肝癌相關(guān)成纖維細(xì)胞中生長抑素的表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系研究

鄭倩婧 劉亞飛 闕穎釗 于衛(wèi)華

肝細(xì)胞癌是一種高致死率的惡性腫瘤，是全球癌癥相關(guān)死亡的第四大原因，其發(fā)病率呈穩(wěn)步上升趨勢[1]。肝癌的高侵襲性和轉(zhuǎn)移性阻礙腫瘤的徹底清除，是預(yù)后不良的關(guān)鍵因素[2]。因此，更全面地了解肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制是確定有效治療靶點(diǎn)的關(guān)鍵。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)是腫瘤周圍基質(zhì)的主要成分，通過與腫瘤細(xì)胞相互作用和對基質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)的機(jī)械重塑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲，促進(jìn)腫瘤向惡性腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散[3]。

生長抑素(somatostatin，SST)是一種主要由下丘腦產(chǎn)生的激素，通過人體許多特定的受體在激素調(diào)節(jié)中起著不同的作用，在許多不同的組織和腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有SST受體轉(zhuǎn)錄本的存在[4]。研究報道CAFs參與肝癌的轉(zhuǎn)移與侵襲，但具體作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步明確[5]。SST對腫瘤生長的影響可能是通過抑制生長因子和促生長激素的合成或分泌而產(chǎn)生的間接作用，而CAFs則可分泌多種細(xì)胞因子來促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[6-7]。因此，本研究探討了SST在CAFs中的表達(dá)及其與肝癌患者臨床病理參數(shù)、預(yù)后間的關(guān)系，并對SST和肝癌細(xì)胞間的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，以期為臨床研究提供新靶點(diǎn)。

材料與方法

一、基本資料

收集空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院2015年4月至2016年10月接受肝癌手術(shù)的83例患者的肝癌及癌旁組織(距離癌組織>3 cm)樣本，肝癌組織樣本中男性43例，女性40例，平均年齡(57.54±3.21)歲。收集患者的臨床病歷資料，包括年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織分化程度。所有納入標(biāo)本經(jīng)病理學(xué)診斷均為肝細(xì)胞肝癌，患者術(shù)后采用門診或者電話等形式進(jìn)行定期隨訪，時間為每2個月一次，為期60個月，隨訪時間截至2020年3月，統(tǒng)計肝癌患者術(shù)后無進(jìn)展生存期(PFS)和總體生存時間(OS)，比較術(shù)后生存率。所有患者均具有完整的隨訪資料，且術(shù)前均獲得知情同意。本研究均經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。

二、研究方法

(一)細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌Huh7細(xì)胞購于上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。CAFs和正常成纖維細(xì)胞(NFs)分別從肝癌及癌旁組織樣本中分離：將組織剪成小塊后加入適量含有20 %胎牛血清(Thermo公司)的RPMI 1640培養(yǎng)液(Thermo公司)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿后進(jìn)行傳代換液，換成正常培養(yǎng)液，取第4～7代纖維細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。所有細(xì)胞正常培養(yǎng)均用含有10 %胎牛血清、1 %青霉素鏈霉素(Gibco公司)的RPMI 1640培養(yǎng)液在37 ℃和5% CO2濃度的培養(yǎng)箱(上海精密儀器儀表有限公司)中培養(yǎng)。

(二)qPCR檢測肝癌組織中SST的表達(dá)水平 使用Trizol試劑從細(xì)胞中提取總RNA。然后用primerscript RT試劑盒將等量的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并作為RT-qPCR的模板。使用SYBR Premix二聚體試劑盒(中國大連Takara)測定基因表達(dá)。在25 μL反應(yīng)體積內(nèi)合成cDNA，其中12.5 μL SYBR預(yù)混劑Ex-TaqⅡ，1.0 μL RT引物和1 μL cDNA樣品，10.5 μL雙蒸餾水，qPCR程序在實(shí)時PCR系統(tǒng)上進(jìn)行，條件如下：95 ℃ 1 min，95 ℃ 35個循環(huán)20 s，然后56 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s。使用2-ΔΔCT方法分析靶基因的相對表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參對照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。引物序列見表1。

