花蜜酒發(fā)酵工藝優(yōu)化及成分分析

喬惠田，黃瀟瀟，遆永瑞，宋子涵,*，張鵬遠(yuǎn),*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2.北京建工建筑設(shè)計(jì)研究院，北京 100044）

蜂蜜是蜜蜂采集蜜源植物的花粉后并經(jīng)過(guò)自身釀造而產(chǎn)生的一種甜味物質(zhì)[1]。人類(lèi)食用蜂蜜距今已有5000 多年的歷史[2]。蜂蜜中含有豐富的酶類(lèi)、有機(jī)酸、維生素、蛋白質(zhì)等高級(jí)營(yíng)養(yǎng)成分，是具有一定保健功能的食藥同源中的藥材。因此，蜂產(chǎn)品的相關(guān)研發(fā)也在近幾年得到突飛猛進(jìn)的發(fā)展。蜂蜜作為天然的營(yíng)養(yǎng)佳品和獨(dú)特的甜味物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于功能飲料的加工中。王虹玲等[3]以西瓜皮、蜂蜜為主要原料，利用微生物發(fā)酵，研發(fā)出口感清新的蜂蜜西瓜皮乳酸發(fā)酵飲料。黃琳等[4]以蜂蜜、澳洲淡色艾爾大麥芽、澳洲水晶焦香麥芽和酒花為原料，釀制成蜂蜜艾爾精釀啤酒。添加蜂蜜后的啤酒具有蜂蜜特殊的香氣，整體香氣協(xié)調(diào)，口感豐富。蜂蜜因其特殊的營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味，也被廣泛應(yīng)用于番茄蜂蜜果酒[5]、芒果蜂蜜果酒[6]、蜂蜜南瓜酒[7]等果酒釀造。

世界上蜂蜜酒的飲用歷史悠久，我國(guó)是世界上最先釀造蜂蜜酒的國(guó)家之一。蜂蜜酒是將蜂蜜作為原料進(jìn)行發(fā)酵的酒，其發(fā)展歷史比葡萄酒和啤酒還要早上幾千年。蜂蜜中原有的氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分在釀酒過(guò)程中被保留，蜂蜜酒具有健脾通腸、美容養(yǎng)顏、開(kāi)胃等保健功效[8]。根據(jù)蜜蜂采集蜜源植物種類(lèi)和比例不同，可將蜂蜜分為單花蜜和百花蜜[9]。單花蜜產(chǎn)量較高，價(jià)格相對(duì)較低。百花蜜產(chǎn)量低，價(jià)格相對(duì)較高。由于蜜蜂品種和蜜源植物的種類(lèi)、性質(zhì)不同，蜂蜜的活性成分和品質(zhì)也不盡相同[10]，例如桉樹(shù)蜜因黃酮含量高，可以有效抑制幽門(mén)螺桿菌的生長(zhǎng)[11]，石楠蜜含有酚酸類(lèi)物質(zhì)，具有良好的抗氧化功效[12]。百花蜜的黃酮、總酚酸相比單花蜜更高，且含糖量更高[13]。有研究表明，中華蜂所產(chǎn)百花蜜具有較高的藥用價(jià)值。中華蜂善于采集山區(qū)的蜜源植物，釀制的百花蜂蜜具有清熱解毒之功效和補(bǔ)氣養(yǎng)血之作用。在人們崇尚自然的今天，中華蜂百花蜜具有廣闊的應(yīng)用前景[14]。

蜂蜜因含糖量較高而產(chǎn)生較高的滲透壓，含氮物質(zhì)較少[15]，因此酵母菌發(fā)酵緩慢，制約了蜂蜜酒的釀造。此外，蜂蜜酒在加工過(guò)程中也存在酸度過(guò)高、二次發(fā)酵、異味等問(wèn)題，導(dǎo)致產(chǎn)品感官品質(zhì)低[16]。不同品種的蜂蜜所含風(fēng)味物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分有較大差別，發(fā)酵型蜂蜜酒的品質(zhì)也存在很大的差異。因此，需要考慮百花蜜釀造花蜜酒的關(guān)鍵技術(shù)，包含酵母種類(lèi)、酵母添加量和發(fā)酵過(guò)程中的工藝優(yōu)化等。

