液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定乳制品中四種常用香料

林正鋒，李實(shí)飛，黃杰英，禤開智，王朝政

（?？诤ｊP(guān)技術(shù)中心，海南海口 570311）

乳制品是非常重要的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充，是日常飲食的重要組成部分，對(duì)增強(qiáng)國(guó)民身體素質(zhì)具有重要的意義，尤其是嬰幼兒乳粉作為嬰幼兒階段的主要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，更是人們關(guān)注的重點(diǎn)[1?2]。香蘭素和乙基香蘭素具有強(qiáng)烈的奶香味，麥芽酚和乙基麥芽酚是廣譜香味增效劑，此四種香料廣泛用于各種具有奶香味的食品中[3?5]。乳制品中添加食用香精香料可以提高食品的風(fēng)味，但長(zhǎng)期食用添加香精的奶粉可能使新生兒對(duì)其產(chǎn)生依賴性，過(guò)量攝入會(huì)引發(fā)潛在的健康問(wèn)題[6?7]，因此香精香料的超范圍及過(guò)量使用問(wèn)題日益引起人們的關(guān)注[8?9]。國(guó)家衛(wèi)計(jì)委發(fā)布實(shí)施的GB 2760-2014 《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中明確指出不得添加食用香料、香精有27 種食品，其中包括巴氏殺菌乳、滅菌乳、發(fā)酵乳、無(wú)水黃油、稀奶油和嬰幼兒配方乳粉等多種乳制品[10]。因此，建立靈敏度高、準(zhǔn)確可靠的乳制品中4 種常用香料的檢測(cè)方法對(duì)乳制品質(zhì)量安全監(jiān)管具有重要意義。

目前，此四種化合物同時(shí)檢測(cè)的方法主要有分光光度法[11]，高效液相色譜法（high performance liquid chromatography, HPLC）[12?13]，二維液相色譜法（two-dimensional liquid chromatography, 2DLC）[14]，氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS）[15]，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LCMS/MS）[16?17]等。其中，分光光度法和液相色譜法檢測(cè)限較高，多種乳制品中要求不得添加食用香精，較高的檢測(cè)限可能會(huì)導(dǎo)致低含量的添加樣品無(wú)法檢出；氣相色譜-質(zhì)譜法分析時(shí)間較長(zhǎng)；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品中香料物質(zhì)的檢測(cè)[18?19]。然而，在LCMS/MS 分析中，基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重影響定量分析的準(zhǔn)確度和精密度，目前文獻(xiàn)報(bào)道LC-MS/MS 測(cè)定乳粉中四種常用香料化合物均存在較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，需采用基質(zhì)匹配曲線或者內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析[16?17]，大大增加了檢測(cè)成本，此外，前處理過(guò)程需要對(duì)凈化液進(jìn)行濃縮，而揮發(fā)性較強(qiáng)的香料化合物在濃縮過(guò)程中易損失[20?21]。受酚類化合物可采用酸堿分配法凈化的啟發(fā)[22?23]，本文采用水-醚體系對(duì)乳制品樣品進(jìn)行提取，經(jīng)堿液反萃除去雜質(zhì)后采用高靈敏度高選擇性的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析四種化合物。通過(guò)研究不同比例堿醚比的堿液反萃醚相中的香料化合物，實(shí)現(xiàn)樣品凈化和富集同步進(jìn)行，整個(gè)過(guò)程無(wú)需氮吹濃縮，避免揮發(fā)性較強(qiáng)的香料化合物在氮吹濃縮過(guò)程中損失，以期建立一種靈敏度高、簡(jiǎn)便快捷、準(zhǔn)確可靠的乳制品中四種常用香料的檢測(cè)方法，為相關(guān)部門建立相關(guān)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)提供參考，保障乳制品的質(zhì)量安全。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、乙腈、叔丁基甲醚 色譜純，美國(guó)TEDIA 公司；甲酸 色譜純，德國(guó)CNW 公司；鹽酸、氫氧化鈉、氨水、無(wú)水硫酸鈉 分析純，廣州化學(xué)試劑廠；麥芽酚（純度≥99%）、乙基麥芽酚（純度≥99%）、香蘭素（純度≥98%）、乙基香蘭素（純度≥98%） 美國(guó)Sigma 公司；乳制品樣品（包括嬰幼兒配方乳粉、煉奶、黃油、奶酪、鮮牛奶、純牛奶、稀奶油、酸奶等共15 份） 均購(gòu)自?？谑斜镜卮笮统小?/p>

