）孵育細胞24 h。用正常DMEM作為空白對照組。每組設置6孔。結合油酸細胞毒性試驗和甘油三酯檢測結果確認最佳造模濃度。

2.3 藥物處置及分組 將實驗設置為正常對照組、模型對照組、洛伐他汀組、玉竹多糖高劑量組、玉竹多糖低劑量組。采用96孔板實驗，每組設置6孔，每孔細胞2×104個。接種過夜后，去除培養(yǎng)基，PBS洗3次，正常對照組和模型對照組加DMEM 100 μL，洛伐他汀組加含0.2 mmol/L洛伐他汀DMEM 100 μL，玉竹多糖低劑量組加100 μg/mL玉竹多糖100 μL，玉竹多糖高劑量組加200 μg/mL玉竹多糖100 μL；孵育2 h后，正常對照組加DMEM 100 μL，其他各組加入含造模濃度的油酸DMEM 100 μL。各組最終藥物作用濃度：洛伐他汀組為0.1 mmol/L洛伐他汀，玉竹多糖低劑量組為50 μg/mL玉竹多糖，玉竹多糖高劑量組為100 μg/mL玉竹多糖。酶標儀設置低速混合5 min。采用12孔板，每組設置3孔，同法進行實驗，每次加液體積500 μL。

2.4 CCK-8法檢測細胞活力 96孔板檢測油酸和DMSO細胞毒性，采用“2.2”配制的細胞母液，按96孔板接種過夜后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，采用正常DMEM作為對照，分別檢測用含油酸0.1、1.0、2.0、2.5、4.0、5.0 mmol/L的DMEM（含1%BSA，不含血清）孵育細胞24 h后檢測細胞活力。96孔板檢測其他實驗藥物細胞毒性：0.1 mmol/L洛伐他汀和200 μg/mL玉竹多糖分別孵育細胞24 h檢測細胞活力。按CCK-8試劑盒使用說明書操作，在450 nm下檢測吸光度，得到細胞活性結果。細胞存活率=各組吸光度值/正常對照組吸光度均值×100%。

2.5 油紅O染色 參考試劑盒方法并進行改良，主要操作步驟：12孔板完成實驗后，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，加入4%多聚甲醛溶液室溫固定4 h。雙蒸水洗3次。加入試劑盒反應試劑1油紅O染色，室溫作用20 min，雙蒸水洗3次，加入試劑2蘇木素復染3 min。雙蒸水洗6次。蠟封觀察。

2.6 生化指標檢測 96孔板完成藥物處置培養(yǎng)后，去培養(yǎng)基，PBS洗3次，用細胞裂解液裂解細胞（冰?。Ｊ占屑毎呀庖?，于4 ℃，12 000 r/min離心5 min，收集上清。進行蛋白定量后，照試劑盒檢測方法，檢測各組細胞中TC和TG含量。分別按照試劑盒說明書測定樣品總SOD活力水平，檢測細胞內總ROS含量。

2.7 蛋白免疫印跡實驗 12孔板完成實驗后，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，加細胞裂解液，轉移細胞樣品至冰浴中，用勻漿器碾磨30 min，于4 ℃，12 000 r/min離心5 min，取上清液測總蛋白濃度。用10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，轉膜封閉，孵育一抗NF-κB/TLR4，過夜，孵育二抗。顯影成像。Image-J 6.0分析NF-κB/TLR4蛋白表達量。

2.8 統(tǒng)計學方法 采用Minitab17進行統(tǒng)計學分析，計量資料以“均數(shù)±標準差”（）表示。多組間比較用單因素方差分析（ANOVA）進行統(tǒng)計評價，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 各組HepG2細胞活力比較 與正常對照組比較，0.1～4.0 mmol/L的油酸對細胞活力均無明顯影響（P＞0.05），5 mmol/L油酸（含0.34% DMSO，1% BSA）會明顯降低細胞活力（P＜0.05）。因此，后續(xù)實驗選擇油酸造模濃度為0.1、2.0、4.0 mmol/L。0.1 mmol/L洛伐他汀和200 μg/mL玉竹多糖對HepG2細胞均無明顯細胞毒性（P＞0.05）。（見表1）

表1 各組HepG2 細胞活力比較（，n=6）

表1 各組HepG2 細胞活力比較（，n=6）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05

3.2 油酸孵育HepG2 24 h誘導的脂肪堆積 油紅O染色結果顯示，與正常對照組比較，油酸（0.1、2.0、4.0 mmol/L）均會誘導細胞產(chǎn)生明顯的油脂堆積，而且呈劑量相關；4.0 mmol/L組細胞形態(tài)明顯變圓。（見圖1）

圖1 不同濃度油酸誘導的HepG2 細胞脂肪堆積情況（油紅O 染色，×200）

生化指標檢測顯示，2.0 mmol/L和4.0 mmol/L油酸能明顯增加細胞內TC、TG的含量（P＜0.01），且4.0 mmol/L油酸組HepG2細胞內TC、TG的含量與2.0 mmol/L油酸組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；0.1 mmol/L油酸組HepG2細胞內TC含量與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但TG含量明顯高于正常對照組（P＜0.05）。（見圖2、表2）結合細胞毒性實驗結果，后續(xù)實驗選擇油酸造模濃度為2.5 mmol/L。

表2 油酸孵育24 h 各組HepG2 細胞TC、TG 含量比較（，n=6）

表2 油酸孵育24 h 各組HepG2 細胞TC、TG 含量比較（，n=6）

注：與正常對照組比較，aP＜0.01

3.3 玉竹多糖對油酸誘導的HepG2細胞TC、TG含量影響 與正常對照組比較，模型對照組HepG2細胞TC、TG含量明顯升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，洛伐他汀組和玉竹多糖低、高劑量組HepG2細胞TC、TG含量明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），且玉竹多糖的效應呈劑量依賴性。（見表3）

