弓形蟲蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究進(jìn)展

尹德琦，魏子巍，張義偉，桑曉宇，楊 娜，馮 穎，陳 冉，姜 寧

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院，沈陽(yáng) 110866)

弓形蟲是一種專一性的頂復(fù)門胞內(nèi)寄生蟲，被認(rèn)為是世界上分布最廣泛的人畜共患病之一[1-2]。剛地弓形蟲的生命周期很復(fù)雜，主要以兩種感染形式存在：包括快速?gòu)?fù)制的速殖子和緩慢分裂的緩殖子。盡管弓形蟲通常會(huì)導(dǎo)致成年人和免疫力正常的人產(chǎn)生輕度癥狀，但對(duì)母體中發(fā)育的胎兒和免疫功能低下的人造成嚴(yán)重的危害，甚至可能危及生命[3-4]。此外，弓形蟲病能夠引起家畜流產(chǎn)，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。在日常生活中，人和溫血?jiǎng)游锿ǔ?huì)因受到包囊或卵囊污染的食物或水而感染。目前，治療弓形蟲的有效藥物僅限于少數(shù)代謝抑制劑，包括乙胺嘧啶、磺胺類藥物、螺旋霉素和克林霉素等[5]。這些藥物具有一定的局限性和細(xì)胞毒性，因此尋找新的且有效的藥物靶標(biāo)迫在眉睫。

PTMs通過將共價(jià)修飾連接到多肽鏈上，擴(kuò)展了20種蛋白質(zhì)氨基酸的化學(xué)組成和信息含量，增加了蛋白質(zhì)的功能性。大多數(shù)的PTMs會(huì)在多肽鏈合成(翻譯)后進(jìn)行連接，因此通常稱為“翻譯后修飾”(PTMs)[6]。PTMs是將一些化學(xué)基團(tuán)共價(jià)偶聯(lián)到蛋白質(zhì)特定氨基酸上的過程，包括磷酸化、糖基化、泛素化、琥珀?；⒓谆?、乙?；?、巴豆?；投u基異丁?；揎椀萚7-9]。PTMs(例如甲基化、乙?；?、SUMO酰化和琥珀?；?及它們之間的相互作用能夠參與宿主先天免疫和炎癥的調(diào)節(jié)過程，為傳染性和免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制以及潛在治療途徑提供理論基礎(chǔ)[10]。迄今為止，大約有461 種不同類型的PTMs 已被Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)所收錄(http://www.uniprot.org/docs/ptmlist)，且在微生物、人、動(dòng)物和植物等方面均發(fā)揮著重要功能[11]。PTMs可以在蛋白質(zhì)的生命周期中的任何時(shí)間發(fā)生，并且可以通過改變目標(biāo)蛋白質(zhì)活性、定位、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用以及其他功能等。即使同一種蛋白質(zhì)僅發(fā)生一種類型的修飾，也可能具有多種功能；如果同一蛋白質(zhì)上的相同PTM發(fā)生在不同的氨基酸上，則其功能也將不同；如果相同的蛋白質(zhì)發(fā)生不同的修飾類型，那么其功能和涉及的生物學(xué)過程更加復(fù)雜。因此，PTMs極大地增加了蛋白質(zhì)組的多樣性和復(fù)雜性。弓形蟲在不同的發(fā)育階段表達(dá)不同的數(shù)量的蛋白質(zhì)，但僅僅是數(shù)量的變化無(wú)法滿足其復(fù)雜生命過程的需要，需要PTMs的參與。PTMs能夠使蛋白質(zhì)的功能呈現(xiàn)指數(shù)增長(zhǎng)，從而在弓形蟲的生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。棕櫚?；?、泛素化、磷酸化和甲基化等PTMs會(huì)調(diào)控弓形蟲運(yùn)動(dòng)和入侵宿主細(xì)胞的過程，特別是磷酸化修飾通過調(diào)控蛋白激酶(protein kinase G，PKG)對(duì)其入侵和逸出宿主細(xì)胞起到信號(hào)樞紐的作用[7, 12]。當(dāng)弓形蟲在細(xì)胞外環(huán)境中尋找宿主細(xì)胞入侵時(shí)，它會(huì)暴露于缺乏營(yíng)養(yǎng)和氧化應(yīng)激的環(huán)境中，而PTMs會(huì)在這種惡劣的環(huán)境中維持寄生蟲的生存能力[7, 13]。此外，弓形蟲可通過乙?；⒘姿峄?、糖基化、甲基化、小泛素化和泛素化等修飾對(duì)其組蛋白和轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行調(diào)控，從而調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄及翻譯的過程[7, 14]。弓形蟲通過PTMs下調(diào)免疫反應(yīng)和重組亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)來操縱所入侵的宿主細(xì)胞，為蟲體生存、復(fù)制和入侵創(chuàng)造一個(gè)有利的條件[15]。總之，弓形蟲體內(nèi)普遍存在著乙?；?、磷酸化、巴豆?；?、琥珀酰化、二羥基異丁基?；⒎核鼗⑻腔?、丙二酰化等 PTMs 類型，這些PTMs 參與了蛋白質(zhì)加工與合成、表觀遺傳調(diào)控、毒力、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、入侵、運(yùn)動(dòng)以及應(yīng)激響應(yīng)等各種生物學(xué)過程。因此，PTMs可能是弓形蟲的發(fā)育過渡、生物學(xué)和發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。本綜述對(duì)弓形蟲的PTMs進(jìn)行簡(jiǎn)要總結(jié)，旨在進(jìn)一步全面解析弓形蟲的生物學(xué)特性和發(fā)病機(jī)制，為尋找新的抗弓形蟲藥物靶標(biāo)奠定基礎(chǔ)。

