維藥神香草的質(zhì)量控制研究

韓 雪 李 莉 刁娟娟

新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011

神香草為唇形科(Labiatae)神香草屬(Hyssopus)硬尖神香HyssopuscuspidatusBoriss.的地上干燥部分,主要分布在新疆阿勒泰等地,是新疆地區(qū)習(xí)用草藥?！毒S吾爾藥志》記載其“性二級(jí)熱，味苦、辛，氣芳香，具有溫肺平喘、祛寒止咳、燥濕祛痰、發(fā)汗解毒、消炎退腫的功效，用于濕寒性和黏液質(zhì)性呼吸病[1]”。研究[2-4]報(bào)道，神香草中富含揮發(fā)油、三萜、黃酮、酚酸、多糖等成分，被廣泛應(yīng)用于維藥、中成藥中。臨床上，神香草多為感冒、咳嗽藥方中的主藥或輔藥，還被制成祛痰劑、發(fā)汗劑等[5]。

1999年《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·維吾爾藥分冊(cè)》[6]收錄神香草，其中包括了藥材的外觀性狀、性味和功能主治等。該藥材藥用價(jià)值較高，但近年來藥材購(gòu)買市場(chǎng)較混亂，因?yàn)槠錁O易與大苞荊芥混淆，所以建立質(zhì)量控制的方法至關(guān)重要。前期已有學(xué)者對(duì)神香草和混淆品大苞荊芥進(jìn)行了初步的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[7],選用三萜類代表成分齊墩果酸與熊果酸作為指標(biāo)成分。

神香草為本課題組所研究的中成藥羅歐咳祖帕的主藥，主要應(yīng)用其抗炎、抗氧化、抗哮喘的功效，前期藥效研究[8-16]表明酚酸類與黃酮類成分是抗炎、抗氧化的主要活性部位。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[17]報(bào)道，酚酸類化合物迷迭香酸具有抗炎、抗菌、抗哮喘的功能，可通過改善內(nèi)源性抗炎機(jī)制，抑制炎癥細(xì)胞的釋放，從而改善哮喘癥狀。黃酮類化合物蒙花苷具有抗菌消炎功能，而大苞荊芥未見文獻(xiàn)報(bào)道黃酮類化合物蒙花苷的存在。因此本課題組選擇酚酸類化合物迷迭香酸和黃酮類化合物蒙花苷為指標(biāo)成分，對(duì)不同產(chǎn)地的神香草藥材進(jìn)行定性定量分析。目前，大多采用高效液相色譜法測(cè)定其含量，鮮有報(bào)道高效薄層掃描法對(duì)神香草中有效成分進(jìn)行定量分析。高效薄層掃描法具有定性定量、操作快速、簡(jiǎn)單、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)[18-19]。本實(shí)驗(yàn)在對(duì)神香草進(jìn)行質(zhì)量控制的同時(shí)，并采用生態(tài)量表(ESA)對(duì)實(shí)驗(yàn)過程中環(huán)境友好程度進(jìn)行對(duì)比分析[20-22]，以期為神香草中迷迭香酸和蒙花苷的質(zhì)量控制和含量測(cè)定提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材與試劑 神香草采購(gòu)自新疆和田地區(qū)，由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院帕麗達(dá)教授鑒定為硬尖神香草。共有五批樣品：S1(20110719), S2(1911044), S3(1909026), S4 (1910039)。生藥學(xué)圖片如圖1所示。迷迭香酸(批號(hào)：111871-201706，中國(guó)食品藥品研究院)；蒙花苷(批號(hào)：20210606，北京索萊寶科技有限公司)；乙腈(色譜純，西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司)；甲醇，磷酸，二氯甲烷，乙酸乙酯，甲酸(分析純)；聚酰胺薄膜(20 cm×10 cm，浙江臺(tái)州路橋四甲基生化塑料廠)。

圖1 神香草地上干燥部分

1.2 儀器 高效液相色譜儀(日本島津，LC-20AT)；TLC掃描儀3、Reprostar 3薄層色譜、Linomat5半自動(dòng)點(diǎn)樣儀均來自CAMAG(瑞士)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ500DE，昆山市超聲儀器有限公司)；電子天平(AL104，梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；分析天平(AB135-S，d=0.01/0.1mg，梅特勒-托利多儀器上海有限公司)