色譜柱：HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm,2.5 μm） 、 BEH C18色譜柱（ 100 mm×2.1 mm,1.7 μm）、HLB 固相萃取柱（100 mg, 3 mL）、TQD 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Waters 公司；PXA 固相萃取柱（150 mg, 6 mL） 迪馬公司；KQ3200DE 超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；MS3 渦旋儀 德國(guó)IKA 公司；320 R 低溫離心機(jī)德國(guó)Hettich 公司；Advantage A10 超純水凈化儀美國(guó)Millipore 公司；Genevac EZ-2 型溶劑蒸發(fā)工作站 英國(guó)SP Scientific 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 奶粉、奶酪、煉奶、黃油等類固體乳制品：稱取2 g 試樣（精確至0.01 g），置于50 mL聚丙烯離心管中，加入5 mL 50 ℃的水（黃油樣品置于100 ℃烘箱中加熱使之溶解，煉奶用4 mL 水溶解），3000 r/min 渦旋混勻2 min，40 ℃下超聲提取15 min，超聲頻率為37 kHz，再加入20 mL 叔丁基甲醚，3000 r/min 渦旋混勻3 min, 再加入10 g 無(wú)水硫酸鈉除水，3000 r/min 渦旋混勻2 min，9000 r/min離心3 min，吸取上清液10 mL 轉(zhuǎn)移至另一離心管中，再加入2 mL 0.2 mol/L 氫氧化鈉溶液反萃，3000 r/min 渦旋混勻1 min 后，3000 r/min 離心3 min，用移液器準(zhǔn)確移取下層清液0.9 mL 至刻度試管中，加甲酸定容至1.0 mL 過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，供液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定。

過(guò)柱凈化富集過(guò)程：吸取上清液5 mL 轉(zhuǎn)移至另一離心管，加入5 mL 0.2 mol/L 氫氧化鈉溶液反萃，去掉上清液，40 ℃下用 Genevac EZ2 溶劑蒸發(fā)工作站濃縮20 min，除去微量的叔丁基甲醚。

HLB 過(guò)柱方法：除醚后用鹽酸調(diào)節(jié)pH 至3.0，先后加入3 mL 甲醇，3 mL 超純水活化固相萃取柱，然后全部上樣，樣液體積約為4.5 mL，重力過(guò)柱后，用5 mL 純水淋洗，棄去淋洗液，接著用5 mL 注射器抽干，最后用1 mL 甲醇洗脫。

PXA 過(guò)柱方法：先后加入3 mL 甲醇，3 mL 超純水活化固相萃取柱，然后全部上樣，樣液體積約為4.5 mL，重力過(guò)柱后，分別用3 mL 5%氨水甲醇和3 mL 甲醇淋洗，抽干，最后用1 mL 5%甲酸甲醇洗脫。

巴氏殺菌乳、滅菌乳、發(fā)酵乳、稀奶油等液體乳制品，直接稱取5 g 試樣于50 mL 聚丙烯離心管中，再加入20 mL 叔丁基甲醚提取，后處理步驟同奶粉等樣品。

1.2.2 色譜-質(zhì)譜條件 色譜柱：HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm, 2.5 μm, Waters）；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：3 μL；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相，A 相為甲醇，B 相為0.05%甲酸水，梯度洗脫程序?yàn)?～1.0 min，10%～25%A， 1.0～5.0 min， 25%A， 5.0～5.1 min，25%～60%A，5.1～6.0 min，60%A，6.0～6.1 min，60%～90%A， 6.1 ～7.0 min， 90%A， 7.0～7.1 min， 90%～10%A，7.1 ～8.0 min，10%A。

