不同溫度條件下生鮮乳中嗜冷菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性研究

曹慧慧，閆艷華，王磊，龐學(xué)良，董李學(xué)，湯學(xué)英，3，林田，3

（1.唐山市食品藥品綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河北省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)技術(shù)創(chuàng)新中心，河北唐山 063000；2.唐山市功能性農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，河北 唐山 063000；3.唐山市功能性農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，河北 唐山 063000）

0 引言

生鮮乳質(zhì)量是保障乳制品品質(zhì)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]，新鮮生乳通常被認(rèn)為是無(wú)菌的[2-3]。冷藏貯運(yùn)過(guò)程中嗜溫菌大幅減少，但嗜冷菌仍能保持生長(zhǎng)繁殖活力，進(jìn)而造成原料乳中微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[4]。原料乳中的嗜冷菌菌群與牧場(chǎng)衛(wèi)生環(huán)境包括基礎(chǔ)設(shè)施、擠奶設(shè)備、擠奶方式等密切相關(guān)[5-6]，另外，收奶過(guò)程中，運(yùn)奶罐中的溫度波動(dòng)也會(huì)影響原料乳中嗜冷菌的多樣性[7]。研究表明，貯存溫度與時(shí)間是影響生鮮乳中嗜冷菌多樣性的重要因素[8]。嗜冷菌是影響乳品品質(zhì)的重要因素之一，其產(chǎn)生的胞外蛋白酶和脂肪酶具有一定的耐熱性，即使高溫滅菌后仍能保持部分活性，對(duì)長(zhǎng)期保存的乳及乳制品持續(xù)破壞，造成巨大損失[9-13]。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 樣品采集與處理

樣品采集于河北省唐山地區(qū)的規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場(chǎng)，新鮮采集的生鮮乳樣品分為10 個(gè)部分進(jìn)行不同處理，每個(gè)處理3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)：直接凍存-80 ℃的生鮮乳（M.1，M.2，M.3）；10 ℃儲(chǔ)存1d 的生鮮乳（F1.1，F(xiàn)1.2，F(xiàn)1.3）、10 ℃儲(chǔ) 存2 d 的生鮮乳（F2.1，F(xiàn)2.2，F(xiàn)2.3）、10 ℃儲(chǔ)存3 d 的生鮮乳，（F3.1，F(xiàn)3.2，F(xiàn)3.3）；4 ℃儲(chǔ)存1 d的生鮮乳（T1.1，T1.2，T1.3）、4 ℃儲(chǔ)存2 d的生鮮乳（T2.1，T2.2，T2.3）、4 ℃儲(chǔ)存3 d 的生鮮乳（T3.1，T3.2，T3.3）；15 ℃儲(chǔ)存1 d 的生鮮乳（Y1.1，Y1.2，Y1.3）、15 ℃儲(chǔ)存2 d 的生鮮乳（Y2.1，Y2.2，Y2.3）、15 ℃儲(chǔ)存3 d 的生鮮乳（Y3.1，Y3.2，Y3.3）；處理后的生鮮乳樣品取15 mL 于樣品采集管中，每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共計(jì)30個(gè)樣品，液氮中保存送測(cè)序。

1.2 樣本DNA 提取和PCR 擴(kuò)增

使用細(xì)菌DNA 抽提試劑盒（E.Z.N.A.Stool DNA Kit，Omega），按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)菌總DNA 抽提，DNA 模板保存于-20 ℃冰箱備用。取質(zhì)量合格的基因組DNA 樣品30 ng及對(duì)應(yīng)的融合引物配置PCR反應(yīng)體系，設(shè)置PCR反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3 文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

使用Agencourt AMPure XP 磁珠對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并溶于洗脫緩沖液（Elution Buffer）中，貼上標(biāo)簽完成建庫(kù)。使用Agilent 2100 Bioanalyzer 對(duì)文庫(kù)的片段范圍及濃度進(jìn)行檢測(cè)。設(shè)計(jì)合成引物，見(jiàn)表1。以檢測(cè)合格的樣本DNA 為模板，擴(kuò)增16S rDNA 基因的V3～V4 區(qū)，磁珠篩選目的Amplicon 片段，最后用合格的文庫(kù)進(jìn)行Cluster 制備和Paired-end 測(cè)序。用下機(jī)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行相應(yīng)的生物信息學(xué)分析[14]。