本文研究?jī)?nèi)容如圖1 所示，旨在采用野生蜜源植物極為豐富的北京市密云縣馮家峪鎮(zhèn)百花蜜為原料，對(duì)花蜜初始糖度含量、酵母種類(lèi)、酵母添加量和發(fā)酵溫度進(jìn)行優(yōu)化，研發(fā)出一種香氣協(xié)調(diào)、口感細(xì)膩、酒體飽滿(mǎn)的蜂蜜酒，并對(duì)最優(yōu)工藝釀造的花蜜酒品質(zhì)進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分和香氣評(píng)價(jià)，為花蜜酒的釀造提供理論依據(jù)。

圖1 研究示意圖Fig.1 Schematic representation for this study

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

百花蜜 馮家峪鎮(zhèn)中華蜂農(nóng)村合作社；BV818 安琪葡萄酒高活性干酵母、帝伯仕葡萄酒·果酒專(zhuān)用酵母、M05 蜂蜜酒酵母、娃哈哈飲用純凈水北京永旺超市；蘋(píng)果酸、琥珀酸、草酸、檸檬酸等均為分析純（≥98%），上海源葉公司。

LH-F90 蜂蜜數(shù)顯折射儀 LH 陸恒生物；Agilent 7890B-5977B MSD 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀美國(guó)安捷倫公司；DIONX ICS-3000 戴安離子色譜美國(guó)戴安公司；0044 酒精計(jì) 創(chuàng)紀(jì)儀器儀表有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花蜜酒發(fā)酵工藝 用1 L 娃哈哈飲用純凈水稀釋花蜜至不同糖度，將配好的花蜜溶液加熱至80 ℃，保持30 min[17]，經(jīng)殺菌后冷卻至室溫。冷卻后的花蜜溶液接種一定量的酵母，在18 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵14 d，發(fā)酵液用200 目的尼龍布過(guò)濾。發(fā)酵后的花蜜酒加入焦亞硫酸鉀溶液終止發(fā)酵，并倒罐澄清，陳釀至清亮透明。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 初始糖度對(duì)花蜜酒的影響 葡萄糖、果糖和蔗糖是花蜜的主要成分，可被酵母直接利用[18]，因此花蜜酒無(wú)需添加其他發(fā)酵底物。本試驗(yàn)用1 L 娃哈哈飲用純凈水稀釋花蜜至不同的糖度，設(shè)定糖度分別為10、14、18、22、26 °Brix。將上述調(diào)配好的花蜜溶液加熱至80 ℃，保持30 min，經(jīng)巴氏殺菌后冷卻至室溫，加入0.4 g/L 安琪葡萄酒高活性干酵母，在18 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵14 d。根據(jù)花蜜酒的酒精度、殘?zhí)呛亢透泄僭u(píng)價(jià)，確定最適發(fā)酵糖度。

1.2.2.2 酵母種類(lèi)對(duì)花蜜酒的影響 花蜜酒釀造過(guò)程中的酵母菌株需具有耐高溫和高糖的特點(diǎn)，這對(duì)花蜜酒成功釀造起著決定性的作用[19]。調(diào)節(jié)花蜜溶液糖度至22 °Brix，將調(diào)配好花蜜溶液加熱至80 ℃，保持30 min，經(jīng)巴氏殺菌后冷卻至室溫，分別接種0.4 g/L 安琪葡萄酒高活性干酵母、0.4 g/L 帝伯仕葡萄酒·果酒專(zhuān)用酵母和0.4 g/L M05 蜂蜜酒酵母，在18 ℃下發(fā)酵14 d。測(cè)定酒精度、殘?zhí)呛亢透泄僭u(píng)價(jià)，確定最適發(fā)酵的酵母。

1.2.2.3 酵母添加量對(duì)花蜜酒的影響 調(diào)節(jié)花蜜溶液糖度至22 °Brix，將調(diào)配好花蜜溶液加熱至80 ℃，保持30 min，經(jīng)巴氏殺菌后冷卻至室溫，分別接種0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L 的安琪葡萄酒高活性干酵母。在18 ℃下發(fā)酵14 d。測(cè)定酒精度、殘?zhí)呛亢透泄僭u(píng)價(jià)，確定最佳發(fā)酵接種量。

1.2.2.4 發(fā)酵溫度對(duì)花蜜酒的影響 調(diào)節(jié)花蜜溶液糖度至22 °Brix，將調(diào)配好花蜜溶液加熱至80 ℃,保持30 min，經(jīng)巴氏殺菌后冷卻至室溫，分別接種0.4 g/L安琪葡萄酒高活性干酵母。在9、12、15、18、21 ℃下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵14 d。測(cè)定酒精度、殘?zhí)呛亢透泄僭u(píng)價(jià)，確定最佳發(fā)酵溫度。