1 蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究進(jìn)展

1.1 泛素化修飾(ubiquitination)

泛素是一種由76個(gè)氨基酸組成的多肽，與蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基結(jié)合來調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)過程。De Monerri等[13]在弓形蟲中共鑒定到超過500多種蛋白質(zhì)上的1 000個(gè)泛素化修飾位點(diǎn)，且大部分的泛素化蛋白與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)。泛素化修飾需要 E1 泛素激活酶、E2 泛素結(jié)合酶和 E3 泛素連接酶的共同調(diào)控[16-17]。泛素化修飾在弓形蟲細(xì)胞骨架、內(nèi)膜復(fù)合物以及滑動(dòng)體(gliding-associated protein, GAP)等相關(guān)蛋白質(zhì)上也被檢測(cè)到，可能對(duì)于細(xì)胞骨架的重排具有重要的作用[13]。在弓形蟲染色質(zhì)修飾酶上檢測(cè)到泛素化修飾，包括乙?；D(zhuǎn)移酶GCN5b(轉(zhuǎn)錄的主調(diào)節(jié)劑)以及與GCN5b相互作用的蛋白質(zhì)[18]。此外，在弓形蟲組蛋白以及AP2轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子中也發(fā)現(xiàn)多個(gè)泛素化位點(diǎn)，可能對(duì)弓形蟲的轉(zhuǎn)錄具有重要的調(diào)控作用[13]。弓形蟲35%的泛素化蛋白是與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的，且與磷酸化修飾之間有著重要的相互作用。

1.2 小泛素化修飾(SUMOylation)