MS 條件：電噴霧正離子源（ESI+），毛細(xì)管電壓：3.0 kV，離子源溫度：150 ℃，脫溶劑管溫度：350 ℃，霧化氣：150 L/h 氮?dú)?，干燥氣?50 L/h 氮?dú)猓鲎矚猓簹鍤?。掃描模式：多反?yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），具體條件見(jiàn)表1，帶星號(hào)離子為定量離子。

表1 四種化合物保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention times and mass spectrum parameters for 4 compounds

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)Masslynx 工作站及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)采集分析質(zhì)譜圖，外標(biāo)法定量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均值表示，每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行三次，采用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

配制1 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于進(jìn)樣瓶中，采用儀器自動(dòng)進(jìn)樣進(jìn)入質(zhì)譜儀，在Masslynx 軟件中設(shè)置質(zhì)譜條件，并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行離子調(diào)諧，根據(jù)響應(yīng)穩(wěn)定、信號(hào)強(qiáng)度較高、干擾少的碎片確定定量離子對(duì)和定性離子對(duì)，具體參數(shù)見(jiàn)表1。

本文比較了HSS T3 色譜柱和BEH C18色譜柱對(duì)四種化合物的分離效果，兩種色譜柱對(duì)四種化合物的分離效果見(jiàn)圖1。由圖1 可以看出，HSS T3 色譜柱對(duì)四種化合物的分離效果明顯優(yōu)于BEH C18色譜柱，且峰形良好。尤其是對(duì)于麥芽酚和乙基麥芽酚的峰形和響應(yīng)有很好的改善作用，這是由于T3 色譜柱可以更好地保留麥芽酚等極性較大的化合物。楊華梅等[16]采用BEH C18色譜柱分離四種化合物時(shí)存在香蘭素和乙基麥芽酚保留時(shí)間重疊嚴(yán)重的現(xiàn)象，而林仙軍等[24]采用HSS T3 色譜柱分離乙基麥芽酚和香蘭素時(shí)，兩種化合物可實(shí)現(xiàn)基線分離且峰形較好?？疾炝怂?乙腈和水-甲醇流動(dòng)相體系對(duì)四種化合物的分析效果影響，發(fā)現(xiàn)以水-甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，四種化合物的響應(yīng)明顯優(yōu)于水-乙腈流動(dòng)相體系。并在此基礎(chǔ)上考察了甲醇-水、甲醇-0.05%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水對(duì)色譜峰的影響，發(fā)現(xiàn)添加甲酸后，質(zhì)譜響應(yīng)增強(qiáng)，0.05%甲酸水和0.1%甲酸水響應(yīng)無(wú)明顯差別，故最終采用甲醇-0.05%甲酸水作為流動(dòng)相，在此條件下，四種化合物色譜圖見(jiàn)圖1B。

圖1 兩種色譜柱分離效果比較Fig.1 Comparison of separate effect of two kinds of chromatographic columns

2.2 凈化富集方法的選擇

為了提高方法檢出限和準(zhǔn)確度，需要對(duì)提取液進(jìn)行富集及凈化，本文采用富集倍數(shù)同為5 倍的4 種方式對(duì)空白加標(biāo)樣品進(jìn)行處理，分別為：a.取5 mL叔丁基甲醚直接吹干后定容上機(jī)分析；b.取5 mL 叔丁基甲醚用5 mL 堿液反萃后調(diào)節(jié)pH 用HLB 富集；c.取5 mL 叔丁基甲醚用5 mL 堿液反萃后用PAX富集；d.取5 mL 叔丁基甲醚用1 mL 堿液反萃后調(diào)酸上機(jī)分析；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四種香料化合物在氮吹的過(guò)程中均有一定程度的損失，尤其是香蘭素和麥芽酚回收率低于80%。采用固相萃取柱富集時(shí)，微量的叔丁基甲醚會(huì)造成目標(biāo)物大量損失，即使采用真空除去叔丁基甲醚后，麥芽酚回收率仍低于80%難以滿足要求。而采用堿液和叔丁基甲醚比例為1:5 進(jìn)行反萃時(shí)四種化合物的回收率均大于90%，故最終采用的凈化富集方式為堿液反萃。不同處理下四種化合物回收率見(jiàn)表2。

表2 不同凈化富集方式四種香料化合物回收率Table 2 Recoveries of four flavor compounds by different purification and enrichment methods

