豬C1QTNF3基因可變剪接體的鑒定及介導(dǎo)miR-101調(diào)控成脂分化的研究

楊 陽，張雪蓮，張萬鋒，李文霞，李文新，蔡春波，路 暢，高鵬飛，郭曉紅，李步高，曹果清

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，太谷 030801)

補體C1q/腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白3(C1q/tumor necrosis factor-related protein 3，C1QTNF3)，又被稱為CTRP3、CORS26或cartducin。C1QTNF3具有4個結(jié)構(gòu)域：C-末端gC1q球型域、N-末端信號肽、可變域和膠原重復(fù)序列，其中，gC1q球型域是C1QTNF3發(fā)揮功能的主要結(jié)構(gòu)域[1]。C1QTNF3屬于CTRP家族的成員，是一種分泌蛋白，在體內(nèi)各組織中廣泛存在，在脂肪、軟骨、心、肺、結(jié)腸和睪丸中表達量較高[2-3]。人類的C1QTNF3基因存在2種可變剪接體(亞型A和B)，研究發(fā)現(xiàn)，HEK293細胞中共同過表達C1QTNF3A和C1QTNF3B后，C1QTNF3A具有保護C1QTNF3B免受蛋白酶體降解的作用[4]，提示了C1QTNF3不同轉(zhuǎn)錄本之間存在一定的關(guān)聯(lián)。小鼠的C1QTNF3基因也存在2種可變剪接體[1, 5]。查閱NCBI數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，豬C1QTNF3基因只有1個確認的轉(zhuǎn)錄本，然而，許多豬轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，豬C1QTNF3基因可能存在多種剪接體，但具體信息有待進一步驗證。因此，深入研究豬C1QTNF3基因的可變剪接，對闡述C1QTNF3在生命活動中的具體作用有重要的意義。

C1QTNF3在軟骨發(fā)育、內(nèi)分泌、炎癥反應(yīng)、心血管疾病及脂肪細胞分化和代謝等多項生理活動中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[5]。作為一種脂肪因子，C1QTNF3的蛋白表達與組織的脂肪含量密切相關(guān)，在發(fā)生肥胖、胰島素抵抗以及二型糖尿病的人和小鼠血液中，C1QTNF3的水平發(fā)生顯著變化[6-9]。在3T3-L1前脂肪細胞成脂分化過程中，C1QTNF3基因表達量顯著升高，添加C1QTNF3的重組蛋白抑制了3T3-L1細胞的成脂分化，降低了關(guān)鍵基因PPARγ和FABP4的表達[10]。此外，C1QTNF3還發(fā)揮著抑制肝細胞中的脂質(zhì)沉積[11]，參與調(diào)控其他脂肪細胞因子表達的功能[12]。綜上所述，C1QTNF3是調(diào)控細胞分化和代謝的關(guān)鍵因子，鑒定靶向C1QTNF3的上游調(diào)控因子，可以為深入研究成脂分化的機制，緩解因脂肪組織過度發(fā)育而造成的相關(guān)代謝疾病提供調(diào)控手段。miRNA是一類重要的表觀因子，可通過影響關(guān)鍵基因的表達，實現(xiàn)基因功能的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，在骨肉瘤細胞中，miR-495-3p可通過下調(diào)C1QTNF3抑制細胞增殖、遷移和侵襲[13]，但靶向調(diào)控C1QTNF3表達的miRNA的研究還需深入探討。

miR-101是重要腫瘤抑制miRNA，在多種疾病(尤其是惡性腫瘤)的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，同時也廣泛參與細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移、成肌分化等生物學(xué)事件的調(diào)控[14-16]。研究顯示，miR-101在肥胖的小鼠中表達量顯著升高[17]，且在細胞成脂分化過程中表達量顯著升高[18-19]，提示miR-101可能是成脂分化和脂質(zhì)代謝新的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。本研究利用生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-101與C1QTNF3基因3′UTR區(qū)域存在潛在的結(jié)合位點，暗示了miR-101可能與C1QTNF3基因存在靶向關(guān)系，但具體作用機制尚不清楚。

目前，有關(guān)豬C1QTNF3基因的可變剪接及靶向調(diào)控因子的研究還較少，本研究采用基因克隆和qRT-PCR技術(shù)鑒定豬C1QTNF3基因的不同轉(zhuǎn)錄本及在組織中的表達模式，并通過結(jié)合位點突變和qRT-PCR技術(shù)分析miR-101對C1QTNF3的靶向作用，在豬脂肪SV細胞中過表達miR-101，研究miR-101對成脂分化的調(diào)節(jié)作用。本研究豐富了miRNA調(diào)控脂肪細胞生成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為探討豬C1QTNF3基因的功能提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本研究選取3頭30日齡健康無病、體重相近的馬身豬仔公豬，屠宰后，采集心、肝、脾、肺、腎、胃、股二頭肌、腰大肌、皮下脂肪和背部脂肪樣品。

