乳品中耐藥微生物污染及blaTEM基因溯源

周 浩，欒林眾，劉繼超，趙軍英，尹春媚，陳歷俊*

（1 北京三元食品股份有限公司 北京 100163 2 大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院 遼寧大連 116034 3 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京 100083）

乳業(yè)是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)的重要組成部分，是健康中國、強壯民族不可或缺的產(chǎn)業(yè)。隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展和人們消費水平的提升，我國乳制品市場整體進入消費升級階段，消費者對乳制品的要求也從“安全”向“優(yōu)質(zhì)健康”方向轉(zhuǎn)變。牧場作為乳品生產(chǎn)鏈的第1 站，是保證乳品品質(zhì)的重要環(huán)節(jié)。而奶牛養(yǎng)殖過程中抗生素的過量使用，使得乳品中微生物耐藥性不斷加劇，進而影響產(chǎn)品質(zhì)量和消費者的身體健康。有研究表明[1-4]，由于畜牧養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的過量使用，其隨食物鏈傳播過程中很可能對生物腸道菌群豐度及耐藥性、結(jié)腸癌發(fā)生率和抗體對流感疫苗反應(yīng)等造成影響。如何控制乳品中微生物耐藥性的加劇和傳播逐漸成為社會關(guān)注的熱點問題。

乳制品生產(chǎn)加工過程中，極易受到外界環(huán)境中微生物污染[5]。由于微生物網(wǎng)絡(luò)中質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因轉(zhuǎn)移[6]，使得環(huán)境中耐藥基因可通過食物鏈進入人體[7]，因此牧場中生鮮乳主要污染源追溯及改善是乳制品中耐藥微生物及耐藥基因污染防控的重要途徑。目前針對牧場污染分布及耐藥基因溯源的研究較少，前期研究[8]發(fā)現(xiàn)牧場擠乳過程是生鮮乳中微生物污染的主要來源之一，是否為耐藥基因來源未見報道。本研究通過探究生鮮乳生產(chǎn)過程中耐藥基因主要污染源，對牧場的污染防治及生物安保提出合理化建議，為畜牧養(yǎng)殖業(yè)中抗生素合理使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

3 個不同規(guī)模牧場（J 牧場泌乳牛存欄約1 000頭，L 牧場泌乳牛存欄約800 頭，S 牧場泌乳牛存欄約200 頭）奶廳中檢測位點見表1。

表1 各位點清洗后檢測次數(shù)Table 1 Number of inspection after cleaning of each site

2019年6月取自生產(chǎn)方式區(qū)別較大的兩個牧場（L 牧場自動化擠奶和機械擠奶，S 牧場機械擠奶）的生鮮乳樣品；S 牧場對應(yīng)環(huán)境樣品。

S 牧場乳樣來源：奶廳冷罐、運輸車、工廠預(yù)處理奶罐、發(fā)酵罐和成品奶罐。L 牧場乳樣來源：奶廳冷罐、運輸車、工廠預(yù)處理奶罐和成品。S 牧場環(huán)境樣：冷罐出奶口涂抹樣、奶車出奶口涂抹樣、計量槽涂抹樣、集乳器涂抹樣、乳房涂抹樣、糞便樣本、飲用水、飼料和頭三把奶。

1.2 試劑

ATP 熒光檢測儀試劑棒，美國3M 公司；營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、Baird-Parker 瓊脂、結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、亞碲酸鉀卵黃增菌液，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；MH 培養(yǎng)基和麥?zhǔn)媳葷峁?，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；藥敏紙片，溫州市康泰生物科技有限公司；溶菌酶、ddH2O 和離心柱型細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；PCR Buffer、Dye、dNTP、Taq酶，北京賽百盛基因技術(shù)有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

QC-133 型三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）生物熒光檢測儀，美國3M 公司；S1000 型PCR 擴增儀，美國BIO-RAD 公司。

1.4 微生物污染檢測

采用三磷酸腺苷生物熒光檢測儀對主要設(shè)備及管路清洗后潔凈情況進行檢測。同一關(guān)鍵位點每次清洗后涂抹檢測1 次。在條件允許情況下每個位點至少連續(xù)5 次。檢測結(jié)果波動性較大的點，適當(dāng)增加檢測次數(shù)，記錄檢測數(shù)據(jù)。由于實際條件的限制，檢測結(jié)果存在較大波動，因此僅以其大致波動范圍作為污染風(fēng)險判斷依據(jù)。柱狀圖采用Origin 2018 繪制。

1.5 微生物分離純化及藥敏檢測

采用營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、Baird-Parker 瓊脂和結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基分離純化樣品中的微生物。選取兩個生產(chǎn)方式及規(guī)模差距較大的牧場（L 牧場采用自動化擠奶和機械擠奶，泌乳牛存欄約800 頭；S 牧場采用機械擠奶，泌乳牛存欄約200 頭），參考美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）相關(guān)文件中推薦的分類，對牧場生鮮乳樣品及對應(yīng)加工環(huán)節(jié)乳樣中主要致病菌——葡萄球菌屬及腸桿菌科分離株進行藥敏試驗。藥敏檢測采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄅ渲?.5 麥?zhǔn)蠞舛染海瑢⒕和坎寂囵B(yǎng)于MH 培養(yǎng)基上并采用紙片（Kirby-Bauer，K-B）法檢測微生物耐藥性，每組3 個平行。質(zhì)控菌采用ATCC25922 大腸埃希菌和ATCC25923 金黃色葡萄球菌。