麥芽酚、乙基麥芽酚、香蘭素和乙基香蘭素均呈弱酸性，在高堿性條件下能形成離子狀態(tài)，使其在水中溶解性大大提高，可從醚相中提取出來(lái)[25]?？疾炝嗽诓煌瑝A液和叔丁基甲醚比例下，四種化合物的回收率和基質(zhì)效應(yīng)，由圖2 可以看出，當(dāng)堿液和叔丁基甲醚比例低于1:5 時(shí)，四種化合物回收率超過(guò)90%，而堿液和叔丁基甲醚比例達(dá)到1:10 時(shí)，麥芽酚和乙基麥芽酚回收率大大降低。以陰性的奶粉基質(zhì)按照方法進(jìn)行提取，按相應(yīng)的堿醚比例反萃得到的基質(zhì)液配制50 ng/mL 濃度的標(biāo)準(zhǔn)品與純?nèi)軇┡渲频?0 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)品的響應(yīng)值進(jìn)行比較考察其基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)（ME）=陰性樣品基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰面積/純?nèi)軇┡渲茦?biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積）×100[26]。結(jié)果表明，隨著堿醚比例的降低，基質(zhì)效應(yīng)逐漸減弱，說(shuō)明減少堿醚體積比可以有效去除雜質(zhì)，當(dāng)堿醚比例為1:1 和1:3 時(shí)，麥芽酚存在較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)，而當(dāng)堿醚比低于1:5 時(shí)，各項(xiàng)目的基質(zhì)效應(yīng)均在80%～100%之間。為獲得最大的富集倍數(shù)，提高方法的靈敏度，同時(shí)保證較好的回收率，最終采用堿液和叔丁基甲醚比例為1:5 進(jìn)行反萃，可實(shí)現(xiàn)5 倍富集并獲得良好的凈化效果。

圖2 不同堿醚比例堿液萃取時(shí)目標(biāo)物的回收率和基質(zhì)效應(yīng)Fig.2 Recoveries and matrix effects of target compounds using different ratios of alkali solution and MTBE

2.3 線性范圍和定量限

將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，（濃度范圍為2～100 ng/mL），在本方法所確定的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行分析，以定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)作圖建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，四種化合物線性方程見(jiàn)表3，結(jié)果表明，四種化合物在2～100 ng/mL 范圍內(nèi)線性決定系數(shù)均大于0.995。根據(jù)3 倍信噪比，并計(jì)入試樣量和定容體積，計(jì)算檢出限（limit of detection, LOD），定量限（limit of quantity, LOQ）則根據(jù)10 倍信噪比計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表3，從表3 中可以看出，乳粉等固體樣品中麥芽酚和乙基香蘭素定量限為2 μg/kg，乙基麥芽酚定量限為4 μg/kg，香蘭素定量限為8 μg/kg，均低于10 μg/kg。

表3 四種化合物線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear regression equation, correlation coefficient, LOD and LOQ of 4 compounds

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

采用液質(zhì)聯(lián)用分析復(fù)雜基質(zhì)時(shí)通常存在基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果有重要影響[27]，因此需要考察本方法的基質(zhì)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)以陰性的8 種基質(zhì)按照方法分別進(jìn)行提取凈化，用得到的凈化液配制50 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品，每種做3 個(gè)平行，將得到的響應(yīng)值的平均值和純?nèi)軇┡渲频?0 ng/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)品的響應(yīng)值進(jìn)行比較，通過(guò)二者比值來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，得出目標(biāo)化合物在8 種基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)。四種化合物在各種乳制品中的基質(zhì)效應(yīng)在80%～100%的范圍內(nèi)，具體結(jié)果見(jiàn)表4。說(shuō)明乳制品基質(zhì)對(duì)四種化合物存在微弱的基質(zhì)抑制效應(yīng)，實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中可采用溶劑配制曲線直接定量[26]。本方法基質(zhì)效應(yīng)低于水體系提取固相萃取柱凈化方法[16?17]，說(shuō)明前處理取得了很好的凈化效果。這主要是因?yàn)榧尤氪罅康牧蛩徕c形成鹽析使蛋白質(zhì)沉淀，通過(guò)堿液反萃可有效去除脂肪等不溶于堿性水溶液的有機(jī)化合物雜質(zhì)[22?23]，從而明顯降低基質(zhì)效應(yīng)，有助于更準(zhǔn)確地定量。