1.2.2.5 花蜜酒發(fā)酵工藝條件的正交試驗(yàn) 結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用初始糖度（A）、酵母種類(lèi)（B）、酵母添加量（C）和發(fā)酵溫度（D）作為考察因素，選用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)分析，以發(fā)酵酒的感官評(píng)分為衡量指標(biāo)，試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1 所示。

1.2.3 測(cè)定方法

1.2.3.1 花蜜酒感官評(píng)價(jià)方法 在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院感官分析實(shí)驗(yàn)室按照GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行感官分析[20]。味覺(jué)小組由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所師生和北京建工建筑設(shè)計(jì)研究院10 位專(zhuān)家組成（5 男5 女），年齡在22～40 歲之間。陳釀后對(duì)花蜜酒進(jìn)行感官評(píng)估。在分析過(guò)程中，品酒人員品嘗了兩次花蜜酒，并要求小組成員在品嘗下一瓶花蜜酒之前聞咖啡豆以清除前一次留下的酒香，并用水漱口兩次，持續(xù)20 s。

對(duì)花蜜酒的色澤、香氣、口感和后味等感官特性及產(chǎn)品指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，滿(mǎn)分 100 分，感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)如表2 所示。

表2 花蜜酒感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evalution standard of nectar wine

1.2.3.2 花蜜酒酒精度檢測(cè) 依據(jù)GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測(cè)定花蜜酒中酒精度含量[20]。用容量瓶稱(chēng)取100 mL 花蜜酒于500 mL蒸餾瓶中，用50 mL 蒸餾水沖洗容量瓶三次，洗液倒入蒸餾瓶中，再加入適量玻璃珠，連接冷凝器，以取樣用的原容量瓶作為接收器（外部冰?。?。開(kāi)啟冷卻水，緩慢加熱蒸餾，收集餾出液接近刻度，取下容量瓶，塞蓋。20 ℃水浴保溫30 min，補(bǔ)加水至刻度，混勻，備用。將試樣倒入干凈干燥的500 mL 量筒中，靜置5 min，待其氣泡消失，放入干燥的酒精計(jì)，不得接觸量筒壁，同時(shí)插入溫度計(jì)，平衡 5 min，水平觀測(cè)，讀取刻度值，并記錄溫度。根據(jù)國(guó)標(biāo)附錄將酒精計(jì)讀數(shù)和溫度，換成20 ℃時(shí)酒精溫度。

1.2.3.3 花蜜酒殘?zhí)呛繖z測(cè) 花蜜酒殘?zhí)呛坎捎檬殖终酃鈨x進(jìn)行測(cè)定，單位為 °Brix。

1.2.4 花蜜酒發(fā)酵優(yōu)化后的成分分析

1.2.4.1 花蜜酒中的葡萄糖、果糖和蔗糖含量測(cè)定根據(jù)GB/T 18932.22《蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖含量的測(cè)定方法-液相色譜示差折光檢測(cè)法》測(cè)定蜂蜜酒中的葡萄糖、果糖和蔗糖含量，該方法檢測(cè)準(zhǔn)確度較高[21?22]。

將不同濃度的果糖、葡萄糖和蔗糖標(biāo)準(zhǔn)工作液分別注入戴安離子色譜DIONX ICS-3000 液相色譜儀，以峰高為縱坐標(biāo)，工作溶液的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.4.2 花蜜酒中的有機(jī)酸含量測(cè)定 試驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定有機(jī)酸成分含量[23]。

樣品前處理：準(zhǔn)確稱(chēng)取蘋(píng)果酸、琥珀酸、草酸和檸檬酸四種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。稱(chēng)取花蜜酒在10000 r/min 離心10 min 后，用HCl 水溶液洗脫，收集洗脫液調(diào)節(jié)pH 至3.0，取上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾。

試驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定有機(jī)酸成分含量。將待測(cè)樣品用 0.22 μm 濾膜過(guò)濾至液相小瓶中，上機(jī)測(cè)定。色譜柱是Agilent 5TC-C18柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm），流動(dòng)相采用pH 為2.7 的（NH4）2HPO4-H3PO4溶液，利用等度洗脫法進(jìn)行洗脫。柱溫設(shè)為25 ℃，流速為0.7 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL。

1.2.4.3 花蜜酒中的揮發(fā)性成分及含量測(cè)定 花蜜酒中揮發(fā)性化合物含量較低，但卻決定著酒體的風(fēng)味和品質(zhì)。本研究采用固相微萃取和GC-MS 分析方法檢測(cè)揮發(fā)性化合物。

