UPLC-MS/MS法測(cè)定炮制前后款冬花中款冬堿的含量

昝 珂 李耀磊 王丹丹 金紅宇 馬雙成 劉麗娜* 王 瑩*

1.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488

款冬花為菊科植物款冬(TussilagofarfaraL.)的干燥花蕾，別名冬花，主要分布于甘肅、陜西、山西及河南等地區(qū)[1]?，F(xiàn)代臨床多用于新久咳嗽，喘咳痰多，勞嗽咳血的治療，療效顯著。臨床多用蜜炙品(蜜款冬花)，中醫(yī)認(rèn)為，蜂蜜炮制款冬花能夠增強(qiáng)止咳化痰、潤(rùn)肺下氣的功效[2]?？疃ㄖ泻羞量├镂鬣ど飰A類成分，款冬堿是從款冬花中分離得到的一種吡咯里西啶生物堿類成分[3]。1,2-不飽和的吡咯里西啶生物堿具有肝毒性，但款冬堿是飽和的吡咯里西啶生物堿(結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1)，不具有肝毒性[4]。吡咯里西啶生物堿類成分往往具有抗菌、抗膽堿等藥理作用[5]?？疃瑝A至今僅在少數(shù)幾個(gè)植物中有報(bào)道[6]，具有較強(qiáng)的專屬性，含量測(cè)定至今未見(jiàn)報(bào)道。本文建立UPLC-MS/MS法，同時(shí)測(cè)定蜜炙前后的款冬花中款冬堿的含量，對(duì)其炮制前后含量的變化進(jìn)行比較。

圖1 款冬堿的結(jié)構(gòu)式

1 儀器與材料

H-CLASS超高效液相色譜儀(沃特世)；三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)器(沃特世)；R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi公司)；KQ-3200DV型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，Quintix125D-1CN電子分析天平(賽多利斯公司)。Oasis MCX固相萃取小柱(150 mg/6 cc，沃特世公司)。

對(duì)照品款冬堿(批號(hào)：11782)由上海欽誠(chéng)生物科技有限公司提供；純度大于98%；乙腈、甲醇、甲酸和甲酸銨均為質(zhì)譜級(jí)(Fisher)，屈臣氏超純水，其他試劑為分析純。

款冬花采自甘肅省，經(jīng)中檢院昝珂副研究員鑒定為菊科植物款冬TussilagofarfaraL.的干燥花蕾。每批樣品分為2份，一份為生品(編號(hào)分別標(biāo)記為S1～S4)，另一份按照《中國(guó)藥典》通則規(guī)定，照蜜炙法用蜜水炒至不粘手(編號(hào)分別標(biāo)記為Z1～Z4)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜、質(zhì)譜條件 色譜柱：Waters CORTECS UPLC C18(100 mm × 2.1 mm, 1.6 μm)；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：0.05%甲酸水溶液(A)及含0.05%甲酸的乙腈(B)(4∶1)；流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣體積：2 μL。質(zhì)譜離子源為電噴霧離子化源(ESI)；正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；毛細(xì)管電壓3.0 kV；離子源溫度150 ℃；去溶劑溫度500 ℃?？疃瑝A對(duì)照品溶液進(jìn)樣后得到準(zhǔn)分子離子峰m/z200.20[M+H]+(圖2)；準(zhǔn)分子離子峰經(jīng)子離子掃描，得到主要碎片為m/z57.03和m/z83.18(圖3)，選定m/z57.03為定量離子，m/z83.18為定性離子。經(jīng)手動(dòng)優(yōu)化錐孔電壓和碰撞電壓，錐孔電壓為24 V，定量離子碰撞電壓為30 V，定性離子碰撞電壓為36 V。對(duì)照品及樣品的色譜圖如圖4所示。