表1 16S rDNA基因的V3～V4區(qū)域擴(kuò)增引物

1.4 序列拼接及數(shù)據(jù)處理

Illumina 平臺(tái)下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)濾，濾除低質(zhì)量的序列，剩余高質(zhì)量的有效序列，有效序列可用于后續(xù)分析[15]；使用FLASH（v1.2.11）軟件將雙末端測(cè)序得到的成對(duì)序列，利用Overlap 重疊關(guān)系組裝成一條序列，得到高變區(qū)的標(biāo)簽序列（Tags），拼接條件為最小匹配長(zhǎng)度15 bp 和重疊區(qū)域允許錯(cuò)配率為10%，去除沒(méi)有重疊關(guān)系的序列[16]；利用USEARCH（v9.1）在97%的相似度下對(duì)拼接好的有效序列進(jìn)行聚類，然后通過(guò)RDP classifer（v2.2）軟件將OTU 代表序列與Green?gene 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)OTU 進(jìn)行物種注釋[17-19]；基于OTU 和物種注釋結(jié)果進(jìn)行樣品物種復(fù)雜度分析以及組間物種差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及OTU組成分析，序列的拼接與組裝

測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2 所示。由表2 經(jīng)計(jì)算可知，通過(guò)對(duì)生鮮乳10 個(gè)不同處理組的共30 個(gè)樣本進(jìn)行16s測(cè)序，總計(jì)測(cè)得原始序列條數(shù)為1 761 661條，獲得有效序列1 330 548 條，一共產(chǎn)生1 259 個(gè)OTUs。其中M 樣品中的OTUs 最多，達(dá)到了2 735 個(gè)OTUs，Y 樣品中的OTUs最少，僅為155個(gè)OTUs。

表2 樣品間測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

不同處理?xiàng)l件下的菌群群落結(jié)構(gòu)OUTs 如圖1 所示。由圖可以看出，30 個(gè)樣本中共同含有的OTUs 為32 個(gè)，其中M 獨(dú)有410 個(gè)OTUs，T1 獨(dú)有9 個(gè)OTUs，Y3 獨(dú)有1 個(gè)OTUs，經(jīng)過(guò)4 ℃儲(chǔ)存1 d 的生鮮乳中僅有9 個(gè)獨(dú)有OTUs，15 ℃中儲(chǔ)存3 d 的生鮮乳中僅有1 個(gè)特有的OTUs，而其他處理?xiàng)l件下的生鮮乳樣品中沒(méi)有自己特有的OTUs。以上結(jié)果表明新鮮采集的生鮮乳中細(xì)菌種群多樣性最高，低溫處理技術(shù)控制了一部分微生物的繁殖速度使大部分的細(xì)菌失去了活性，僅有少部分嗜冷菌存活下來(lái)并逐漸成為菌群中的優(yōu)勢(shì)菌。這一研究結(jié)果也提示我們冷藏運(yùn)輸過(guò)程是保證生鮮乳質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