固相微萃?。簽榱颂崛』劬浦袚]發(fā)性化合物，將15 mL 蜜酒加入頂空瓶緊緊蓋上，40 ℃ 水浴加熱，讓香氣成分揮發(fā)；然后將固相萃取裝置SUPELCO 50/30 DVB/CAR/PDMS（57298-U）固定在頂空瓶上端，平衡20 min 后，推出針頭，保持針頭在頂空瓶?jī)?nèi)部且不接觸酒液，吸附10 min，再用GCMS 分析方法進(jìn)行檢測(cè)揮發(fā)性化合物。

進(jìn)樣方式：采用Gerstel 全自動(dòng)樣品前處理平臺(tái)；色譜柱：TG-5SILMS（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：270 ℃；柱箱升溫程序：40 ℃ 保持5 min，以15 ℃/min 升至280 ℃，保持5 min，以15 ℃/min升至205 ℃，保持5 min；恒流模式2.0 mL/min；采用分流進(jìn)樣，分流比10:1；離子源溫度：230 ℃，四級(jí)桿溫度：150 ℃，輔助加熱：280 ℃；掃描模式：SCAN，掃描范圍29～550 m/z，閾值150。在NIST（05.L Database）譜庫(kù)中進(jìn)行了香氣成分對(duì)比。

1.2.4.4 花蜜酒中的氨基酸成分測(cè)定 氨基酸的測(cè)定和分析按照苗雨田等[24]報(bào)道的方法進(jìn)行。取20 mL花蜜酒和20 mL 6% 磺基水楊酸溶液振蕩混勻，靜置后取上清液，用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取2 mL 用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定。

色譜分析條件：進(jìn)樣量為50 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為570、440 nm；茚三酮流速為0.25 mL/min，流動(dòng)相流速為0.45 mL/min；反應(yīng)器溫度為130 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)分析均采用SAS 9.3（SAS institute -institute, Cary, NC, USA）進(jìn)行單因素方差分析（oneway variance, ANOVA），在P<0.05 顯著水平下采用鄧肯檢驗(yàn)（Duncan’s test）進(jìn)行差異顯著性檢測(cè)。繪圖采用Ai Illstrator CS6 軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 花蜜酒初始糖度對(duì)花蜜酒品質(zhì)影響 花蜜酒初始糖度是影響花蜜酒品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一，初始糖度不僅影響花蜜酒的口感，還影響生物胺的生成, 選擇適當(dāng)?shù)某跏继嵌葘?duì)花蜜酒品質(zhì)至關(guān)重要[24]。初始糖度決定了酒精度和殘?zhí)橇?，是花蜜酒釀造過(guò)程中最重要的工藝條件之一。由表3 可知，感官評(píng)分由高到低對(duì)應(yīng)的初始糖度為22 °Brix>18 °Brix>14 °Brix>26 °Brix>10 °Brix，即初始發(fā)酵糖度為22 °Brix 時(shí)花蜜酒品質(zhì)最好。通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵初始糖度越低，酒精度越低，所產(chǎn)生的花蜜酒酒體單薄。發(fā)酵初始糖度越高，蜜香濃厚，發(fā)酵后甜度更高，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，口感協(xié)調(diào)度較差。此外，楊曉滿(mǎn)等[17]的研究表明，糖度對(duì)花蜜酒中組胺和酪胺的形成有顯著影響，當(dāng)醪液的糖度為30 °Brix 時(shí), 組胺和酪胺含量高達(dá)3. 48 mg/L 和13. 01 mg/L, 是初始糖度為21 °Brix時(shí)的2.0 倍，可能造成人過(guò)敏現(xiàn)象，綜合考慮以上結(jié)論，初步確定初始糖度為22 °Brix。

表3 不同初始糖度對(duì)花蜜酒品質(zhì)影響Table 3 Effects of different initial sugar levels on the quality of nectar wine