1.6 16S rDNA 和blaTEM 基因PCR 分析

檢測對藥敏試驗中耐藥性較強的β-內(nèi)酰胺類抗生素blaTEM耐藥基因和16S rDNA，將所有分離株16S rDNA 序列在國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫上比對完成菌種鑒定。DNA 提取按照離心柱型細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說明書進行。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）采用50 μL 體系，包括10×PCR Buffer 5 μL、Dye 5 μL、dNTP 1 μL、Taq 酶0.5 μL、引物2 μL、ddH2O 32.5 μL 以及模板DNA 2 μL，引物序列及擴增反應(yīng)條件見表2。引物合成及測序委托北京諾賽基因組研究中心公司完成。

表2 目的基因引物及擴增反應(yīng)條件Table 2 Target gene primers and amplification reaction conditions

1.7 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

選取微生物耐藥較嚴(yán)重的S 牧場中集乳器、計量槽和奶車出奶口3 個ATP 檢測污染風(fēng)險較高的位點，頭三把奶、糞便、乳房涂抹樣和飲用水4 個依據(jù)實地調(diào)研可能存在污染風(fēng)險的位點，以及S 牧場生鮮乳和對應(yīng)加工環(huán)節(jié)乳制品樣品，以其分離株中耐藥性較強β-內(nèi)酰胺類抗生素blaTEM耐藥基因構(gòu)建發(fā)育樹。發(fā)育樹構(gòu)建采用MEGA7 軟件，將整理好的fasta 格式序列文件采用clustalw 進行多序列比對。以GenBank 中相關(guān)基因作參照，采用最近鄰居（Neighbor-Joining，NJ）法，1000 bootstrap 建樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 牧場中微生物污染分布

ATP 檢測值主要包含樣品中微生物和其它有機物兩部分，ATP 值較高的點除了微生物污染外，有機物部分還形成適合微生物生長的表面環(huán)境，使其更易于微生物繁殖[10-11]。如圖1所示，集乳器、計量槽、奶泵出口以及奶車出口等與外界環(huán)境接觸多的環(huán)節(jié)都可能存在較高的污染風(fēng)險，尤其是集乳器3 個牧場均顯示具有高污染風(fēng)險。有研究也表明，管路接頭是整個生產(chǎn)環(huán)節(jié)污染最嚴(yán)重的部分[12]，擠乳設(shè)備上形成的生物膜還是罐裝牛奶中李斯特菌潛在污染源[13-14]。據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[15]，餐具中ATP 測量值不高于600 RLU 可判定為合格。綜上改善相關(guān)生產(chǎn)環(huán)節(jié)中污染現(xiàn)狀，是提高乳品品質(zhì)的重要途徑。

圖1 奶廳中各位點ATP 值分布Fig.1 Distribution of ATP values at each site in the milk hall

2.2 生鮮乳中微生物耐藥性

對牧場生鮮乳樣品及對應(yīng)加工環(huán)節(jié)乳樣主要致病菌——葡萄球菌屬和腸桿菌科分離株進行藥敏試驗，結(jié)果表明，11 株葡萄球菌屬分離株對18種抗生素中林可霉素耐藥率最高為54.5%，其次為土霉素和四環(huán)素（27.3%）、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑（18.2%）、氨芐西林（18.2%）、四環(huán)素（18.2%）、青霉素（18.2%）和鏈霉素（9.1%），其余均無抗性菌株檢出（表3）。舒洋等[16]對內(nèi)蒙古地區(qū)牛源性金黃色葡萄球菌的研究表明青霉素耐藥率最高達(dá)94.74%；Caroline 等[17]對巴西米納斯吉拉斯州乳房炎源金黃色葡萄球菌的研究也表明青霉素耐藥率最高達(dá)83.3%。本試驗中11 株葡萄球菌屬分離株中青霉素耐藥率僅18.2%，遠(yuǎn)低于其它報道。這也可能與不同牧場管理方式有關(guān)。11 株分離株中來自L 牧場9 株分離株對青霉素耐藥率為0%，而來自S 牧場的兩株分離株對青霉素全部耐藥。13 株腸桿菌科分離株對16 種抗生素中氨芐西林耐藥率最高為61.5%，其次為甲氧芐啶/磺胺甲惡唑（15.4%）、慶大霉素（15.4%）、頭孢吡肟（7.7%）、妥布霉素（7.7%）、卡那霉素（7.7%）、土霉素（7.7%）、四環(huán)素（7.7%）、頭孢曲松（7.7%）和鏈霉素（7.7%），其余均無抗性菌株檢出（表4）。其對氨芐西林耐藥率相對較高的結(jié)論與現(xiàn)有研究結(jié)果相似[18-20]。24 株樣本分離株中來自不同牧場菌株的耐藥情況也有較大差異，葡萄球菌屬中分離自S牧場乳樣中的兩株菌對甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、氨芐西林、四環(huán)素和青霉素全部耐藥，而L 牧場分離株對土霉素、林可霉素、四環(huán)素和鏈霉素有較強抗性。在腸桿菌科分離株中L 牧場分離株僅對氨芐西林存在抗性，而S 牧場分離株對頭孢吡肟、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、妥布霉素、卡那霉素、土霉素、四環(huán)素、慶大霉素、頭孢曲松、鏈霉素及氨芐西林均有耐藥菌株檢出。此外，共有4 株分離株對4 種及以上抗生素耐藥，且全部來自于S 牧場。在對牧場的走訪調(diào)研中了解到，本研究中耐藥性較強的土霉素、林可霉素和氨芐西林都是牧場常用藥，說明牧場耐藥微生物分布很可能與用藥習(xí)慣相關(guān)。Li 等[21]對腸桿科細(xì)菌的研究也表明類似的觀點，抗生素使用密度與大腸桿菌和肺炎克雷伯菌耐藥呈正相關(guān)。

