HPLC測定參附強(qiáng)心丸中東莨菪內(nèi)酯和7-羥基香豆素含量

吳穎欣王汝上（.廣東省佛山市中醫(yī)院　佛山　528000；2.廣州康臣藥物研究有限公司　廣州　50530）

HPLC測定參附強(qiáng)心丸中東莨菪內(nèi)酯和7-羥基香豆素含量

吳穎欣1王汝上2*（1.廣東省佛山市中醫(yī)院佛山528000；2.廣州康臣藥物研究有限公司廣州510530）

摘要：目的：建立HPLC法測定參附強(qiáng)心丸中東莨菪內(nèi)酯和7-羥基香豆素含量的方法。方法：采用二極管陣列檢測器，色譜柱為Phenomenex Luna C1（8250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.5%冰乙酸水溶液，梯度洗脫；流速為1.0mL/min；檢測波長為345nm。結(jié)果：東莨菪內(nèi)酯線性范圍為0.0760～0.3800μg（R2=0.999），平均回收率為104.54%，RSD為2.27%，重復(fù)性RSD為1.22%（n=6），精密度RSD為0.90%（n=6），穩(wěn)定性RSD為0.91%；7-羥基香豆素線性范圍為0.0300～0.1500μg（R2=0.999），平均回收率為102.51%，RSD為1.04%，重復(fù)性RSD為5.08%（n=6），精密度RSD為0.91%（n=6），穩(wěn)定性RSD為0.91%。結(jié)論：本研究所建方法穩(wěn)定、可靠，可作為該制劑的質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞：參附強(qiáng)心丸 HPLC東莨菪內(nèi)酯 7-羥基香豆素

參附強(qiáng)心丸處方由人參、桑白皮、附子（制）、葶藶子、豬苓、大黃組成，益氣助陽、強(qiáng)心利水，可用于慢性心力衰竭引起的心悸、氣短、胸悶喘促、面肢浮腫等證屬心腎陽衰者［1］。桑白皮是參附強(qiáng)心丸處方中的主要藥味之一，東莨菪內(nèi)酯和7-羥基香豆素為桑白皮中主要效應(yīng)成分。本文建立了HPLC法測定參附強(qiáng)心丸中東莨菪內(nèi)酯和7-羥基香豆素的方法，該方法結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好且快速簡便，可作為參附強(qiáng)心丸質(zhì)量的定量檢測方法。

1儀器與試藥

Agilent1200型高效液相色譜儀，DAD檢測器，Agilent ChemStations數(shù)據(jù)處理軟件（安捷倫科技有限公司）；Phenomenex Luna C1（8250mm×4.6mm，5μm）色譜柱；KQ3200DB型數(shù)控超聲儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；BS224S分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

參附強(qiáng)心丸（為大蜜丸，批號(hào)分別為：20150201、20150202、20150203，購于天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司達(dá)仁堂制藥廠）；東莨菪內(nèi)酯對照品（購于中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110768-200504）、7-羥基香豆素對照品（購于中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)111739-200501）；甲醇（色譜純，默克公司）；超純水（本實(shí)驗(yàn)室制備）；其他溶劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件：色譜柱為Phenomenex Luna C1（8250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-0.5%冰乙酸水溶液梯度洗脫，見表1，檢測波長為345nm，流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為10μL，理論板數(shù)按東莨菪內(nèi)酯峰面積計(jì)算不低于4000，色譜圖譜見圖1。

表1梯度洗脫

2.2樣品制備方法考察［2］：提取時(shí)間考察：本品適量，粉碎，取粉末約2 g，平行4份，精密稱定，置索氏提取器中，加入80mL95%乙醇分別提取4、5、6、7h，水浴蒸干，殘?jiān)?0mL0.5%H2SO4水溶液加熱回流3h，放冷，溶液用氯仿萃取4次，每次30mL，合并氯仿液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?0mL，搖勻，0.45μm濾膜濾過，即得。結(jié)果提取5h時(shí)東莨菪內(nèi)酯及7-羥基香豆素含量最高，因此，選擇提取時(shí)間為5h，結(jié)果見表2。