1.2 主要試劑

胎牛血清(Gibco，美國)；TRIzol、SYBR Premix ExTaqII、Prime Script RT reagent Kit(TaKaRa，大連)；Green Taq Mix(Vazyme，南京)；胰島素和羅格列酮(Sigma，美國)；青鏈霉素、地塞米松、胰蛋白酶、油紅O、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(索菜寶，北京)；豬miR-101 mimics、miR-NC和psiCHECK-2質(zhì)粒(漢恒生物公司，武漢)；Lipofectamine 2000(Invitrogen，美國)。

1.3 試驗方法

1.3.1 總RNA提取和cDNA合成 馬身豬的10個組織和皮下脂肪SV細胞的總RNA采用TRIzol試劑盒提取。將提取的RNA用PrimeScript RT reagent Kit試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。

1.3.2C1QTNF3轉(zhuǎn)錄本的擴增與克隆 在NCBI 上查找豬C1QTNF3基因的序列(登錄號：NM_005672408.3)，用NCBI Primer-BLAST和Oligo7軟件針對C1QTNF3基因CDS區(qū)全長設(shè)計擴增引物P1，引物位置示意圖見圖1，引物序列見表1。將馬身豬各組織的cDNA等比例混合，擴增豬C1QTNF3基因的不同可變剪接體。反應(yīng)產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將不同的轉(zhuǎn)錄本片段膠回收后送華大基因公司確定序列。隨后根據(jù)測序數(shù)據(jù)，針對C1QTNF3轉(zhuǎn)錄本特有的序列(圖1中第1外顯子的深色區(qū)域)設(shè)計上游引物F2，C1QTNF3-1轉(zhuǎn)錄本上第1外顯子缺失219 個堿基，因此跨缺失區(qū)域設(shè)計第1和第2外顯子的拼接上游引物F3，最后利用qRT-PCR特異性檢測C1QTNF3和C1QTNF3-1的表達。qRT-PCR試驗按照 SYBR Premix ExTaqII試劑盒進行(引物序列見表1)，重復(fù)數(shù)n=3。定量結(jié)果應(yīng)用2-△△CT法進行分析，選取18S rRNA作為內(nèi)參基因，基因表達的差異用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

表1 引物信息

1～6代表外顯子，深色區(qū)域為C1QTNF3-1轉(zhuǎn)錄本缺失序列；F/R.上/下游引物

1.3.3 序列生物信息學(xué)分析 生物信息學(xué)所用的軟件工具見表2。

表2 分析軟件信息

1.3.4 豬C1QTNF3基因的雙熒光質(zhì)粒的構(gòu)建 設(shè)計擴增C1QTNF3的3′UTR同源重組引物(Wt-F: 5′-ATTCTAGGCGATCGCTCGAGAGT-TTTGCCTATCCCTTCCCAA-3′;Wt-R:5′-TTA-TTGCGGCCAGCGGCCGCAGGGTCAAAGACT-GACCTGAA-3′)及突變引物(Mut-F: 5′-CATGAGAATGTCGCGTAAATTCTGATGATAGT-ATCCAAAATTGG-3′; Mut-R: 5′-TACGCGA-CATTCTCATGAATATCATCTTGGCTAATT-3′)。以馬身豬組織樣cDNA為模板，擴增C1QTNF3的3′UTR 序列，膠回收產(chǎn)物與psiCHECK-2線性化載體通過Vazyme同源重組試劑盒進行連接。連接成功的質(zhì)粒送華大基因公司進行測序。

1.3.5 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和成脂誘導(dǎo) 原代豬脂肪SV細胞和293T細胞由實驗室保存。細胞的生長培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM(高糖)培養(yǎng)基。將293T細胞接種到細胞板后，待細胞達到80%～90%融合度時，采用Lipo 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染miR-101 mimics及對照、Sus-C1QTNF3-Wt-psiCHECK-2和Sus-C1QTNF3-Mut-psiCHECK-2，24 h后，檢測熒光素酶活性。miR-101 mimics及對照序列見表3。