小泛素化修飾是小泛素相關(guān)修飾物與賴氨酸殘基的共價(jià)連接過程。弓形蟲的蛋白質(zhì)組中約有1%蛋白質(zhì)發(fā)生SUMO修飾，并參與轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制和修復(fù)、染色體分離和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等細(xì)胞功能[19]。該修飾由3種酶進(jìn)行調(diào)控: E1-SAE1/SAE2異二聚體(活化酶)、E2/Ubc9(結(jié)合酶)和E3酶(連接酶)[19]。雖然大多數(shù)SUMO修飾調(diào)控酶都在細(xì)胞核中，但SUMO修飾的發(fā)生并不局限于細(xì)胞核。研究表明，SUMO修飾在細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中均發(fā)揮重要的作用[19-20]。與靶向蛋白質(zhì)降解的泛素化修飾不同，SUMO修飾可以保護(hù)蛋白質(zhì)不被降解，也可將蛋白質(zhì)引導(dǎo)到細(xì)胞中的特定位置，尤其是細(xì)胞核[20-21]。HSP70和HSP90等熱休克蛋白質(zhì)均被檢測(cè)到發(fā)生SUMO修飾，有助于弓形蟲的抗應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)SUMO修飾在弓形蟲入侵宿主細(xì)胞、包囊發(fā)育/維持和發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用[19]。盡管泛素化和SUMO修飾非常相似，但它們具有不可替代的生物學(xué)功能。

1.3 棕櫚?；揎?palmitoylation)

S-棕櫚酰化是棕櫚酸酯(一種飽和16碳脂肪酸)通過硫酯鍵與半胱氨酸殘基共價(jià)連接發(fā)生[22-23]。在弓形蟲中共鑒定到282種棕櫚酰化蛋白質(zhì)，主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上。棕櫚?；ǔ⑴c調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)膜定位、改變蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等[24]。與其他脂質(zhì)類修飾不同，棕櫚酰化具有可逆性和動(dòng)態(tài)性。棕櫚?；揎椨勺貦磅；D(zhuǎn)移酶(palmitoyl acyl transferases, PATs)催化，弓形蟲基因組編碼18個(gè)潛在PATs，其中16個(gè)在速殖子中表達(dá)[24-25]。因此，棕櫚?；赡茉诠蜗x速殖子階段發(fā)揮重要作用。Foe等[26]證實(shí)了肌球蛋白輕鏈(myosin light chain, MLC1)、肌球蛋白質(zhì)MyoA以及GAP45、GAP40、GAP50和GAP70等滑動(dòng)體相關(guān)蛋白質(zhì)均發(fā)生棕櫚?；揎?，這些發(fā)現(xiàn)揭示滑動(dòng)體是速殖子的一種被高度棕櫚?；膹?fù)合物。進(jìn)一步的研究表明，阻斷頂端膜抗原(apical membrane antigen 1, AMA1)棕櫚?；稍黾覣MA1及微線體相關(guān)蛋白質(zhì)(microneme proteins，MICs)從頂端復(fù)合體的釋放，表明棕櫚?；揎椩诠蜗x速殖子的入侵階段扮演著關(guān)鍵的角色。

1.4 磷酸化修飾(phosphorylation)

1.5 O-糖基化修飾(O-GlcNAcylation)、C-甘露糖基化修飾(C-Mannosylation)和O-巖藻糖基化(O-fucosylation)

糖基化修飾主要分為N-糖基化和O-糖基化，對(duì)弓形蟲的研究主要集中在后者。O-糖基化修飾(O-GlcNAcylation)是由ON和OFF酶(O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶和O-GlcNAcase)調(diào)節(jié)的高度動(dòng)態(tài)的PTM，可以與磷酸化競(jìng)爭(zhēng)，但其功能尚不清楚[29]。O-糖基化的功能是多種多樣的，包括調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)過程，并影響蛋白質(zhì)表達(dá)、降解和運(yùn)輸?shù)萚29-30]。此外，黏蛋白樣糖蛋白的黏蛋白結(jié)構(gòu)域上糖基化的缺失會(huì)導(dǎo)致弓形蟲囊壁結(jié)構(gòu)剛性的缺失，這說明糖基化修飾可能參與調(diào)節(jié)弓形蟲細(xì)胞壁的相關(guān)結(jié)構(gòu)[31]。