表2不同提取時(shí)間考察結(jié)果

酸處理時(shí)間考察：本品適量，粉碎，取粉末約2g，平行4份，精密稱定，置索氏提取器中，加入80mL95%乙醇提取5h，水浴蒸干，殘?jiān)?0mL0.5%H2SO4水溶液分別加熱回流2、3、4、5h，放冷，溶液用氯仿萃取4次，每次30mL，合并氯仿液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?0mL，搖勻，0.45μm濾膜濾過，即得。結(jié)果酸處理3h時(shí)東莨菪內(nèi)酯及7-羥基香豆素含量最高，因此，選擇酸處理時(shí)間為3h，結(jié)果見表3。

表3超聲時(shí)間考察結(jié)果

2.3對照品及供試品溶液制備：對照品溶液：分別取東莨菪內(nèi)酯及7-羥基香豆素對照品適量，精密稱定，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得兩者濃度分別為0.0206mg/mL和0.0105mg/ mL，作為東莨菪內(nèi)酯及7-羥基香豆素混合對照品溶液。

供試品溶液：本品適量，粉碎，取粉末約2g，平行4份，精密稱定，置索氏提取器中，加入80mL95%乙醇提取5h，水浴蒸干，殘?jiān)?0mL0.5%H2SO4水溶液加熱回流3h，放冷，溶液用氯仿萃取4次，每次30mL，合并氯仿液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?0mL，搖勻，0.45μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性樣品溶液：取不含桑白皮的糖腎處方量藥材，按成品制備工藝及供試品溶液制備方法制備。

2.4線性范圍、最低檢測限及最低定量限考察：分別取東莨菪內(nèi)酯及7-羥基香豆素對照品適量，精密稱定，置于100mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得東莨菪內(nèi)酯及7-羥基香豆素濃度分別為0.0760mg/mL、0.0300mg/mL混合對照品，備用。分別精密吸取上述對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，置于10mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，得系列稀釋對照品溶液。分別精密吸取以上對照品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程分別為Y=3828X-9.255（R2=0.999）、Y=2759X-2.455（R2=0.999）?？梢?，東莨菪內(nèi)酯進(jìn)樣量在0.0760～0.3800μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；7-羥基香豆素進(jìn)樣量在0.0300～0.1500μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

取東莨菪內(nèi)酯及7-羥基香豆素濃度分別為7.60μg/mL、3.00μg/mL的混合對照品溶液適量，分別稀釋至濃度為10、50、100倍，得稀釋后對照品溶液，各精密吸取10μL，測定，取峰面積為噪音三倍（S/N=3）時(shí)的進(jìn)樣量為最低檢測限（LOD），東莨菪內(nèi)酯及7-羥基香豆素檢測限分別為0.076μg/mL、0.060μg/mL；取峰面積為噪音十倍（S/N=10）時(shí)的進(jìn)樣量為最低定量限（LOQ），東莨菪內(nèi)酯及7-羥基香豆素定量限為0.152μg/mL、0.300μg/mL。

2.5精密度試驗(yàn)：取濃度分別為0.0206mg/mL、0.0105mg/mL東莨菪內(nèi)酯及7-羥基香豆素混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算RSD值，結(jié)果表明精密度良好。結(jié)果見表4。

表4精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)：分別精密吸取同一供試品溶液，于配制后0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣測定，結(jié)果表明24h內(nèi)穩(wěn)定，見表5。

表5穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.7重復(fù)性試驗(yàn)：取本品適量，粉碎，取粉末約2g，精密稱定，平行6份，按供試品溶液制備方法制備，分別進(jìn)樣2次，測定東莨菪內(nèi)酯及7-羥基香豆素的含量，計(jì)算RSD值，結(jié)果表明本法重復(fù)性良好，見表6。