2.1.2 酵母種類(lèi)對(duì)花蜜酒品質(zhì)影響 酵母種類(lèi)是決定酒品質(zhì)的又一重要因素。實(shí)驗(yàn)選擇了工業(yè)化生產(chǎn)中常用的安琪葡萄酒高活性干酵母、釀酒品質(zhì)較高的帝伯仕葡萄酒·果酒專(zhuān)用酵母和蜂蜜釀造專(zhuān)用的M05 蜂蜜酒酵母進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。酵母可以使糖度轉(zhuǎn)化為酒精，從表4 可以看出，帝伯仕葡萄酒·果酒專(zhuān)用酵母發(fā)酵后的花蜜酒酒精度為8.5%Vol，其對(duì)糖的利用率低，酒精度含量最低，酵母活性相對(duì)其他兩種蜂蜜較差，感官評(píng)分最低。安琪葡萄酒高活性干酵母和M05 蜂蜜酒酵母，殘?zhí)橇糠謩e為16 °Brix 與15 °Brix；酒精度分別為 13.0%Vol 與 13.5%Vol，差異較小。經(jīng)過(guò)感官評(píng)定為安琪葡萄酒高活性干酵母優(yōu)于M05蜂蜜酒酵母，感官評(píng)分高，安琪葡萄酒高活性干酵母釀造的花蜜酒，酒體更加清透，而M05 蜂蜜酒酵母次之。M05 釀造的花蜜酒雖然酒體協(xié)調(diào)，但顏色較混濁，不利于后處理。根據(jù)酒精度、殘?zhí)橇亢透泄僭u(píng)定結(jié)果，安琪葡萄酒高活性干酵母更適合釀造花蜜酒。

表4 不同種酵母對(duì)花蜜酒品質(zhì)影響Table 4 Effects of different kinds of yeast on the quality of nectar wine

2.1.3 酵母添加量對(duì)花蜜酒品質(zhì)影響 酵母的添加量決定了發(fā)酵啟動(dòng)情況，對(duì)發(fā)酵時(shí)間有重要的影響，在工業(yè)生產(chǎn)中有重要意義。由表5 可知，隨著酵母添加量增大，殘?zhí)橇恐饾u減少。當(dāng)添加量為0.2 g/L 時(shí)，殘?zhí)橇孔罡邽?18 °Brix；當(dāng)添加量0.8～1.0 g/L 時(shí)，殘?zhí)橇孔畹蜑?4 °Brix。當(dāng)酵母添加量為1.0 g/L 時(shí)，花蜜酒酒精度可達(dá)到14%Vol，發(fā)酵速度快，但酒體寡淡，感官評(píng)分低。添加量較少時(shí)，在相同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，發(fā)酵速度較低，殘?zhí)橇枯^高，口感甜膩。當(dāng)酵母量過(guò)高時(shí)，發(fā)酵基質(zhì)中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)同樣會(huì)被其他微生物利用，導(dǎo)致發(fā)酵環(huán)境變惡劣，從而使酒體口感較差。此外，酵母菌會(huì)產(chǎn)生氨基酸, 導(dǎo)致生物胺增加，所以過(guò)高時(shí)會(huì)增加食用風(fēng)險(xiǎn)[17]。因此，根據(jù)殘?zhí)橇俊⒕凭群透泄僭u(píng)定確定酵母添加量為0.4 g/L 時(shí)，花蜜酒酒度適中，酒體協(xié)調(diào)，品質(zhì)最好。

表5 酵母添加量對(duì)花蜜酒品質(zhì)影響Table 5 Effects of yeast addition on the quality of nectar wine

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)花蜜酒品質(zhì)影響 發(fā)酵溫度對(duì)花蜜酒的香氣有重要的影響, 工業(yè)化生產(chǎn)中經(jīng)常選擇溫度18～25 ℃時(shí)發(fā)酵。且花蜜酒中組胺和酪胺的含量會(huì)隨發(fā)酵溫度升高而增加，而過(guò)量的組胺和酪胺會(huì)使人體中毒，引起頭疼、呼吸紊亂、心悸、嘔吐等反應(yīng)。這是因?yàn)榘l(fā)酵溫度升高,酵母及一些其他的微生物在發(fā)酵酒中的生長(zhǎng)代謝速度也會(huì)加快，從而使組胺和酪胺含量增加，因此控制食品中組胺和酪胺的形成是酒類(lèi)食品的重要安全問(wèn)題[17]。由表6 可知，在9～21 ℃ 范圍內(nèi)，發(fā)酵溫度越高，發(fā)酵速度快，但風(fēng)味單薄，口感較差。發(fā)酵溫度為15 ℃，殘?zhí)呛繛?5 °Brix，酒精度12%Vol，酒體風(fēng)味、顏色和口感最佳,感官評(píng)分最高。發(fā)酵溫度對(duì)花蜜酒品質(zhì)影響的感官評(píng)價(jià)結(jié)果依次是：15 ℃>18 ℃>12 ℃>21 ℃>9 ℃。綜合考慮以上因素，以15 ℃為花蜜酒的發(fā)酵溫度，發(fā)酵的花蜜酒口感最佳。

表6 發(fā)酵溫度對(duì)花蜜酒品質(zhì)影響Table 6 Effects of fermentation temperature on the quality of nectar wine