表3 葡萄球菌屬分離株抑菌結(jié)果Table 3 Antibacterial results of Staphylococcus isolates

表4 腸桿菌科分離株抑菌結(jié)果Table 4 Antibacterial results of Enterobacteriaceae isolates

2.3 blaTEM 耐藥基因分布及溯源

有研究表明，牧場乳樣中β-內(nèi)酰胺類耐藥基因檢出率較高[22-23]。blaTEM耐藥基因?qū)儆诘湫偷腁 類超廣譜β-內(nèi)酰胺類耐藥基因，至2014年發(fā)現(xiàn)216 種亞型[24-25]。本試驗中，對分離自S 和L 牧場環(huán)境及生鮮乳中的58 株菌以及分離自S 和L 牧場對應(yīng)加工環(huán)節(jié)乳樣中的6 株菌blaTEM耐藥基因分離鑒定，共有61 株菌呈陽性，blaTEM耐藥基因檢出率為95.3%。其中，取自S 牧場環(huán)境中的34株分離株中32 株呈blaTEM基因陽性，檢出率為94.1%。分離自S 及L 牧場生鮮乳中24 株分離株中23 株呈blaTEM基因陽性，檢出率為95.8%。環(huán)境及乳品中檢出率較為接近。

選取部分環(huán)境及乳樣中blaTEM基因序列構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖2所示，1 株S 牧場生鮮乳分離株blaTEM基因與環(huán)境中糞便、集乳器、奶車出奶口、乳房涂抹樣和計量槽中blaTEM基因間存在較近親緣關(guān)系，而多數(shù)S 牧場生鮮乳及1 株乳制品分離株中blaTEM基因，與飲用水中blaTEM基因存在較近親緣關(guān)系。這一結(jié)果表明，集乳器、奶車出奶口、乳房外表面、計量槽、糞便和飲用水都可能是生鮮乳及乳制品中耐藥微生物及耐藥基因潛在污染源。Wang 等[26]對肉雞生產(chǎn)鏈耐藥基因傳播研究表明了類似觀點，其認(rèn)為耐藥基因可從上游雞場沿雞肉生產(chǎn)鏈條一直傳播到超市；而牧場清洗過程大量清洗用水，可能是耐藥基因的主要污染源。有研究[27-28]表明，城市處理水中可能殘留較高水平的耐藥基因，同一牧場各位點間還可能存在交叉污染現(xiàn)象。由于耐藥基在生物死后短時間內(nèi)保持活性，即便是高溫滅菌（UHT）乳，仍可能隨食物鏈傳播，對消費者身體健康及環(huán)境產(chǎn)生影響[29-31]。要提高乳品質(zhì)量安全，加強牧場中污染防控是當(dāng)務(wù)之急。

圖2 牧場中blaTEM 基因分子系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Molecular phylogenetic tree of blaTEM gene in pasture

3 結(jié)論

牧場擠奶環(huán)節(jié)中集乳器、計量槽、奶泵出口、奶車出口微生物及其它有機物污染程度高。不同牧場微生物耐藥性差異較大，總體對β-內(nèi)酰胺類抗生素有高抗性，兩牧場中葡萄球菌屬的林可霉素耐藥率和腸桿菌科的氨芐西林耐藥率較高。其中，S 牧場環(huán)境及乳品中β-內(nèi)酰胺類blaTEM耐藥基因總檢出率達(dá)95.3%，且環(huán)境中檢出率94.1%和乳品中檢出率95.8%較為接近。環(huán)境中集乳器、奶車出奶口、乳房外表面、計量槽、糞便和飲用水可能是生鮮乳及乳制品中blaTEM耐藥基因潛在污染源，同一牧場不同位點間或存在交叉污染現(xiàn)象。為確?？股氐暮侠硎褂?，加強擠奶環(huán)節(jié)以及飲用水等消耗品中的污染防控，是提高乳品品質(zhì)的主要措施。