C-甘露糖基化是后生動(dòng)物中存在的血小板反應(yīng)蛋白1型重復(fù)序列的常見修飾類型，最近在頂復(fù)門寄生蟲中也被發(fā)現(xiàn)[32-34]。這種糖基化是由DPY19家族的酶介導(dǎo)，該酶將α-甘露糖轉(zhuǎn)移至序列WX2WX2C中色氨酸殘基[34]。C-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性與寄生蟲對(duì)宿主細(xì)胞的黏附力、運(yùn)動(dòng)能力、入侵和逸出宿主細(xì)胞等有關(guān)[32, 34]。雖然C-甘露糖基化轉(zhuǎn)移酶DPY19不是弓形蟲存活所必需的，但對(duì)黏附、運(yùn)動(dòng)和毒力卻很重要[35]。由于糖基化修飾的調(diào)控機(jī)制尚不十分清楚，因此仍然需要徹底研究其對(duì)弓形蟲生命周期和致病潛力的影響。

弓形蟲O-糖基化轉(zhuǎn)移酶(OGT)可修飾數(shù)千種細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，調(diào)控O-巖藻糖基化修飾參與轉(zhuǎn)錄，mRNA加工和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程[36]。近期的研究發(fā)現(xiàn)，O-糖基化轉(zhuǎn)移酶是介導(dǎo)O-巖藻糖基化所必需的，且O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶“Spindly”會(huì)影響弓形蟲的蛋白表達(dá)和毒力[36]。盡管O-巖藻糖基化修飾的許多內(nèi)源蛋白質(zhì)對(duì)于速殖子的抗應(yīng)激能力很重要，但O-巖藻糖基化修飾酶“Spindly”蛋白質(zhì)的敲除試驗(yàn)證明，它并不是介導(dǎo)弓形蟲O-巖藻糖基化所必需的。因此，O-巖藻糖基化很可能為弓形蟲提供了一種預(yù)防機(jī)制，可以生成和儲(chǔ)備一些關(guān)鍵蛋白質(zhì)，以加強(qiáng)蟲體對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)力。

1.6 乙?；揎?acetylation)

組蛋白乙酰化是涉及弓形蟲生長(zhǎng)和發(fā)育的關(guān)鍵PTM類型，使用液相-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)成功地在弓形蟲中鑒定到400多個(gè)新的乙酰化位點(diǎn)，包括與新陳代謝、翻譯、折疊和細(xì)胞骨架等相關(guān)蛋白質(zhì)[37]?；钴S增殖的速殖子中富含豐富的賴氨酸乙?；?，這可能與急性弓形蟲病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。AP2轉(zhuǎn)錄因子可能通過乙?；揎梺碚{(diào)節(jié)弓形蟲的基因轉(zhuǎn)錄[38]。賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(如MYST-A、MYST-B、GCN5-A和GCN5-B等)以及賴氨酸去乙酰修飾酶HDACs家族蛋白質(zhì)等，對(duì)乙?；揎椌哂兄匾恼{(diào)控作用[39-41]。此外，基于賴氨酸脫乙?；?HDACs)抑制劑(如FR235222)的抗寄生蟲作用，乙?；揎椪{(diào)控酶可作為潛在的有效藥物靶標(biāo)[42]。蛋白質(zhì)乙?；揎椝脚c寄生蟲基因型特異性毒力之間具有重要的關(guān)系。在弓形蟲RH株中發(fā)生賴氨酸乙酰化蛋白質(zhì)(458個(gè))最多，其次是PYS株(188個(gè))，而在PRU株中僅檢測(cè)到115個(gè)乙?；鞍譡43]?？傊嚢彼嵋阴；诠蜗x的多種生物學(xué)過程中均發(fā)揮重要的功能，對(duì)其存活和發(fā)育至關(guān)重要。

1.7 精氨酸甲基化修飾(methylation)