表3 miR-101 mimics/NC序列信息

豬脂肪SV細胞轉(zhuǎn)染miR-101 mimics及對照后，采用“激素雞尾酒”法誘導(dǎo)成脂分化，待細胞長滿后，培養(yǎng)基中加入羅格列酮(1 μmoL·L-1)、胰島素(10 μg·mL-1)、DEX(1 μmoL·L-1)和IBMX(0.5 mmoL·L-1)。2 d后，培養(yǎng)基更換為生長培養(yǎng)基+胰島素(10 μg·mL-1)。2 d后，培養(yǎng)基換為生長培養(yǎng)基。油紅O染色參照試劑盒操作規(guī)程進行，染色后在光學(xué)倒置顯微鏡下拍照。

1.3.6 統(tǒng)計與分析 豬C1QTNF3基因的組織表達差異利用SPSS 22.0軟件的單因素方差分析進行；兩樣本間的差異分析利用獨立樣本T檢驗進行；P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 豬C1QTNF3基因可變剪切體的克隆及生物信息學(xué)分析

2.1.1 豬C1QTNF3基因可變剪接體的擴增 利用RT-RCR方法擴增豬C1QTNF3基因序列，結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物具有兩條帶，大小分別為1 117和898 bp(圖2A)，序列比對分析發(fā)現(xiàn)，長片段(稱為C1QTNF3)與NCBI公布序列相同，短片段(稱為C1QTNF3-1)在第1外顯子區(qū)域缺失了219 bp(圖2B)，利用ORF Finder檢測發(fā)現(xiàn)，C1QTNF3-1含有一個長741 bp的開放閱讀框。綜上，克隆得到C1QTNF3的一個741 bp CDS全長的新轉(zhuǎn)錄本C1QTNF3-1(NCBI登錄號：MN082631)，編碼246個氨基酸。

A.PCR擴增C1QTNF3的各轉(zhuǎn)錄本(1.陰性對照；M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2.C1QTNF3各轉(zhuǎn)錄本擴增結(jié)果)；B.C1QTNF3和C1QTNF3-1的核苷酸序列比對結(jié)果

2.1.2 豬C1QTNF3蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測 SOPMA和PredictProtein軟件的預(yù)測結(jié)果顯示(圖3A-B)，C1QTNF3與C1QTNF3-1的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)包含α-螺旋(h)、延伸(e)、β-折疊(t)和無規(guī)則卷曲(c)，C1QTNF3分別占18.81%、16.30%、5.96%和58.93%，C1QTNF3-1分別占14.23%、22.76%、6.10%和56.91%。Phyre2.0軟件預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)(圖3C)顯示，C1QTNF3和C1QTNF3-1具有非常相似的3D結(jié)構(gòu)。兩個蛋白均是由9個β-折疊圍成的結(jié)構(gòu)。每兩個β-折疊之間由無規(guī)則卷曲(disordered loop)相連。兩個蛋白的結(jié)構(gòu)差異主要體現(xiàn)在Loop1、4、6、8構(gòu)象的不同。

A、B.豬C1QTNF3與C1QTNF3-1蛋白質(zhì)預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)；C.C1QTNF3與C1QTNF3-1蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)

2.1.3 C1QTNF3氨基酸序列進化樹的構(gòu)建 用NCBI BLAST檢測包括豬、人、牛、山羊、北極熊等在內(nèi)的14個物種C1QTNF3氨基酸的相似性，結(jié)果表明，豬的C1QTNF3-1(豬C1QTNF3 isoform X1)蛋白序列與北大西洋小須鯨C1QTNF3 isoform X3和北極熊C1QTNF3 isoform X3的同源性最高，達99.59%；與豬C1QTNF3、家貓C1QTNF3 isoform X3、夏威夷僧海豹C1QTNF3 isoform X3、白尾鹿德克薩斯亞種C1QTNF3 isoform X3、山羊C1QTNF3 isoform X1的同源性分別為99.54%、99.19%、99.19%、99.19%和99.09%。對上述14個物種進行進化樹分析(圖4)，豬C1QTNF3-1與C1QTNF3的氨基酸序列單獨聚為一個分支，表明二者親緣關(guān)系最近，此外與人和馬來亞穿山甲的遺傳距離較近，暗示了C1QTNF3在豬和人的物種之間具有功能上的相似性。

2.2 C1QTNF3基因在豬不同組織的表達譜分析

本研究采用qRT-PCR方法研究了C1QTNF3基因在馬身豬不同組織中的表達規(guī)律(圖5)，C1QTNF3和C1QTNF3-1在各組織中均有表達；C1QTNF3轉(zhuǎn)錄本在肌肉中表達量最高，在肝和脾中表達量較低；C1QTNF3-1在肺和背部脂肪中表達量較高，隨后是腎、腰大肌、股二頭肌、胃等。各組織中C1QTNF3-1的表達量均極顯著高于C1QTNF3(P<0.01)，推測C1QTNF3-1為主要亞型。