表6重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.8加樣回收試驗(yàn)：取已知東莨菪內(nèi)酯及7-羥基香豆素含量的本品粉末約1.7g，分別平行6份，精密稱定；分別精密加入濃度分別為0.0206mg/mL、0.0105mg/mL的東莨菪內(nèi)酯及7-羥基香豆素混合對照品5mL，揮干，按供試品制備方法處理，按色譜條件項(xiàng)下方法進(jìn)樣10μL測定，每份樣品進(jìn)樣兩針，計(jì)算其回收率及RSD值，結(jié)果見表7。

表7加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.9三批樣品含量測定：分別取三批樣品粉末約2g，精密稱定，平行2份，按供試品制備方法處理，按色譜條件項(xiàng)下方法進(jìn)樣10μL測定，結(jié)果見表8。

表8三批樣品中東莨菪內(nèi)酯及7-羥基香豆素含量

可見，三批樣品東莨菪內(nèi)酯及7-羥基香豆素含量均較低，可以兩者之和作為含量指標(biāo)。

3討論

3.1色譜條件研究

3.1.1系統(tǒng)適應(yīng)性研究：色譜分離：本色譜條件下，東莨菪內(nèi)酯及7-羥基香豆素的色譜峰保留時(shí)間分別為42、40min，與其他峰分離良好，分離度均大于1.5，對稱性均大于0.94，符合標(biāo)準(zhǔn)。

理論塔板數(shù)：考慮到不同色譜柱條件（柱長、載體性能、填充情況、流動(dòng)相、使用時(shí)間等）差異，暫定東莨菪內(nèi)酯及7-羥基香豆素色譜峰的理論塔板數(shù)均不小于4000。

3.1.2波長選擇：取東莨菪內(nèi)酯及7-羥基香豆素混合對照品200～400nm波長處進(jìn)行紫外掃描，于345nm處有最大吸收，確定東莨菪內(nèi)酯及7-羥基香豆素的檢測波長為345nm。

3.1.3專屬性試驗(yàn)：分別取對照品溶液、供試品溶液以及陰性樣品各10μL，按色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果表明陰性無干擾。

本研究所建立方法簡便易行、結(jié)果準(zhǔn)確且重復(fù)性好，可作為參附強(qiáng)心丸質(zhì)量的定量檢測方法。

參考文獻(xiàn)

［1］張娟，孫琳，鄭歆，等.HPLC法測定參附強(qiáng)心丸中大黃素、大黃酚的含量［J］.世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2009，11（3）：457-460.

［2］徐小飛，陳康，陳燕霞，等.桑白皮蜜炙前后東莨菪內(nèi)酯含量變化研究［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，27（6）：579-581.

中圖分類號(hào)：R284

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-8351（2016）07-0006-03

*通訊作者

HPLC Determination of Scopoletin and 7-Hydroxycoumarin Content in Shenfu Qiangxin Pill

Wu Yingxin1Wang Rushang2*（1.Foshan Hospital of TCM，Guang Dong，F(xiàn)o Shan，528000；2.Guangzhou Consun Drug Research Ltd.，Guang Dong，Guang Zhou，510663）

Abstract：Objective：To study and to determine Scopoletin and 7-Hydroxycoumarin Content in Shenfu Qiangxin Pill using HPLC. Methods：The method adopts DAD detector，Phenomenex Luna C18（250mm×4.6mm，5μm）column，mobile phase was methanol（A）-0.2%aqueous acid aqueous solution（B），with gradient elute.The flow rate was 1.0 mL/min，detection wavelength was 280 nm. Results：Scopoletin linear in the range of 0.0760～0.3800μg（R2=0.999），the average recovery was 104.54%，RSD 2.27%repeatability RSD was 1.22%（n=6），precision RSD was 0.90%（n=6）stability of RSD is 0.91%；7-hydroxycoumarin linear in the range of 0.0300～0.1500μg（R2=0.999），the average recovery was 102.51%，RSD 1.04%repeatability RSD was 5.08%（n=6）precision RSD was 0.91% （n=6），the stability of RSD 0.91%.Conclusion：The method is stable and reliable with a good reproducibility and to be used to control its quality with combination assaying.

Key words:Shenfu Qiangxin Pill HPLC Scopoletin 7-Hydroxycoumarin