精氨酸甲基化涉及多種生物學(xué)過程，主要發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)和核蛋白上，與表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、RNA剪接和DNA損傷反應(yīng)等過程相關(guān)[44]。精氨酸單甲基化(monomethyl arginine, MMA)修飾大約占弓形蟲蛋白質(zhì)組的5%，主要包括DNA和RNA結(jié)合蛋白質(zhì)等[12]。剛地弓形蟲的精氨酸單甲基化修飾包含大量的RNA結(jié)合蛋白和ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子，這表明精氨酸甲基化修飾可能在蟲體的RNA生物學(xué)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮作用。在之前的磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，精氨酸單甲基化的蛋白質(zhì)中有90%被檢測(cè)也發(fā)生磷酸化修飾，這增加了弓形蟲中MMA與磷酸化之間相互作用的可能性[12]。精氨酸甲基化由甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基轉(zhuǎn)移酶共同調(diào)控，弓形蟲基因組含有五種假定的精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(protein arginine methyltransferases, PRMTs)，其中PRMT1對(duì)細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)起著關(guān)鍵作用[12, 45]。總之，MMA是細(xì)胞核活性的重要調(diào)節(jié)劑，且PRMT1是弓形蟲中MMA的主要調(diào)節(jié)劑。

1.8 琥珀酰化修飾(succinylation)

與賴氨酸甲基化和乙?；啾?，賴氨酸琥珀?；徽J(rèn)為能促進(jìn)蛋白質(zhì)化學(xué)性質(zhì)發(fā)生更實(shí)質(zhì)性的轉(zhuǎn)化，因?yàn)殓牾；梢赞D(zhuǎn)運(yùn)更大的結(jié)構(gòu)部分[46]。在生理pH條件下，賴氨酸殘基上發(fā)生的琥珀酰化可誘導(dǎo)電荷的改變，從而有利于調(diào)節(jié)底物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能[47]。由于賴氨酸琥珀?；鸬慕Y(jié)構(gòu)變化更為明顯，可能會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)功能發(fā)生更為顯著的變化。研究發(fā)現(xiàn)弓形蟲中147個(gè)蛋白質(zhì)上含有425個(gè)獨(dú)特的賴氨酸琥珀?；稽c(diǎn)，且參與代謝、表觀遺傳、基因調(diào)控等生物學(xué)功能[46]。此外，研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)琥珀?；揎椀鞍踪|(zhì)[如丙酮酸脫氫酶復(fù)合物亞基(PDH-E3II)、檸檬酸合酶I(CS1)、烏頭酸水合酶(ACN)、異檸檬酸脫氫酶(IDH、二氫脂酰胺S-琥珀?；D(zhuǎn)移酶(DLST)、琥珀酰CoA連接酶亞基β(SUCL2)、琥珀酸脫氫酶(SDHA)、富馬酸水合酶(FH)和蘋果酸脫氫酶(MDH)]定位于弓形蟲線粒體或頂質(zhì)體，這對(duì)三羧酸循環(huán)、脂肪酸和類異戊二烯合成等均具有重要作用[48]。弓形蟲賴氨酸琥珀?；婕岸喾N細(xì)胞功能，特別是與能量代謝過程有關(guān)。

1.9 N-肉豆蔻?；揎?N-myristoylation)

在弓形蟲中有157種蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生N-肉豆蔻?；揎?，且對(duì)其生命周期的調(diào)控至關(guān)重要[49]。N-肉豆蔻?；D(zhuǎn)移酶(N-myristoyltransferase，NMT)是寄生蟲中必不可少的肉豆蔻?；?。弓形蟲蛋白質(zhì)TGME49_209160(myristoyl CoA: protein N-myristoyltransferase)是一種N-肉豆蔻酰基轉(zhuǎn)移酶，這可能是新的潛在的抗寄生蟲藥物靶標(biāo)[49]。此外，多個(gè)肉豆蔻?；揎椀鞍踪|(zhì)對(duì)弓形蟲運(yùn)動(dòng)、入侵和逸出細(xì)胞等過程具有重要的調(diào)控作用，如滑動(dòng)體相關(guān)蛋白質(zhì)GAP45/70，鈣依賴性激酶CDPK1和CDPK3等[49]。盡管N-肉豆蔻?；揎椀耐枯^低，但是仍然扮演著不可或缺的角色。

