血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平與急性缺血性腦卒中患者腦側支循環(huán)分級的相關性

段毅，王坤，王軍英，楊歡歡，趙平平

腦側支循環(huán)的形成，特別是三級腦側支循環(huán)，是一個血管新生的過程，對急性缺血性腦卒中患者病情有一定影響。近年來，微小RNA(microRNA，miRNA)在各種生理、病理過程中的作用受到廣泛關注[1-2]。其中不穩(wěn)定的頸動脈斑塊中微小RNA-330-5p(miR-330-5p)過表達，可通過靶向踝蛋白-1參與有癥狀的頸動脈狹窄的發(fā)生[3]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a-5p表達上調(diào)與急性缺血性腦卒中的發(fā)生有關[4]；血管性癡呆(vascular dementia，VD)患者血清miR-34a與血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)水平存在關系，而VEGF是血管再生過程中的關鍵活性因子[5]。因此，本研究通過檢測急性缺血性腦卒中患者血清miR-330-5p、miR-34a-5p及VEGF水平，分析其與腦側支循環(huán)分級的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年7月—2021年1月石家莊市第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院治療且建立腦側支循環(huán)的急性缺血性腦卒中患者104例為研究組，根據(jù)數(shù)字減影血管造影(DSA)檢測腦側支循環(huán)的開放層次分組，一級側支循環(huán)亞組36例(一級亞組，主要由Willis環(huán)血管構成)，二級側支循環(huán)亞組51例(二級亞組，眼動脈、軟腦膜及其他相對較小的側支、側支吻合支)，三級側支循環(huán)亞組17例(三級亞組，通過血管生成等產(chǎn)生的新生供血血管)。各亞組間性別、年齡、高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙史、心房顫動史、抗血小板治療及他汀治療比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。同期納入與急性缺血性腦卒中患者性別、年齡相匹配的健康體檢者40例為健康對照組，男24例，女16例，年齡41～72(57.82±8.64)歲。研究組與健康對照組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(審批號：2019051002)，全部研究對象或家屬均知情同意并簽署知情同意書。

表1 急性缺血性腦卒中患者不同亞組間臨床資料比較 [例

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①均符合“中國急性缺血性腦卒中診治指南2018”[6]中的相關診斷流程及標準，且經(jīng)顱腦CT、MR或DSA證實；②納入對象從發(fā)病至行DSA時間≤7 d；③臨床資料完整。(2)排除標準：①合并嚴重肝、腎功能不全者；②合并腫瘤、血液系統(tǒng)疾病或免疫功能障礙者；③合并冠心病、心力衰竭、心律失常等患者；④同時存在病灶對側大腦中動脈或頸內(nèi)動脈嚴重狹窄或閉塞者；⑤存在CT、MR或DSA禁忌證者；⑥精神狀態(tài)、意識功能障礙，無法完成本研究者。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血清miR-330-5p、miR-34a-5p水平檢測：研究組患者于入院24 h內(nèi)、健康體檢者于體檢當日禁食8～12 h后，采集空腹肘靜脈血5 ml，離心取上層清液于干凈EP管，置于-70℃條件下保存檢測。采用熒光定量PCR技術檢測血清miR-330-5p、miR-34a-5p水平。首先利用Trizol試劑盒(無錫百泰克生物技術有限公司)提取血清總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(廣州東盛生物科技有限公司)得到cDNA，以cDNA為模板進行miR-330-5p、miR-34a-5p擴增。反應條件：95℃變性15 min，94℃ 15 s，退火及延伸60℃ 34 s，共40個循環(huán)。miR-330-5p、miR-34a-5p均以U6為內(nèi)參。引物由無錫百泰克生物技術有限公司合成，引物序列見表2。用2-△△Ct法計算血清miR-330-5p、miR-34a-5p相對表達量。

表2 miR-330-5p、miR-34a-5p及U6引物序列

1.3.2 血清VEGF水平檢測：上述血清，利用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清VEGF水平，人VEGF試劑盒購自武漢益普生物科技有限公司，嚴格按照試劑盒說明書步驟操作。

2 結 果

2.1 2組血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平比較 研究組血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平均顯著高于健康對照組(P<0.01)，見表3。

表3 健康對照組與研究組血清miR-330-5p、miR-34a-5p及VEGF水平比較

2.2 急性缺血性腦卒中患者亞組間血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平比較 一級亞組、二級亞組、三級亞組血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平依次升高，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)，見表4。

表4 急性缺血性腦卒中患者不同亞組間血清miR-330-5p、miR-34a-5p及VEGF水平比較

2.3 血清miR-330-5p、miR-34a-5p與VEGF水平的相關性 Pearson分析結果顯示，急性缺血性腦卒中患者血清miR-330-5p、miR-34a-5p與VEGF水平均呈正相關(r=0.674、0.624，P均=0.000)。