表1 PCR反應(yīng)引物序列

(三)細(xì)胞轉(zhuǎn)染、增殖與侵襲 細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑。CAFs 以1×105個細(xì)胞接種到24孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到70 %左右時，將2.5 μg的SST過表達(dá)載體(pcDNA-SST，美國Santa公司)與對照物(vector，美國Santa公司)分別于5 μL Lipofectamine RNAiMA共同混合在125 μL的無血清培養(yǎng)液中，然后與細(xì)胞共孵育。

采用CCK-8測定法檢測肝癌細(xì)胞增殖。肝癌相關(guān)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA-SST培養(yǎng)24 h后，取其上清液與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)，在0、24、48、72 h后，向每個孔中加入10 μL CCK-8(上海儒安生物科技)溶液并與細(xì)胞共孵育另外2 h。在37 ℃下，用SpectraMax iD3多功能酶標(biāo)儀(美谷分子儀器有限公司)在450 nm波長處檢測吸收值。

將CAFs 以1×105個細(xì)胞接種到Transwell小室上層，下層接種Huh7細(xì)胞。共孵育24 h后，用棉簽除去未侵入的細(xì)胞，同時將侵入的細(xì)胞用4 %多聚甲醛中固定30 min，并用0.1 %結(jié)晶紫染色15 min。使用光學(xué)顯微鏡隨機(jī)選擇5個區(qū)域定量染色的細(xì)胞。

(四)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) CAFs過表達(dá)SST后24 h，收集上清液與Huh7細(xì)胞共孵育24 h，然后在4 ℃以10 000 r/min離心5 min，通過ELISA試劑盒檢測上清液中趨化因子CCL2、CCL5、CXCL21、CXCL25的含量。

(五)免疫蛋白印跡 用PBS洗滌細(xì)胞兩次后用RIPA裂解緩沖液(碧云天生物科技)裂解，蛋白質(zhì)濃度用BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒(Sigma公司)測定。然后用10 % SDS-PAGE分離等量的總蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5 %脫脂牛奶封閉2 h，然后在4 ℃下與一抗(Wnt1，1∶1 000稀釋，ab15251；β-catenin，1∶1000稀釋，ab32572；Cyclin D1，1∶200稀釋，ab16663；c-Myc，1∶500稀釋，ab32072，英國Abcam公司)孵育過夜。用TBS-T洗滌3次后，在室溫下與辣根過氧化物酶(1∶1000 稀釋, ab20272)共孵育1 h。用ECL成像系統(tǒng)(上海嘉鵬科技有限公司)顯示蛋白質(zhì)條帶，用imagej軟件定量蛋白質(zhì)條帶的光密度。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、α-SMA、Vimentin及SST在 CAFs中的表達(dá)水平

如表2所示，采用qPCR檢測CAFs標(biāo)志物(α-平滑肌肌動蛋白，α-SMA；波形蛋白，Vimentin)及SST的相對表達(dá)水平。結(jié)果顯示相對于NFs、α-SMA和Vimentin在CAFs中的表達(dá)水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。然而，SST在CAFs中的mRNA水平顯著低于NFs組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表2 α-SMA、Vimentin及SST在 NFs和CAFs中的表達(dá)水平

二、 SST的表達(dá)與肝癌患者病理特征的關(guān)系

如表3所示，在83例肝癌患者中，男性43名例，女性40例；年齡在41～67歲之間，平均年齡為(57.54±3.21)歲；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期的有21例，Ⅲ+Ⅳ期的62例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者51例，淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的32例；組織分化程度低的19例，組織分化程度中、高度的共64例。