**.表示同一組織中C1QTNF3和C1QTNF3-1的表達量差異極顯著(P<0.01)。小寫字母(C1QTNF3-1)和大寫字母(C1QTNF3)表示各組織中同一轉(zhuǎn)錄本的mRNA水平存在差異(P<0.05)

2.3 miR-101對C1QTNF3表達水平的影響

為鑒定豬C1QTNF3基因的上游調(diào)控因子，通過靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-101的種子序列與豬C1QTNF3基因不同轉(zhuǎn)錄本下游1 266～1 656 bp的3′UTR序列均完全互補，即具有同一個結(jié)合位點(圖6A)。推測C1QTNF3可作為miR-101潛在的靶向調(diào)控基因。隨后，通過轉(zhuǎn)染miR-101 mimics實現(xiàn)miR-101的過表達(圖6B)。在293T細胞中共轉(zhuǎn)染miR-101 mimics與C1QTNF3 的3′UTR雙報告載體后，miR-101 mimics顯著抑制了C1QTNF3 的3′UTR的熒光活性(P<0.01，圖6C)，將3′UTR區(qū)域的結(jié)合位點突變后，miR-101 mimics則不顯著影響熒光素酶的活性。由此說明，miR-101與C1QTNF3的3′UTR確實存在結(jié)合位點，存在靶標(biāo)關(guān)系。最后，過表達miR-101后，豬脂肪SV細胞中C1QTNF3基因表達量極顯著降低(P<0.01，圖6D)，表明miR-101負調(diào)控C1QTNF3基因的表達。

A.C1QTNF3基因與預(yù)測miRNAs的結(jié)合位點；B.miR-101過表達效率檢測；C.C1QTNF3基因3′UTR雙熒光質(zhì)粒的相對熒光活性；D.過表達miR-101對C1QTNF3表達的影響。**.P<0.01，下同

2.4 miR-101對豬脂肪細胞生成的影響

為研究miR-101對成脂分化的調(diào)節(jié)作用，豬脂肪SV細胞轉(zhuǎn)染miR-101 mimics成脂誘導(dǎo)8 d后，檢測脂肪細胞生成的變化。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-101 mimics的豬脂肪SV細胞脂滴增加(油紅O染色，圖7A～B)，進一步檢測甘油三酯的含量發(fā)現(xiàn)，過表達miR-101顯著增加了豬脂肪SV細胞的甘油三酯含量(P<0.01，圖7C)。此外，qRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-101 mimics后成脂關(guān)鍵基因PPARγ、C/EBPβ、SREBP-1c和FABP4的表達水平均極顯著升高(P<0.01，圖7D)。綜上結(jié)果表明，過表達miR-101促進豬脂肪細胞成脂分化。

A、B.油紅O染色結(jié)果(100×)；C.甘油三酯含量檢測；D.過表達miR-101對成脂關(guān)鍵基因表達的影響

3 討 論

脂肪組織是機體內(nèi)主要的儲能器官，隨著大量脂肪細胞因子的發(fā)現(xiàn)，脂肪組織也被認為是內(nèi)分泌器官，在內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[20]。C1QTNF3作為一個脂肪細胞因子，被報道在脂肪細胞生成的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。Nishimoto等[10]研究發(fā)現(xiàn)，過表達C1QTNF3基因可能通過ERK1/2和Akt信號通路，抑制3T3-L1細胞的成脂分化。然而最近的一項研究卻表明，C1QTNF3基因敲除的小鼠能有效緩解小鼠飼喂高脂日糧造成的肥胖，顯著降低了附睪脂肪的比率和成脂關(guān)鍵因子的表達[21]。這表明C1QTNF3在脂肪細胞生成過程中扮演著復(fù)雜而關(guān)鍵的調(diào)控角色，但產(chǎn)生差異結(jié)果的機制卻有待進一步研究?？勺兗羟惺巧矬w內(nèi)普遍存在的一種調(diào)控方式[22-24]，與蛋白質(zhì)功能的改變密切相關(guān)[25]?；虮磉_過程中發(fā)生的可變剪切事件直接影響順式作用元件的作用和定位，并對細胞的增殖凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和分化等過程都具有重要的作用[26-28]。本研究通過RT-PCR和克隆測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了C1QTNF3基因的兩個轉(zhuǎn)錄本C1QTNF3和C1QTNF3-1，與C1QTNF3相比，C1QTNF3-1缺失了部分第1外顯子，這與人和小鼠上C1QTNF3基因轉(zhuǎn)錄本結(jié)果相一致[1,5]。說明C1QTNF3在不同的物種之間可能具有相同的選擇性剪接機制，使得研究C1QTNF3的功能具有普遍性，也為解釋C1QTNF3在成脂分化中不同作用結(jié)果提供了思路。