1.10 巴豆?；揎?crotonylation)

巴豆酰化修飾在細(xì)胞、微生物、植物等中均被報(bào)道過具有重要的功能[50-51]。通過非標(biāo)定量技術(shù)(label free)和液相-質(zhì)譜聯(lián)用的研究策略，在弓形蟲RH株中共鑒定到有1 061個(gè)巴豆?；揎椀鞍踪|(zhì)(3 735個(gè)位點(diǎn))以及在ME49株中共鑒定到有984個(gè)巴豆?；揎椀鞍踪|(zhì)(3 396個(gè)位點(diǎn))[8, 52]。生物信息學(xué)分析表明巴豆?；揎椀鞍踪|(zhì)參與調(diào)控核糖體、糖酵解/糖異生、三羧酸循環(huán)、碳代謝、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化磷酸化、氨酰tRNA生物合成和蛋白酶體等多種代謝通路，對(duì)弓形蟲的生長(zhǎng)發(fā)育具有不可或缺的作用。其中弓形蟲RH株與ME49株在多個(gè)重要的代謝調(diào)控酶，如磷酸甘油酸激酶、醛脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、檸檬酸合酶I、烏頭水合酶等均存在巴豆?；揎椝讲町?，對(duì)弓形蟲不同毒力株的能量代謝過程可能具有重要的差異性調(diào)控作用。

1.11 二羥基異丁?；揎?2-hydroxyisobutylation)

賴氨酸2-羥基異丁?；且环N新發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾類型[53]。通過Label free技術(shù)在弓形蟲RH株中共鑒定到有1 950個(gè)二羥基異丁基?；揎椀鞍踪|(zhì)(9 502個(gè)位點(diǎn))，并在ME49株中共鑒定到1 720個(gè)二羥基異丁基酰化修飾蛋白質(zhì)(8 092個(gè)位點(diǎn))[8, 52]。KEGG富集分析表明二羥基異丁?；揎梾⑴c調(diào)控核糖體、糖酵解/糖異生、三羧酸循環(huán)、碳代謝、氨酰tRNA生物合成、蛋白酶體、剪切體和氨基酸的生物合成等多種生物學(xué)過程[8，54]。二羥基異丁?；揎棇?duì)弓形蟲肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白、微線體蛋白質(zhì)、棒狀體蛋白質(zhì)以及致密顆粒等均有重要的調(diào)控作用。與弓形蟲ME49株相比，二羥基異丁酰化修飾可能對(duì)弓形蟲RH株的修飾程度更高，特別是對(duì)其運(yùn)動(dòng)、毒力以及入侵宿主細(xì)胞的過程有著更重要的調(diào)控作用[8]。此外，相對(duì)于其他修飾，二羥基異丁?；揎椀耐枯^高(僅低于磷酸化修飾)，對(duì)弓形蟲的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。

1.12 丙二酰化修飾(malonylation)

賴氨酸丙二?；状问窃诓溉閯?dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的，它與脂肪酸合成、氧化和糖酵解過程有關(guān)[55-56]。在弓形蟲中共鑒定到300多個(gè)丙二?；揎椀鞍踪|(zhì)位于不同的亞細(xì)胞區(qū)室，并在糖酵解/糖異生、氨?；?tRNA生物合成、磷酸戊糖途徑和脂肪酸生物合成等代謝過程中均發(fā)揮重要的作用[57]。其中糖酵解過程重要的調(diào)控酶乳酸脫氫酶(LDH1)和3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)均發(fā)生丙二?；揎棧赡軐?duì)弓形蟲能量代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用。