圖1 生鮮乳不同處理?xiàng)l件下的OTU Core-Pan圖

2.2 不同處理組樣品間Alpha多樣性分析

生鮮乳10 個(gè)不同處理組的α-多樣性指標(biāo)如表3所示。由表3 可以看出，不同處理?xiàng)l件下細(xì)菌群落α-多樣性統(tǒng)計(jì)中的Sobs 指數(shù)、Chao 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)差異顯著（P<0.05）；Shannon 指數(shù)顯示，稀釋曲線平緩并達(dá)到平臺(tái)期，反映了測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有物種，更大的測(cè)序量也不會(huì)引起物種多樣性的增加，說(shuō)明樣本量足夠，且現(xiàn)有數(shù)據(jù)量分析結(jié)果可靠，見(jiàn)圖2。表3 中Sobs 指數(shù)和Chao指數(shù)反映樣品中群落的豐富度即群落中物種的數(shù)量，而不考慮群落中每個(gè)物種的豐度情況；Shannon 和Simpson 指數(shù)反映群落的多樣性（Species diversity），受樣品群落中物種豐富度（species richness）和物種均勻度（species evenness）的影響。相同物種豐富度的情況下，群落中各物種具有越大的均勻度，則認(rèn)為群落具有越大的多樣性。綜合分析表3 可知：新鮮采集后直接凍存-80 ℃的生鮮乳（M）的Shannon 指數(shù)明顯高于其他處理組，說(shuō)明新鮮采集的生鮮乳中所含的細(xì)菌種類最多，微生物復(fù)雜程度高于其他處理組，同時(shí)，Chao指數(shù)也顯示了M 處理組中的細(xì)菌種群的總體豐富度較高；15 ℃中靜置3 d 的生鮮乳（Y3）中的Shannon 指數(shù)明顯低于其它處理組而Simpson 指數(shù)明顯高于其他處理組，說(shuō)明Y3 處理組的生鮮乳中群落優(yōu)勢(shì)度物種小，物種奇異度高。以上結(jié)果表明，低溫處理是減低微生物豐富度的重要步驟，是保證生鮮乳質(zhì)量和延長(zhǎng)貨架期的重要手段；與4 ℃和10 ℃相比，15 ℃低溫條件是大部分嗜冷菌的最適生長(zhǎng)溫度，并隨著存貯時(shí)間的延長(zhǎng)，嗜冷菌種群結(jié)構(gòu)的多樣性逐漸增加。

圖2 生鮮乳不同處理?xiàng)l件下細(xì)菌群落測(cè)序的稀釋曲線

表3 不同處理?xiàng)l件下樣品間Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)

2.3 屬水平各處理組細(xì)菌群落分布情況

利用NGS 法通過(guò)與Greengene 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，基于OTU 的物種分類分析，在相似性為97%水平上，10 個(gè)不同處理組的30 個(gè)樣本中的細(xì)菌種群共注釋到20 個(gè)門、41 個(gè)綱、76 個(gè)目、162 個(gè)科、319 個(gè)屬和364 個(gè)種的物種。由圖3 分析可知，變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）和酸桿菌門（Acidobacteria）是不同處理?xiàng)l件下的優(yōu)勢(shì)菌門，其中變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門是10 個(gè)不同處理?xiàng)l件下生鮮乳中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門。變形菌門在不同處理組中的占比分別為M（31.67%）、T1（81.85%）、T2（91.99%）、T3（91.07%）、F1（66.39%）、F2（51.45%）、F3（47.33%）、Y1（44.29%）、Y2（26.68%）、Y3（21.18%），結(jié)果顯示變形菌門在4 ℃條件下占比最高；厚壁菌門在不同處理組中的占比分別為M（32.57%）、T1（11.23%）、T2（6.57%）、T3（8.39%）、F1（33.00%）、F2（48.36%）、F3（52.46%）、Y1（55.04%）、Y2（72.81%）、3（78.34%），厚壁菌門在15 ℃條件下占比最高，并且隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)數(shù)量逐漸升高；擬桿菌門在不同處理組中的占比分別為M（24.52%）、T1（5.41%）、T2（1.18%）、T3（0.52%）、F1（0.55%）、F2（0.17%）、F3（0.14%）、Y1（0.55%）、Y2（0.42%）、Y3（0.38%），數(shù)據(jù)顯示擬桿菌門在M 處理組中占比最高，并隨著儲(chǔ)存溫度的降低占比逐漸減少；這與前人的研究結(jié)果具有一致性，Yamazi 在研究貯存時(shí)間對(duì)羊奶原料乳質(zhì)量的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，貯存48 h 或更長(zhǎng)時(shí)間后，原料乳中嗜溫好氧菌、大腸桿菌群以及嗜冷菌的數(shù)量較貯存24 h 或更短顯著增加，原料乳的保藏階段，嗜冷菌的菌群結(jié)構(gòu)也發(fā)生了變化[20]。Ratts 收集了來(lái)自多個(gè)牧場(chǎng)的原料乳樣品，菌群結(jié)構(gòu)分析表明，儲(chǔ)存了24 h的樣品中主要嗜冷菌為厚壁菌門，儲(chǔ)存48 h后主要嗜冷菌為變形菌門[21]。