研究表明，C1QTNF3基因敲除小鼠能夠降低高脂日糧誘導(dǎo)肥胖小鼠的脂肪重，并調(diào)控附睪脂肪組織中成脂關(guān)鍵因子的表達[21]。此外，C1QTNF3能夠上調(diào)成肌分化關(guān)鍵基因MyHC和MyoG的表達，并抑制notch受體的表達，從而調(diào)控成肌細胞的分化[29]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，C1QTNF3的不同轉(zhuǎn)錄本均在豬脂肪組織和肌肉組織中高表達，這與C1QTNF3影響動物脂肪細胞生成和骨骼肌生長發(fā)育的生理功能相吻合[21,29]。基因各轉(zhuǎn)錄本之間的表達趨勢往往不同[30]，本研究中，在豬30日齡的組織中C1QTNF3-1的表達量均極顯著高于C1QTNF3(P<0.01)，推測C1QTNF3-1為主要亞型。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，C1QTNF3和 C1QTNF3-1具有非常相似的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，說明C1QTNF3不同轉(zhuǎn)錄本蛋白質(zhì)之間的功能存在相關(guān)性，但在三級結(jié)構(gòu)預(yù)測中沒有得到α-螺旋的結(jié)構(gòu)，需要進一步利用晶體衍射研究其具體的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。

前期的研究顯示，C1QTNF3在成脂分化中發(fā)揮著重要的作用，因此可以進一步靶向C1QTNF3建立一些調(diào)控手段，來調(diào)控脂肪發(fā)育。miRNAs作為重要的表觀調(diào)節(jié)因子，通過影響關(guān)鍵基因的表達調(diào)控多種生理學(xué)和病理學(xué)過程。關(guān)于miRNA對C1QTNF3的表達調(diào)控研究已有報道，研究顯示，過表達miR-495-3p可通過下調(diào)C1QTNF3基因表達，抑制骨肉瘤細胞增殖、侵襲及遷移[13]。本研究構(gòu)建了包含有miR-101和C1QTNF3基因結(jié)合位點3′UTR 序列的psiCHECK-2 雙熒光素酶報告載體，以及結(jié)合位點突變載體。共轉(zhuǎn)染miR-101 mimic和雙報告載體后，miR-101 mimic顯著抑制了野生型載體的熒光活性(P<0.01)，而突變型載體的熒光活性無顯著變化，提示miR-101存在靶向調(diào)控C1QTNF3基因表達的情況。進一步研究顯示，過表達miR-101可明顯降低豬脂肪SV細胞中C1QTNF3的表達(P<0.01)，提示miR-101與C1QTNF3基因存在顯著的負調(diào)控。miR-101參與腫瘤抑制的調(diào)控，且在多種生物學(xué)事件中起著關(guān)鍵作用，例如細胞增殖、凋亡、血管生成、侵襲、遷移、分化等[14-16]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-101可以通過EZH2/Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控間充質(zhì)干細胞的成骨分化[31]，但miR-101對于成脂分化的研究還未見報道。本研究將miR-101 mimic轉(zhuǎn)染豬脂肪SV細胞，并進行成脂誘導(dǎo)分化，結(jié)果表明，過表達miR-101可以增加細胞的脂質(zhì)積累，PPARγ、C/EBPβ、SREBP-1c和FABP4等關(guān)鍵基因的表達量顯著升高(P<0.01)，說明miR-101具有促進豬脂肪SV細胞分化為成熟脂肪細胞的作用。

4 結(jié) 論

本試驗獲得了豬C1QTNF3基因的一個新轉(zhuǎn)錄本C1QTNF3-1(MN082631)，與C1QTNF3基因相比，C1QTNF3-1第1外顯子區(qū)域缺失了219 個堿基。分析豬C1QTNF3和C1QTNF3-1在各組織的表達規(guī)律發(fā)現(xiàn)，C1QTNF3-1可能為主要亞型。miR-101與C1QTNF3的3′UTR存在結(jié)合位點，過表達miR-101會抑制C1QTNF3基因的表達并促進成脂分化，這些結(jié)果說明了C1QTNF3基因與miR-101間的靶標(biāo)關(guān)系，為進一步研究C1QTNF3對成脂分化和代謝的調(diào)控機制提供了理論基礎(chǔ)。