2 蛋白質(zhì)翻譯后修飾之間的相互作用

蛋白質(zhì)翻譯后修飾相互作用發(fā)生在多種PTMs之間，其目的是共同調(diào)節(jié)弓形蟲多種生物學(xué)過程。弓形蟲具有一種稱為滑動(dòng)體的獨(dú)特機(jī)制，主要由在質(zhì)膜下的肌動(dòng)球蛋白組成[58]。蟲體可以依賴于該機(jī)制進(jìn)行滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)，以及進(jìn)入宿主細(xì)胞和從感染細(xì)胞中逸出等。弓形蟲滑動(dòng)體作為多個(gè)PTMs的主要靶標(biāo)，受多種修飾共同調(diào)節(jié)其滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)。如在弓形蟲中TgGAP45是一種滑動(dòng)體的核心成分，它能夠發(fā)生泛素化、肉豆蔻?；?、棕櫚?；?、二羥基異丁?；土姿峄揎?，在滑行運(yùn)動(dòng)、入侵和逸出過程中發(fā)揮作用[8, 13,59-60]。因此，PTMs的之間的相互作用對(duì)弓形蟲滑動(dòng)體有重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明21%泛素化蛋白質(zhì)也被乙酰化，同時(shí)泛素化和乙酰化之間的相互作用可以抑制泛素化修飾從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[61]。此外，磷酸化通常是泛素介導(dǎo)的降解的前提條件，且與甲基化修飾之間也存在相互作用[19, 62]。因此，不同PTMs之間可能具有相互協(xié)同或相互拮抗的作用，從而有序的調(diào)控弓形蟲的生物學(xué)過程。

基因表達(dá)是一個(gè)受多種因素調(diào)控的復(fù)雜過程。組蛋白是染色體中核小體基本結(jié)構(gòu)的重要組成部分，作者繪制了到目前為止已在弓形蟲組蛋白上鑒定出的所有PTMs修飾圖譜(圖1)，包括磷酸化、乙?；⒓谆?、磷酸化、巴豆酰化、二羥基異丁酰化、琥珀酰化、泛素化、糖基化等[8, 13-14, 19, 28, 38, 45]。與組蛋白H2Ba、H2Ax、H2Bb和H3相比，弓形蟲組蛋白H4、H3、H2Ba、H2Bv、H2Az具有更顯著的PTMs豐富度。此外，大部分組蛋白修飾位點(diǎn)均有多種修飾調(diào)控，其中H4K32、H4K68、H3K24、H3K28、H3K57、H2BaK71、H2BaK100、H2BaK112、H2AzK10和H2AzK18具有4種以上的PTMs，這可能是表觀遺傳調(diào)控的重要修飾位點(diǎn)。因此，弓形蟲組蛋白核心上的PTMs可能是寄生蟲生長(zhǎng)和分化的關(guān)鍵元件，其生物功能調(diào)節(jié)不是由單一類型的修飾完成的，而是由多種修飾的共同調(diào)節(jié)。目前，關(guān)于弓形蟲不同類型的PTMs之間的相互作用機(jī)制，人們?nèi)匀恢跎?，需要進(jìn)一步研究。

圖1 弓形蟲組蛋白PTMs修飾位點(diǎn)匯總(彩圖見OSID資料)

3 討論與展望

PTMs是指蛋白質(zhì)翻譯后的動(dòng)態(tài)可逆的化學(xué)修飾，在蛋白質(zhì)加工和成熟過程中起著重要作用，能夠改變其理化性質(zhì)，影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象和穩(wěn)定性[63-65]。PTMs在弓形蟲生物學(xué)的多方面都發(fā)揮重要作用(表1)，包括分化、運(yùn)動(dòng)、入侵、逸出、能量代謝、信號(hào)、傳導(dǎo)、應(yīng)激反應(yīng)、基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)相互作用和定位等[8,12-13,15,19,26,28,34,38,46,59,66-67]。