2.1.5 花蜜酒發(fā)酵工藝條件的正交試驗(yàn)分析 根據(jù)不同初始糖度含量（A）、酵母的種類(lèi)（B）、酵母添加量（C）和發(fā)酵溫度（D）對(duì)花蜜酒感官影響，選用L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)。由表7 可知，影響發(fā)酵工藝條件的主要因素是發(fā)酵溫度，因素主要次序?yàn)镈>A>B>C，即發(fā)酵溫度>初始糖度>酵母的種類(lèi)>酵母添加量；同時(shí)得到最佳組合為A3B1C1D2，最佳發(fā)酵參數(shù)為:初始糖度（A）為22 °Brix，酵母的種類(lèi)（B）為安琪葡萄酒高活性干酵母、接種酵母量（C）為0.4 g/L，發(fā)酵溫度（D）15 ℃，發(fā)酵的花蜜酒蜜香清晰，酒體協(xié)調(diào)，回味豐富。由表8 可知，初始糖度（A）、酵母的種類(lèi)（B）、接種酵母量（C）和發(fā)酵溫度（D）四個(gè)因素對(duì)感官評(píng)價(jià)的影響達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。

表7 花蜜酒發(fā)酵工藝條件的正交試驗(yàn)因素水平表Table 7 Factors and levels table of orthogonal experiment of fermentation conditions of nectar wine

表8 花蜜酒發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 8 Variance analysis of orthogonal experiments results for nectar wine fermentation condition optimization

2.2 優(yōu)化條件下的花蜜酒成分分析

2.2.1 花蜜酒中葡萄糖、果糖、蔗糖及有機(jī)酸成分及含量 果酒中適量的酸可以使果酒有酸爽感，平衡酒精度和甜度，甚至還可以影響各類(lèi)物質(zhì)的化學(xué)平衡。在陳釀期間，酸類(lèi)物質(zhì)和醇類(lèi)物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)，使發(fā)酵酒具有酯香味。有研究表明酸類(lèi)物質(zhì)具有抗氧化性，可以減緩果酒氧化速度，延長(zhǎng)保質(zhì)期[25]。有機(jī)酸是蜂蜜酸味物質(zhì)的主要來(lái)源，這些酸味物質(zhì)是形成蜂蜜酒獨(dú)特口感必不可少的物質(zhì)之一[26]。本研究通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)了花蜜酒中4 種有機(jī)酸:蘋(píng)果酸、琥珀酸、草酸和檸檬酸。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表9，蘋(píng)果酸含量為0.700 g/L, 草酸含量為0.049 g/L，琥珀酸和檸檬酸含量均為0 g/L，通過(guò)對(duì)4 種蜂蜜酒中有機(jī)酸的風(fēng)味強(qiáng)度分析得出:蘋(píng)果酸是影響百花酒口感的主要有機(jī)酸。有研究表明，蜂蜜中檸檬酸含量的檢出，是鑒定蜂蜜是否摻假的重要參考依據(jù)[23]。本試驗(yàn)釀造的花蜜酒并未有檸檬酸檢出，進(jìn)一步說(shuō)明了該研究的花蜜酒通過(guò)自然發(fā)酵產(chǎn)酸，無(wú)需其他調(diào)配，可達(dá)到酸度適中、酒體協(xié)調(diào)的口感。

表9 優(yōu)化條件下的花蜜酒指標(biāo)Table 9 Physical and chemical indexes of nectar wine under optimized conditions

無(wú)論是單花蜜還是百花蜜，蜂蜜的主要成分均是糖類(lèi)物質(zhì)，花蜜酒發(fā)酵后葡萄糖含量為20.000 g/L，果糖含量為76.600 g/L，蔗糖含量為0 g/L，可以得出果糖是影響花蜜酒糖度的主要物質(zhì)。優(yōu)化工藝條件下花蜜酒的糖酸比適中，酒體豐富，各理化指標(biāo)也較理想。