1.3 高效液相色譜法

1.3.1 對(duì)照品溶液配制 精密稱取迷迭香酸10 mg置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到迷迭香酸對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密稱取蒙花苷5 mg置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到蒙花苷對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.3.2 供試品溶液配制 精密稱定神香草粉末0.5 g(過篩)，置于具塞錐形瓶中，加入25 mL80%甲醇，稱定其質(zhì)量，超聲(500 W、40 KHz)提取30 min，放冷后再稱定質(zhì)量用溶劑補(bǔ)足重量，合并濾液，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.3.3 高效液相色譜條件 色譜柱：Sepax HP-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；等度洗脫：乙腈-0.1%磷酸(25∶75)；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。如圖2所示。

1.迷迭香酸； 2.蒙花苷?qǐng)D2 對(duì)照品及樣品330 nm下高效液相色譜圖

a 迷迭香酸 b 蒙花苷?qǐng)D3 混合對(duì)照品及樣品330 nm下薄層掃描圖

a 迷迭香酸 b 蒙花苷 S1-S4樣品圖4 對(duì)照品及樣品366 nm下薄層色譜圖

1.4 高效薄層掃描法

1.4.1 對(duì)照品溶液配制 精密吸取“1.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液經(jīng)稀釋分別得到迷迭香酸和蒙花苷對(duì)照品溶液。

1.4.2 供試品溶液制備 精密稱定神香草粉末1.0 g(過篩)，置于具塞錐形瓶中，加入15 mL甲醇，稱定其質(zhì)量，超聲(500 W、40 KHz)提取30 min，放冷后再稱定質(zhì)量用溶劑補(bǔ)足重量，合并濾液，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.4.3 薄層層析及薄層掃描條件 聚酰胺板(20 cm×10 cm)，條狀點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量為3 μL，試驗(yàn)前置110 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中活化20 min后，在干燥環(huán)境中放冷，以二氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲酸=2∶5∶1為展開劑，雙槽展開缸中飽和15 min，展開，取出，晾干，以2%三氯化鋁溶液顯色，105 ℃加熱5 min，置于366 nm紫外燈下檢視。在200～700 nm全波長(zhǎng)下進(jìn)行直線掃描檢測(cè)，狹縫寬度為6 mm×0.3 mm，掃描速度為20 mm/min。使用了氘燈。測(cè)量供試品吸光度積分值和對(duì)照品吸光度積分值并計(jì)算。如圖3～4所示。

2 方法與結(jié)果

2.1 線性范圍 使用半自動(dòng)點(diǎn)樣儀分別吸取迷迭香酸和蒙花苷對(duì)照品溶液，以點(diǎn)樣量0.5、1、1.5、2、2.5、3 μL分別點(diǎn)于聚酰胺板上，按照“1.4.3”項(xiàng)下的色譜條件展開、掃描。對(duì)照品儲(chǔ)備液經(jīng)倍半稀釋法得到系列溶液。根據(jù)“1.3.3”項(xiàng)下的色譜條件下測(cè)定峰面積，以質(zhì)量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

2.2 精密度試驗(yàn) 將迷迭香酸和蒙花苷對(duì)照品溶液分別點(diǎn)在同一聚酰胺板上(2 μL,n=6)，按照“1.4.3”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)測(cè)定3 d。在3 d內(nèi)，根據(jù)“1.3.3”項(xiàng)下的色譜條件，每天重復(fù)測(cè)定6次標(biāo)準(zhǔn)溶液。用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)計(jì)算了兩種方法的日間和日間精度。見表2。

表2 精密度結(jié)果

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 供試品溶液(1911044)點(diǎn)于在同一聚酰胺板上(3 μL,n= 6)，按照“1.4.3”項(xiàng)下的色譜條件展開。根據(jù)“1.3.3”項(xiàng)下的色譜條件，考察樣品S2在0、2、4、6、8、12、24 h內(nèi)的穩(wěn)定性。兩種方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值計(jì)算。見表3。