2.4 血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平對急性缺血性腦卒中患者三級腦側支循環(huán)建立的預測價值 以急性缺血性腦卒中一級、二級腦側支循環(huán)患者血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平為對照，評估血清指標對三級腦側支循環(huán)患者的預測價值，ROC結果顯示，血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平及三者聯(lián)合預測急性缺血性腦卒中患者三級腦側支循環(huán)建立的曲線下面積(AUC)分別為0.874、0.903、0.870、0.951，三者聯(lián)合優(yōu)于單獨預測(Z=3.080、2.049、3.240，P=0.002、0.041、0.001)，見圖1、表5。

圖1 血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平對急性缺血性腦卒中患者三級腦側支循環(huán)建立的ROC曲線

表5 血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平對急性缺血性腦卒中患者三級腦側支循環(huán)建立的預測價值

3 討 論

急性缺血性腦卒中是人類第二大常見死亡原因，其發(fā)病率隨年齡的增長而逐漸增加，是導致長期身體殘疾的重要原因，給患者帶來極大的經(jīng)濟和精神負擔[7-9]。大腦血管網(wǎng)絡的存在或缺失越來越被認為是腦卒中的重要預后原因，而傳統(tǒng)上的研究多集中于血管再通的各個方面，很少關注腦側支循環(huán)的作用[10-12]。腦側支循環(huán)是指當腦部供血動脈嚴重狹窄或閉塞時，血液可通過側支或新形成的血管吻合到達缺血區(qū)，使缺血區(qū)域得到不同程度的灌注代償[13-15]。既往研究發(fā)現(xiàn)[16-17]，多種基因和蛋白參與急性缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展，其對腦側支循環(huán)的作用目前知之甚少。

miRNA主要在轉(zhuǎn)錄后通過miRNA的互補序列識別并靶向mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)參與調(diào)控基因表達[18-19]。腦內(nèi)主要側支通路是Willis環(huán)的后、前交通(側支)動脈，前、中、后大腦動脈樹冠間的pial小動脈吻合及小腦后動脈與小腦上動脈、小腦遠端動脈之間的穹窿吻合，有助于減輕缺血癥狀，保護神經(jīng)元功能[20]。有報道稱，miR-330-5p在神經(jīng)系統(tǒng)中靶向細胞分裂周期蛋白42(CDC42)表達，參與阿爾茨海默病發(fā)病過程中神經(jīng)元對抗突觸缺失的代償作用[21]。腦側支循環(huán)的形成，尤其是三級腦側支循環(huán)，實際上是血管新生的結果。已有研究證實，血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)可促進冠狀動脈側支循環(huán)的形成，減輕冠狀動脈慢性全閉塞患者遠端血管的缺血和心絞痛癥狀，保留患者心室功能[22-23]。本結果顯示，急性缺血性腦卒中患者血清miR-330-5p、VEGF水平較健康體檢者高，隨著患者腦側支循環(huán)分級增加，血清miR-330-5p、VEGF水平逐漸升高，且二者表達呈正相關，提示血清miR-330-5p水平可能參與急性缺血性腦卒中患者腦側支循環(huán)的形成過程，可能與血管內(nèi)皮細胞增殖分化有關，具體作用機制尚不清楚。

內(nèi)皮細胞衰老被認為是血腦屏障完整性受損的主要原因，衰老機制包括內(nèi)皮細胞功能障礙、動脈硬化和內(nèi)皮細胞微囊釋放[24]。miRNA在細胞衰老、血管內(nèi)皮損傷中的作用越來越受到關注[25-26]。國內(nèi)學者報道稱，VD患者血清miR-34a表達升高，VEGF水平降低，二者水平呈負相關，可能導致VD患者病情加重[5]，與本研究結果不同。本研究結果顯示，急性缺血性腦卒中患者血清miR-34a-5p水平較健康對照組高，隨著患者腦側支循環(huán)分級增加，血清miR-34a-5p水平呈逐漸上升趨勢，且與VEGF水平呈正相關，與王御林等[5]研究相似，表明miR-34a-5p可能通過協(xié)同VEGF，參與急性缺血性腦卒中腦側支循環(huán)形成過程。推測可能的原因是VEGF是一種多向性血管生長因子，可促進急性缺血性腦卒中新生血管生成[27]，腦側支循環(huán)的形成即新毛細血管的形成，刺激血管內(nèi)皮細胞分泌大量VEGF參與內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)，加上患者血腦屏障功能受損，VEGF進入血液可被檢測到。而VD患者由于病情較為嚴重，血管修復功能降低，VEGF分泌減少，可作為反映腦血管疾病嚴重程度的一種生物指標。同時發(fā)現(xiàn)血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平均對急性缺血性腦卒中患者三級腦側支循環(huán)的建立有一定的診斷價值，且三者聯(lián)合診斷效能更高，可能作為預測急性缺血性腦卒中患者腦側支循環(huán)分級的潛在生物標志物。

綜上所述，血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平隨急性缺血性腦卒中患者腦側支循環(huán)分級增加而呈上升趨勢，miR-330-5p、miR-34a-5p均與VEGF水平呈正相關，推測血清miR-330-5p、miR-34a-5p可能參與腦血管內(nèi)皮細胞增殖分化，有利于血管新生，具體作用機制尚待更深入研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

段毅：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；王坤：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核；王軍英：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；楊歡歡：進行統(tǒng)計學分析；趙平平：課題設計，論文撰寫