2.2.2 花蜜酒揮發(fā)性化合物成分及含量 花蜜酒不同于果酒、葡萄酒和黃酒，具有獨(dú)特的蜜香。因此，通過(guò)測(cè)定花蜜酒的揮發(fā)性成分來(lái)解釋花蜜酒獨(dú)特的香氣。試驗(yàn)應(yīng)用 GC-MS 檢測(cè)出了16 種揮發(fā)性成分。較高的酒精含量對(duì)葡萄酒品質(zhì)起著重要作用，適當(dāng)?shù)暮亢捅壤瑯涌梢蕴岣呋劬频目诟衃27]。這些揮發(fā)性化合物大部分是在酵母發(fā)酵過(guò)程中由氨基酸產(chǎn)生的[28]。由表10 可知，試驗(yàn)從蜂蜜酒中檢測(cè)到5 種醇，分別是乙醇、異丁醇、異戊醇、2-甲基丁醇、苯乙醇，其中乙醇和苯乙醇的濃度最高，分別為50.13%和38.41%。這五種醇類(lèi)物質(zhì)都是花蜜酒風(fēng)味的主要來(lái)源[29]。如苯乙醇是由酵母利用糖或由苯丙氨酸代謝產(chǎn)生的高級(jí)醇，可以賦予花蜜酒豐富的風(fēng)味[30]。有研究表明[31]，普通蜂蜜酒中含3-甲基-1-丁醇、苯乙醇，沒(méi)有乙醇和異戊醇檢出，而異戊醇能為酒提供蘋(píng)果、香蕉芳香味和澀的口感。由此對(duì)比可知，花蜜酒不僅能提供普通蜂蜜酒所含的丁醇、苯乙醇，還能提供具有特殊芳香成分的異戊醇和乙醇。

表10 優(yōu)化條件下的花蜜酒中揮發(fā)性成分Table 10 Contents of volatile component of nectar wine under optimized conditions

酯類(lèi)主要來(lái)源于發(fā)酵過(guò)程中乙醇酯化和陳釀，絕大多數(shù)酯類(lèi)使酒具有花果香，是酒中一類(lèi)重要的香氣物質(zhì)。酯類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)較多，對(duì)特征香氣至關(guān)重要[32]。由表10 可知，優(yōu)化條件下的蜂蜜酒中酯類(lèi)成分主要包括乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、十四酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯和棕櫚酸乙酯。與已報(bào)到的研究結(jié)果不同，花蜜酒中檢測(cè)出乙酸乙酯，相對(duì)含量為0.5%，對(duì)花蜜酒的花香和果香特性起到了積極的促進(jìn)作用[32]。花蜜酒中乙酸苯乙酯的濃度最高，為1.61%，賦予花蜜酒果味，但普通蜂蜜酒中并未檢出。癸酸乙酯具有蜂蜜和椰子的香氣味，花蜜酒和普通蜂蜜酒均含有癸酸乙酯，這說(shuō)明發(fā)酵保留了癸酸乙酯，使釀造的花蜜酒依然保留蜂蜜的特殊香味。值得注意的是花蜜酒中還檢測(cè)出月桂酸乙酯、十四酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯和棕櫚酸乙酯，會(huì)呈現(xiàn)出柔和的青香、果香和花香，而普通蜂蜜酒中并未檢出[32]，說(shuō)明百花蜜發(fā)酵過(guò)程中，產(chǎn)生了更多的風(fēng)味物質(zhì)，豐富了花蜜酒的口感和風(fēng)味。

醛類(lèi)也是蜂蜜重要的一種香氣物質(zhì)，也能為花蜜酒香氣做出貢獻(xiàn)[17]。由表10 可知，2,5-二甲基甲醛含量為 0.43%，但普通蜂蜜酒中并未檢出醛類(lèi)物質(zhì)[31]?；劬瞥艘陨系南銡馕镔|(zhì)外，還含有一定苯酚，烷烯烴類(lèi)及其他物質(zhì)，含量較少，對(duì)香氣貢獻(xiàn)不大。因此，采用百花蜜釀蜂蜜酒會(huì)增加酒的花果香，可以顯著提高酒的品質(zhì)。

2.2.3 花蜜酒氨基酸成分及含量 花蜜富含游離氨基酸。氨基酸是一些重要的揮發(fā)性化合物的前體，如高級(jí)醇、酯、醛和酮，它們構(gòu)成了酒重要的香氣特征[33]。此外，氨基酸還是花蜜酒重要的呈味物質(zhì)，具有甜味，鮮味，酸味，苦味，澀味，氨基酸轉(zhuǎn)化的醛和醇類(lèi)物質(zhì)能與酒中的醇類(lèi)、酯類(lèi)、有機(jī)酸、醛酮類(lèi)等物質(zhì)協(xié)同作用，增強(qiáng)酒體的層次感?；劬浦泻?6 種氨基酸, 它們分別是Phe（苯丙氨酸）、Ala（丙氨酸）、Met（蛋氨酸）、Pro（脯氨酸）、Gly（甘氨酸）、Glu（谷氨酸）、Arg（精氨酸）、Lys（賴(lài)氨酸）、Tyr（酪氨酸）、Leu（亮氨酸）、Ser（絲氨酸）、Thr（蘇氨酸）、Asn（天冬氨酸）、Val（纈氨酸）、Ile（異亮氨酸）和His（組氨酸）。