表3 穩(wěn)定性結(jié)果

2.4 重復(fù)性 精確稱量同批次(1911044)樣品6份，分別按照“1.3.2”和“1.4.2”項(xiàng)下的方法制備樣品溶液，在“1.4.3”項(xiàng)下的色譜條件下，將樣品溶液點(diǎn)在同一聚酰胺板上。根據(jù)“1.3.3”項(xiàng)下的色譜條件對(duì)供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)。兩種方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于3.00%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5 加樣回收率 首先，分別按照“1.3.2”和“1.4.2”項(xiàng)下的方法平行制備供試溶液，測(cè)定迷迭香酸和蒙花苷的含量。將待測(cè)溶液按比例1∶1加入對(duì)照品溶液，按“1.4.3”項(xiàng)下色譜程序進(jìn)行點(diǎn)樣、顯色、掃描。同樣的供試品溶液按對(duì)照品0.5∶1∶1.5的比例加入，在“1.3.3”項(xiàng)下的色譜條件下用高效液相色譜法檢測(cè)。計(jì)算兩種方法的樣品回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。見表4、5。

表4 HPLC加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

表5 HPTLSC加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

2.6 含量測(cè)定 在相應(yīng)的色譜條件下，分別采用HPTLCS和HPLC法測(cè)定4批神香草中迷迭香酸和蒙花苷的含量，并計(jì)算不同方法測(cè)定的含量。對(duì)比兩種方法測(cè)定神香草中迷迭香酸和蒙花苷的含量。見表6、7。

表6 HPLC與HPTLCS法測(cè)定神香草中2種成分含量結(jié)果比較

2.7 生態(tài)量表(ESA)分析 計(jì)算了兩種方法分析的時(shí)間和試劑消耗?？梢钥闯觯捎肏PTLCS檢測(cè)神香草中迷迭香酸和蒙花苷的含量的時(shí)間和試劑消耗較少。見表7。根據(jù)PPs算法規(guī)則，對(duì)計(jì)算結(jié)果進(jìn)行尺度排序，得分大于75代表綠色分析優(yōu)秀，從75到50代表綠色分析可接受，小于50代表綠色分析不合格。結(jié)果表明，HPTLCS在分析生態(tài)尺度中得分較高。得分越高，說明該方法越環(huán)保、綠色。結(jié)果見表8。因此，可以看出HPTLCS是一種更經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的分析技術(shù)。

表7 HPLC和HPTLCS法的時(shí)間和試劑消耗情況

表8 HPLC和HPTLCS法的PPs分析

3 討論

3.1 指標(biāo)物選擇 通過藥效追蹤確定抗炎的有效部位為酚酸類和黃酮類，結(jié)合相關(guān)研究暫定以酚酸類化合物迷迭香酸和黃酮類化合物蒙花苷為指標(biāo)成分，指標(biāo)成分的選擇與藥效息息相關(guān)，采用不同類指標(biāo)成分和不同檢測(cè)方法對(duì)神香草進(jìn)行更全面的質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制研究。

3.2 薄層板選擇 本研究在薄層鑒別時(shí)最初選用高效硅膠板，考察了多個(gè)展開劑發(fā)現(xiàn)蒙花苷始終無法顯色，由于蒙花苷是黃酮類成分，所以將硅膠板換為聚酰胺薄膜。在紫外366 nm下顯黃色斑點(diǎn)。

3.3 混淆品鑒別 由于市場(chǎng)中藥材較混亂，神香草購(gòu)買過程中多次出現(xiàn)混淆品大苞荊芥，所以本研究在建立神香草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的同時(shí)，以相同的色譜條件和相同的指標(biāo)成分對(duì)混淆品大苞荊芥進(jìn)行鑒別、分析，結(jié)果顯示，與神香草相比，大苞荊芥中迷迭香酸含量較低，無黃酮類化合物蒙花苷，因此可以采用該方法區(qū)分神香草與混淆品大苞荊芥，為保證藥材正確性提供參考價(jià)值。

3.4 不同方法比較 高效液相色譜法與高效薄層掃描法相比，前者靈敏度高、結(jié)果更準(zhǔn)確、穩(wěn)定，但樣品制備較復(fù)雜，費(fèi)用高；后者具有操作簡(jiǎn)單、迅速的特點(diǎn)，雖然靈敏度稍低，但高效薄層掃描法可作為一個(gè)簡(jiǎn)單、快速的質(zhì)量控制方法。通過二者實(shí)驗(yàn)對(duì)比，期望對(duì)建立神香草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供后期實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上，本研究所建立的神香草定性、定量方法具有簡(jiǎn)便、可行、重復(fù)性好的特點(diǎn)，可為快速鑒別神香草提供科學(xué)依據(jù)，為完善、建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。