表1 弓形蟲蛋白質(zhì)翻譯后修飾匯總

隨著高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，PTMs已經(jīng)在許多不同生物中逐漸被解析[68-70]。在但鑒定生物樣品中的PTMs時(shí)仍然面臨許多挑戰(zhàn)，如鑒定到的數(shù)據(jù)仍然存在較高錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)、樣品數(shù)據(jù)污染以及技術(shù)方法等問題[71-72]。此外，傳統(tǒng)的質(zhì)譜技術(shù)在PTMs的研究中還存在靈敏度不夠等局限性；大多數(shù)的PTMs在樣本中通量低(包含低豐度蛋白質(zhì))且具有時(shí)空動(dòng)態(tài)等復(fù)雜性；一些同分異構(gòu)肽段通過質(zhì)譜無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確有效分離等一系列問題都會(huì)影響組學(xué)數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性。因此在評(píng)估數(shù)據(jù)時(shí)，必須盡可能考慮所有影響結(jié)果準(zhǔn)確性的因素，如數(shù)據(jù)庫(kù)的選擇、抗體質(zhì)量、蛋白質(zhì)提取效率、樣品純度、用于搜索數(shù)據(jù)庫(kù)的算法、PTM富集方法等。近期的研究表明，4D蛋白質(zhì)組學(xué)即在保留時(shí)間(retention time)、質(zhì)荷比(m/z)、離子強(qiáng)度(intensity)的基礎(chǔ)之上增加了第四個(gè)維度——離子淌度(mobility)[73]，使鑒定到的蛋白質(zhì)覆蓋度、檢測(cè)周期、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性等方面得到全面提升。未來隨著更多新技術(shù)的出現(xiàn)，人們期待能夠發(fā)現(xiàn)更多的PTMs類型，從而能勾畫一個(gè)全面且動(dòng)態(tài)的宿主細(xì)胞與弓形蟲的修飾網(wǎng)絡(luò)譜圖，為更好地解析蟲體與宿主相互作用奠定基礎(chǔ)。同時(shí)希望能夠?qū)蜗x不同發(fā)育階段(緩殖子、速殖子和卵囊)之間以及弓形蟲不同表型之間的PTMs進(jìn)行動(dòng)態(tài)且完整的圖譜分析，這將有助于闡明弓形蟲表型轉(zhuǎn)化和毒力變化的潛在機(jī)制。

PTMs是目前研究最為重要的前沿領(lǐng)域之一，在弓形蟲的生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用。PTMs需要一系列調(diào)控酶來實(shí)現(xiàn)正負(fù)可逆調(diào)節(jié)，如PATs、MYST-A、MYST-B、PRMTs、GCN5-A、GCN5-B、HDACs等都可能是研制抗弓形蟲藥物的重要靶標(biāo)[41, 74]。目前大多數(shù)弓形蟲PTMs研究主要還集中在生物信息學(xué)分析層面，未來的研究應(yīng)進(jìn)一步解析PTMs的生物學(xué)功能和利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)等對(duì)重要修飾蛋白質(zhì)進(jìn)行功能驗(yàn)證，以揭示PTMs在剛地弓形蟲中的確切作用。此外，現(xiàn)階段對(duì)于弓形蟲的組學(xué)研究相對(duì)比較單一，下一步應(yīng)該運(yùn)用多組學(xué)的聯(lián)合分析的方法(如蛋白質(zhì)組學(xué)、修飾組學(xué)、代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等)對(duì)弓形蟲及其與宿主細(xì)胞相互作用開展重要研究，從而更全面的揭示其生物學(xué)特征，以期為研制新型抗蟲藥物奠定基礎(chǔ)。