大量研究表明，酵母發(fā)酵過(guò)程中特定氨基酸轉(zhuǎn)化為酒中與風(fēng)味相關(guān)的關(guān)鍵醇類(lèi)和酯類(lèi)的途徑。例如，亮氨酸和纈氨酸轉(zhuǎn)化為異戊醇和異丁醇；苯丙氨酸促進(jìn)了苯乙基醇締合酯生成乙酸苯乙酯；蘇氨酸是乙醇的前體[34?35]。從表11 可知，優(yōu)化條件下發(fā)酵的花蜜酒中含有16 種氨基酸, 主要Ile、Asn、Phe 和Glu 氨基酸含量較高，有助于提高其醇類(lèi)和酯類(lèi)含量，從而改善花蜜酒的風(fēng)味。研究發(fā)現(xiàn)，市面蜂蜜酒與本研究的花蜜酒的組氨酸（His）含量均不高，可能是由于在發(fā)酵過(guò)程中，被酵母利用所導(dǎo)致?；劬铺於彼幔ˋsn）含量為5.60 mg/100 L，市面蜂蜜酒天冬氨酸（Asn）含量?jī)H為0.36 mg/100 L，天冬氨酸是蛋白質(zhì)構(gòu)造單位，是生物體內(nèi)賴(lài)氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸等氨基酸及嘌呤、嘧啶堿基的合成前體。此外，花蜜酒中檢測(cè)出2.60 mg/100 L 精氨酸（Arg），而市面上的蜂蜜酒未檢出，精氨酸在人體發(fā)育不成熟或應(yīng)激條件下，可以作為必需氨基酸為人體提供生長(zhǎng)和發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充。精氨酸不僅能促進(jìn)人體傷口愈合，還與人體免疫息息相關(guān)。由此對(duì)比分析可知，富含豐富天冬氨酸和組氨酸的花蜜酒相比市面蜂蜜酒能更好給人體以外源性的補(bǔ)充，可以起到促進(jìn)人體蛋白質(zhì)合成、傷口愈合、人體發(fā)育等功效。

表11 優(yōu)化條件下的花蜜酒中氨基酸含量Table 11 Contents of amino acid of nectar wine under optimized conditions

3 結(jié)論

花蜜酒具有特殊的蜜香，酒體清淡且富有層次，營(yíng)養(yǎng)較好，具有很好的開(kāi)發(fā)潛力。本文通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，得到花蜜酒的最佳發(fā)酵工藝是:以百花蜜為發(fā)酵蜜源，初始糖度22 °Brix，安琪葡萄酒高活性干酵母0.4 g/L，在15 ℃發(fā)酵14 d。最佳工藝條件下發(fā)酵的花蜜酒糖酸比適中，蜜香清晰，酒體協(xié)調(diào)，回味豐富。此外，本實(shí)驗(yàn)還研究了最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下花蜜酒的揮發(fā)性化合物含量和氨基酸含量。結(jié)果表明，優(yōu)化后的花蜜酒16 種氨基酸，Ile、Asn、Phe 和Glu 氨基酸含量較高，氨基酸是酵母發(fā)酵過(guò)程中醇類(lèi)物質(zhì)的前體物質(zhì)，醇類(lèi)物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行酯化和陳釀生成酯類(lèi)，Phe 可以促進(jìn)了苯乙基醇締合酯生成乙酸苯乙酯；Asn 是His 和Ile 合成前體，His 又是乙醇的前體；Leu 和Val 能轉(zhuǎn)化為異戊醇和異丁醇[31?32]，賦予花蜜酒豐富的風(fēng)味。產(chǎn)生的醇類(lèi)物質(zhì)還可以與花蜜酒中的有機(jī)酸發(fā)生酯化反應(yīng)，使發(fā)酵酒具有酯香味。本研究為釀造花蜜酒的工藝提供了參考。

近年來(lái)，我國(guó)果酒釀造工藝尤其是葡萄酒釀造的研究越來(lái)越多，主要集中在菌種的篩選和香氣成分分析等，而關(guān)于花蜜酒的相關(guān)研究較少。未來(lái)，應(yīng)在花蜜酒專(zhuān)用酵母的篩選、花蜜酒體特殊香氣的解析以及香氣保存等方面進(jìn)行深入研究，以期促進(jìn)花蜜酒的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。