圖2 款冬堿正離子模式下質(zhì)譜圖

圖3 款冬堿正離子模式下子離子掃描質(zhì)譜圖

圖4 對(duì)照品溶液(A)和供試品溶液(B)MRM色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取款冬堿適量，用10%乙腈水溶解配成濃度分別為1.005 μg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用10%乙腈水配成濃度為20.10 ng·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取款冬花粉末1.0 g，精密稱定，加入 0.05 mol·L-1硫酸溶液40 mL，超聲提取 (300 W， 40 kHz)30 min，過(guò)濾，取濾液20 mL進(jìn)行固相萃取富集純化。具體流程為甲醇5 mL活化SPE-PCX小柱，0.05 mol·L-1硫酸溶液5 mL平衡小柱，將硫酸溶液樣品20 mL上柱，甲醇10 mL淋洗除雜， 8%氨水-甲醇溶液10 mL洗脫，收集洗脫液并濃縮至1 mL左右，用10%乙腈水稀釋定容至100 mL量瓶中，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系和靈敏度考察 分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0 mL，置100 mL量瓶中，加10%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，按照“2.1”項(xiàng)下的條件進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品的峰面積為Y，對(duì)應(yīng)的濃度為X進(jìn)行線性回歸?？疃瑝A的回歸方程為Y= 23621X-1876，相關(guān)系數(shù)r=0.9993，表明款冬堿的線性關(guān)系良好。以定量離子對(duì)的色譜峰信噪比S/N≥3對(duì)應(yīng)的最低濃度為檢測(cè)限(LOD)，以定量離子對(duì)色譜峰信噪比S/N≥10對(duì)應(yīng)的最低濃度為定量限(LOQ)，檢測(cè)限為0.10 ng·mL-1， 定量限為0.30 ng·mL-1。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果款冬堿的峰面積的RSD為2.35%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液(S1)，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果款冬堿的峰面積的RSD (n=6)為2.62%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備樣品(S1)溶液6份，分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果款冬堿的平均含量分別為20.76 μg·g-1，RSD (n=6)為2.87%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收試驗(yàn) 取款冬堿對(duì)照品適量，精密稱定，置量瓶中，加10%乙腈水溶解配制成質(zhì)量濃度分別為10.05 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。取已知含量的供試品粉末(S1)6份，每份各約0.5 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，分別精密加入上述對(duì)照品溶液各1.0 mL，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 款冬堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.4 含量測(cè)定 分別準(zhǔn)確稱取不同產(chǎn)地的款冬花藥材1.0 g，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，依據(jù)外標(biāo)法計(jì)算款冬堿的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 款冬花炮制前后款冬堿的含量測(cè)定結(jié)果 (μg·g-1, n=2)

3 討論

3.1 檢測(cè)方法的選擇 款冬堿為款冬花中特征性的吡咯里西啶生物堿類成分，為痕量成分，采用高靈敏度的UPLC-MS/MS法為首選方法。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定，正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)被測(cè)成分的離子對(duì)，靈敏度高，定量離子峰形好，其他物質(zhì)無(wú)干擾，能夠?qū)Υ郎y(cè)物質(zhì)準(zhǔn)確測(cè)定。

3.2 流動(dòng)相的選擇 本研究考察了不同配比乙腈-水以及含有甲酸、甲酸銨等含酸溶液作為流動(dòng)相對(duì)吡咯里西啶生物堿的分離能力的影響。通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)最終確定流動(dòng)相為含0.05%甲酸的水溶液及含0.05%甲酸的乙腈(4∶1)恒流洗脫，在該系統(tǒng)下能夠?qū)疃瑝A達(dá)到定量測(cè)定的要求。

3.3 定量分析結(jié)果 本文采用建立的UPLC-MS/MS法對(duì)炮制前后款冬花中的款冬堿的含量進(jìn)行的測(cè)定，炮制對(duì)款冬花中款冬堿的含量具有明顯影響，炮制后款冬堿呈明顯的下降趨勢(shì)，下降的成分是否轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)需要進(jìn)一步研究。