表3 玉竹多糖孵育24 h 對脂肪堆積的HepG2 細胞TC 和TG 含量的影響（，n=6）

表3 玉竹多糖孵育24 h 對脂肪堆積的HepG2 細胞TC 和TG 含量的影響（，n=6）

注：與正常對照組比較，aP＜0.01；與模型對照組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

3.4 玉竹多糖對油酸誘導的HepG2細胞中脂滴含量的影響0.25 mmol/L油酸孵育HepG2細胞24 h后，經(jīng)油紅O染色，細胞內脂滴形成情況見圖2。正常對照組HepG2細胞中未見明顯脂滴，模型對照組HepG2細胞中出現(xiàn)大量脂滴。與模型對照組比較，洛伐他汀組和玉竹多糖低、高劑量組HepG2細胞脂滴均減少。圖片經(jīng)過Image-J 6.0分析紅色脂滴含量，與正常對照組比較，模型對照組HepG2細胞中脂滴明顯增多（P＜0.01）；與模型對照組比較，洛伐他汀組和玉竹多糖低、高劑量組HepG2細胞中脂滴均明顯減少（P＜0.05）。（見圖2～3）

圖2 各組HepG2 細胞脂質堆積情況（油紅O 染色，×200）

圖3 各組HepG2 細胞內脂滴含量水平比較（，n=3）

3.5 玉竹多糖對油酸誘導的HepG2細胞SOD和ROS水平的影響0.25 mmol/L油酸孵育HepG2細胞24 h后，與正常對組比較，模型對照組HepG2細胞SOD水平明顯降低（P＜0.01），而ROS水平明顯升高（P＜0.01）；經(jīng)過洛伐他汀和玉竹多糖處理后，與模型對照組比較，洛伐他汀組和玉竹多糖低、高劑量組HepG2細胞SOD水平明顯升高（P＜0.01或P＜0.05），而ROS水平明顯降低（P＜0.01或P＜0.05）。（見表4）

表4 各組HepG2 細胞SOD 和ROS 水平比較（，n=6）

表4 各組HepG2 細胞SOD 和ROS 水平比較（，n=6）

注：與正常對照組比較，aP＜0.01；與模型對照組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

3.6 各組HepG2細胞中NF-κB/TLR4蛋白相對表達量比較 與正常對照組比較，模型對照組HepG2細胞中NF-κB、TLR4蛋白相對表達量明顯上調（P＜0.01），提示油酸可能激活了NF-κB信號通路。與模型對照組比較，洛伐他汀組和玉竹多糖低、高劑量組HepG2細胞中NF-κB、TLR4蛋白相對表達量明顯下調（P＜0.05）。（見圖4～5）

圖4 各組HepG2 細胞中NF-κB/TLR4 蛋白表達Western blotting 圖

圖5 各組HepG2 細胞中NF-κB/TLR4 蛋白相對表達量比較（，n=3）

4 討 論

油酸誘導的細胞內脂肪堆積模型被廣泛用于脂質代謝紊亂的研究，研究表明，油酸作用于HepG2細胞24 h會使甘油三酯/膽固醇含量明顯升高，且細胞內ROS水平明顯升高[13]。ROS能改變細胞膜通透性，直接引起細胞損傷，細胞內ROS還會引起基因突變，繼而激活NF-κB通路，導致胰島細胞發(fā)生炎癥細胞因子和趨化因子過表達，進一步活化NF-κB加重細胞損傷。同時細胞內ROS水平升高，會引起脂質代謝紊亂和細胞內脂質體堆積，從而誘發(fā)肝性胰島素抵抗，具體表現(xiàn)為肝細胞肥大和葡萄糖代謝異常[14-15]。脂質代謝紊亂引起的氧化應激損傷可能使心腦血管病變、脂肪肝和胰島素抵抗等脂代謝相關的風險明顯增高[16-17]，尤其是，過量的脂肪堆積產(chǎn)生大量ROS，可激活NF-κB信號通路，上調TLR4蛋白表達，增強炎癥反應。脂質堆積引起的NF-κB信號通路活化可能是誘導產(chǎn)生胰島素抵抗的重要原因[18]。POP能提高胰島素抵抗的HepG2細胞SOD活力，減少ROS蓄積。玉竹對2型糖尿病的藥效機制被認為與改善胰島素抵抗有關，且作用機制是改善機體的氧化應激反應。POP能顯著降低糖尿病大鼠體內有害物質低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）和丙二醛（MDA）蓄積[19-20]。本實驗結果表明，POP能顯著改善油酸誘導的HepG2細胞內的脂質堆積，并降低脂肪堆積HepG2細胞內ROS，提高SOD水平，進而達到降低TC和TG含量的作用。蛋白定量分析結果表明，POP能明顯抑制脂肪堆積HepG2細胞內NF-κB/TLR4蛋白表達水平，這可能是通過ROS清除作用啟動細胞內氧化應激損傷保護機制，抑制細胞炎癥反應信號傳遞至核NF-κB，細胞可能通過炎癥反應進行自我修復，或進一步降低細胞內氧化應激水平。綜上所述，HepG2細胞油酸孵育刺激過程伴隨嚴重的氧化應激損傷，過氧化產(chǎn)物會激活NF-κB信號通路。玉竹多糖可能是通過抑制NF-κB信號通路來拮抗細胞內ROS導致的氧化應激損傷，最終達到改善脂質堆積的作用。