表4 四種化合物在不同乳制品中的基質(zhì)效應(yīng)Table 4 Matrix effects of 4 compounds in different dairy products

2.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

在上述確定的色譜條件和前處理?xiàng)l件下，在未標(biāo)注添加食用香精的不同基質(zhì)中添加三個(gè)不同濃度水平的香料進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，其平均回收率與精密度見(jiàn)表5，從表5 可以看出，四種化合物在各基質(zhì)中三種濃度水平下，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.5%～11.9%，除煉奶和黃油外，其它基質(zhì)中平均回收率在80.4%～104.8%之間，加標(biāo)回收率和精密度均符合GB/T 27404-2008[28]的要求，整個(gè)結(jié)果表明本方法檢測(cè)穩(wěn)定性較好。煉奶和黃油的回收率相對(duì)偏低，平均回收率在67.7%～84%之間，可能是由于煉奶基質(zhì)較為粘稠，提取效率低，而黃油在加熱溶解過(guò)程中易造成目標(biāo)物的損失，此兩種乳制品中四種香料化合物的測(cè)定應(yīng)采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正。

表5 乳制品中四種化合物加標(biāo)回收和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 5 Recoveries and relative standard deviations（RSDs）of 4 spices in dairy products（n=6）

2.6 與其它方法的比較

針對(duì)奶粉中四種香料化合物的檢測(cè)，將所建立的方法與文獻(xiàn)報(bào)道中的方法進(jìn)行比較（表6），結(jié)果表明，此方法具有靈敏度高（檢出限為0.6～2.4 μg·kg?1），分析時(shí)間短，基質(zhì)效應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)。

表6 本方法與文獻(xiàn)方法的比較Table 6 Comparison of methods from literature reports and this work

2.7 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用該方法對(duì)市售15 件乳制品樣品（4 份樣品標(biāo)注添加食用香精，1 份奶粉樣品標(biāo)注添加香蘭素）進(jìn)行分析測(cè)定。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表7，由表7 可知，標(biāo)注添加食用香精樣品確實(shí)檢出了四種香料中的一種或多種，說(shuō)明了此四種化合物在乳制品中的應(yīng)用較為廣泛。需要注意的是，GB 2760-2014 規(guī)定發(fā)酵乳不得添加食用香精香料，但是有的乳制品生產(chǎn)企業(yè)按照GB 19302-2010[30]生產(chǎn)的酸奶配料表仍含有食用香精，此外，麥芽酚在多個(gè)未標(biāo)注添加香精的乳制品中有檢出，而其它三種香料化合物在未標(biāo)注添加香精均未檢出，可能是因?yàn)樵谌橹破窡峒庸み^(guò)程中，發(fā)生美拉德反應(yīng)生成麥芽酚[31?32]，不同樣品麥芽酚含量差異較大，應(yīng)研究其內(nèi)源性產(chǎn)生的麥芽酚水平以便制定合適的限量值以判斷是否有額外添加。

表7 實(shí)際樣品中4 種化合物含量的檢測(cè)結(jié)果Table 7 Analysis results of four compounds in actual samples

3 結(jié)論

建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定乳制品中麥芽酚、乙基麥芽酚、香蘭素和乙基香蘭素含量的方法，前處理采用水-叔丁基甲醚提取，氫氧化鈉溶液反萃實(shí)現(xiàn)富集和凈化后調(diào)酸分析。此方法前處理成本低，快速高效，凈化效果好，儀器分析時(shí)間短，靈敏度高，四種化合物在各種乳制品中呈弱基質(zhì)抑制效應(yīng)，無(wú)需采用基質(zhì)曲線或者內(nèi)標(biāo)校正補(bǔ)償其基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明該檢測(cè)分析方法穩(wěn)定、可靠、易于推廣，可應(yīng)用于不同乳制品中四種香料化合物的檢測(cè)，有望為相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。