圖3 門分類水平不同處理?xiàng)l件下細(xì)菌群落的相對(duì)豐度

各處理組屬水平細(xì)菌種群分布見(jiàn)圖4，在不同處理組M，T1，T2，T3，F(xiàn)1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，Y1，Y2，Y3 中乳球菌屬（Lactococcus）是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，分別占不同處理組總細(xì)菌群落的M（6.23%），T1（8.17%）、T2（6.26%）、T3（8.33%）、F1（32.74%）、F2（48.15%）、F3（52.23%）、Y1（54.79%）、Y2（72.45%）、Y3（76.84%）；其次為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）分別占不同處理組總細(xì)菌群落的M（18.67%）、T1（68.62%）、T2（82.21%）、T3（73.81%）、F1（48.37%）、F2（27.18%）、F3（21.63%）、Y1（18.67%）、Y2（10.27%）、Y3（7.82%）；排名第三的優(yōu)勢(shì)菌屬為檸檬酸桿菌屬（Citrobacter），分別占不同處理組總細(xì)菌群落的M（1.73%）、T1（2.29%）、T2（1.37%）、T3（1.20%）、F1（14.97%）、F2（19.94%）、F3（20.42%）、Y1（23.19%）、Y2（13.49%）、Y3（10.56%）；以上結(jié)果顯示：乳球菌屬和檸檬酸桿菌屬是生鮮乳10 ℃（F）儲(chǔ)存條件和15 ℃儲(chǔ)存條件（Y）下的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬；不動(dòng)桿菌屬與假單胞菌屬是4 ℃（T）中的優(yōu)勢(shì)菌屬，并且結(jié)果顯示不動(dòng)桿菌屬在4 ℃存放2 d時(shí)含量最高，假單胞菌屬在4 ℃存放3 d 時(shí)含量最高；不動(dòng)桿菌屬和金黃桿菌屬是未經(jīng)低溫處理生鮮乳中的優(yōu)勢(shì)菌屬[22]；以上研究結(jié)果表明不僅貯存溫度會(huì)影響生鮮乳中嗜冷菌的多樣性，貯存時(shí)間也是決定嗜冷菌多樣性的重要因素；原料乳在4 ℃條件下貯存時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致假單胞桿菌和芽孢桿菌數(shù)量的增加[23]。

圖4 屬分類水平不同處理?xiàng)l件下細(xì)菌群落的相對(duì)豐度

乳球菌屬在乳制品的生產(chǎn)中占有較重要的地位，它們的單一或混合培養(yǎng)物可產(chǎn)生不同類型的乳酪和發(fā)酵奶，培養(yǎng)黃油和生產(chǎn)酪蛋白。乳酸乳球菌的一些菌株可產(chǎn)生細(xì)菌素，如Nisin，lactococcin 和bacteriocin等。Nisin 這種乳球菌肽的抗菌物質(zhì)作為一種無(wú)毒的天然食品防腐劑，已被50 多個(gè)國(guó)家和地區(qū)廣泛應(yīng)用與乳制品、罐頭食品、魚類制品和乙醇飲料等的防腐和保鮮。

2.4 不同處理組的細(xì)菌種群聚類分析

Heatmap 是以顏色梯度來(lái)代表數(shù)據(jù)矩陣中數(shù)值的大小，并根據(jù)物種或樣品豐度相似性進(jìn)行聚類。聚類結(jié)果加上樣品的處理或取樣環(huán)境分組信息，可以直觀觀察到相同處理或相似環(huán)境樣品的聚類情況，并直接反映了樣品的群落組成的相似性和差異性。圖5 在屬分類等級(jí)對(duì)生鮮乳10 個(gè)不同處理的30 個(gè)樣本中的物種進(jìn)行heatmap聚類分析。從圖5可以看出，不同處理中細(xì)菌種群屬分類組成存在差異，10 個(gè)處理中占比最大的TOP10 的細(xì)菌菌屬為：乳球菌屬（Lactococcus），不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter），檸檬酸桿菌屬（Citrobacter），沙雷氏菌屬（Serratia），假單胞菌屬（Pseudomonas），金黃桿菌屬（Chryseobacterium），葡糖醋桿菌屬（Gluconacetobacter），埃希氏桿菌屬（Escherichia），腸球菌屬（Enterococcus），球菌屬（Macrococcus）。不同溫度儲(chǔ)存條件下的生鮮乳菌群結(jié)構(gòu)差異顯著，相同溫度儲(chǔ)存條件下不同儲(chǔ)存時(shí)間的生鮮乳的菌群結(jié)構(gòu)顯著不同。10～15 ℃儲(chǔ)存的生鮮乳中嗜冷菌的增長(zhǎng)較0～4 ℃儲(chǔ)存的生鮮乳中增長(zhǎng)顯著。隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，在10～15 ℃儲(chǔ)存條件下乳球菌屬所占比例逐漸提高，檸檬酸桿菌屬在10 ℃儲(chǔ)存條件下隨儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)所占比例逐漸提高，而在15 ℃儲(chǔ)存條件下，隨儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)所占比例逐漸降低；而金黃桿菌屬在4 ℃儲(chǔ)存條件下隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)比例逐漸降低。

圖5 屬分類水平不同處理組細(xì)菌豐度

主成分分析（PCA）運(yùn)用降維的思想，通過(guò)分析不同樣品OTUs（97%相似性）組成反映樣品的差異和距離，將多維數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上，坐標(biāo)軸取對(duì)方差異貢獻(xiàn)最大的前兩個(gè)特征值。如果兩個(gè)樣品距離越近，則表示這兩個(gè)樣品的組成越相似，不同處理或不同環(huán)境間的樣品可能表現(xiàn)出分散聚集的分布情況，從而可以判斷相同條件的樣品組成是否具有相似性。主成分分析結(jié)果見(jiàn)圖6，圖中每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本，相同顏色相同形狀的點(diǎn)來(lái)自于同一個(gè)處理?xiàng)l件，兩點(diǎn)之間距離越近表明兩者的群落結(jié)構(gòu)組成差異性越小。反之，兩點(diǎn)之間的距離越遠(yuǎn)表明兩個(gè)處理之間的群落結(jié)構(gòu)組成差異性越大。PCA 分析結(jié)果進(jìn)一步顯示不同溫度處理?xiàng)l件下生鮮乳中的細(xì)菌種群很明顯的聚集在左側(cè)，10 ℃與15 ℃處理?xiàng)l件下細(xì)菌種群相似性較大，而新鮮采集的生鮮乳與4 ℃處理?xiàng)l件下生鮮乳中的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)相似性較大。

圖6 不同處理?xiàng)l件下生鮮乳中細(xì)菌種群屬分類水平主成分分析

3 結(jié)論

（1）不同低溫（4、10、15 ℃）儲(chǔ)存條件下生鮮乳和直接凍存于-80 ℃的生鮮乳中優(yōu)勢(shì)菌屬為葡糖醋桿菌、沙雷氏菌屬、金黃桿菌屬、假單胞菌屬、檸檬酸桿菌屬、乳球菌屬、不動(dòng)桿菌屬。優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、藍(lán)藻菌門、軟壁菌門、和酸桿菌門。

（2）15 ℃與10 ℃儲(chǔ)存條件下生鮮乳中的菌群種群結(jié)構(gòu)相似性較大，與直接凍存于-80 ℃及儲(chǔ)藏在4 ℃的生鮮乳樣品相比，儲(chǔ)存在10～15 ℃樣品的菌群結(jié)構(gòu)在儲(chǔ)藏過(guò)程中變化較大，同時(shí)，在10～15 ℃儲(chǔ)存的生鮮乳中嗜冷菌的增長(zhǎng)較直接凍存于-80 ℃和4 ℃儲(chǔ)存的顯著。

（3）不同低溫處理?xiàng)l件下生鮮乳中細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)顯著不同，相同溫度條件下不同儲(chǔ)存時(shí)間的生鮮乳中菌群結(jié)構(gòu)差異顯著，而且多樣性指數(shù)也各不相同，說(shuō)明儲(chǔ)存溫度和儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)生鮮乳中微生物菌群結(jié)構(gòu)具有重要影響。

（4）嗜冷菌污染是影響現(xiàn)代乳品工業(yè)中常見(jiàn)的問(wèn)題，生鮮乳冷藏儲(chǔ)運(yùn)中應(yīng)盡量縮短時(shí)間，長(zhǎng)時(shí)間的低溫儲(chǔ)藏或溫度波動(dòng)會(huì)使嗜冷菌菌群結(jié)構(gòu)急劇增加，其產(chǎn)生耐熱的酶類影響乳品質(zhì)和乳風(fēng)味，降低乳產(chǎn)品貨架期。