表3 SST的表達(dá)與肝癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

肝癌患者按照SST表達(dá)分為SST高表達(dá)組(SST≥0.462)和SST低表達(dá)組(SST<0.462)。SST與臨床病理特征的關(guān)系顯示，SST的表達(dá)與患者的年齡、性別和腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)，與TNM分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織分化程度相關(guān)(P<0.05)。TNM分期高(Ⅲ+Ⅳ)、淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移、肝癌組織分化程度中/高的患者，CAFs 中SST的表達(dá)水平越低；而TNM分期低(Ⅰ+Ⅱ)、淋巴結(jié)未發(fā)生轉(zhuǎn)移、組織分化程度低的肝癌患者，CAFs 中SST的表達(dá)水平偏高。

三、 SST對共培養(yǎng)肝癌細(xì)胞增殖的影響

從表4可知，與NFs細(xì)胞相比，培養(yǎng)CAFs的上清液與Huh7細(xì)胞共孵育后可顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而CAFs過表達(dá)SST后再與Huh7細(xì)胞共培養(yǎng)，與Vector組相比，pcDNA-SST組Huh7細(xì)胞的增殖受到抑制，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表4 SST對共培養(yǎng)肝癌細(xì)胞增殖的影響

四、SST對共培養(yǎng)肝癌細(xì)胞侵襲的影響

比較肝癌細(xì)胞侵襲數(shù)發(fā)現(xiàn)，與Vector組(342±14)相比，過表達(dá)SST的CAFs與Huh7細(xì)胞共孵育，可顯著抑制Huh7細(xì)胞的侵襲數(shù)量(98±10)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=24.564，P<0.001)。

五、過表達(dá)SST對趨化因子的影響

為探討SST是如何通過CAFs影響Huh7細(xì)胞的增殖與侵襲，本文采用ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)NFs和CAFs上清液中趨化因子CCL2、CCL5、CXCL21和CXCL25的表達(dá)水平。結(jié)果顯示四種趨化因子CCL2(98.50±3.98)pg/mL、CCL5(78.32±4.21)pg/mL、CXCL21(24.32±5.11)pg/mL和CXCL25(20.34±4.77)pg/mL的表達(dá)水平在CAFs上清液中的表達(dá)水平顯著高于NFs組(3.2±5.36,1.40±4.35,1.02±4.67,1.11±5.01)pg/mL， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。表5顯示，與Vector組相比，趨化因子在轉(zhuǎn)染pcDNA-SST組中的含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表5 過表達(dá)SST對趨化因子的影響

六、SST通過抑制Wnt/β-catenin通路抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移

Wnt/β-catenin通路被報道參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因此我們通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測Wnt/β-catenin通路是否參與SST對肝癌的抑制。表6結(jié)果顯示，與vertor組相比，CAFs轉(zhuǎn)染pcDNA-SST后，可顯著抑制Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白Wnt1、β-catenin、Cyclin D1和c-Myc的表達(dá)(P<0.01)，說明SST通過Wnt/β-catenin通抑制Huh7細(xì)胞的增殖與侵襲。

表6 SST對Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

七、SST的表達(dá)與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier法被用來分析SST的表達(dá)與肝癌患者預(yù)后(PFS、OS)的關(guān)系。高表達(dá)SST的肝癌患者PFS(41.04%)、OS(39.77%)均顯著高于低表達(dá)SST肝癌患者PFS (8.27%)、OS(6.31%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.679，P=0.031；χ2=4.304，P=0.038)。

討 論

腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞相互作用是腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵因素，CAFs是腫瘤微環(huán)境的組成部分之一，其通過分泌各種生長因子和細(xì)胞因子，或與癌細(xì)胞的相互作用為腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了有利的微環(huán)境，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[8]。本文研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)CAFs與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)時，同樣可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖與侵襲，說明CAFs也參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。

SST是一種參與多種生物化學(xué)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的肽，通過激活其同源受體負(fù)調(diào)控細(xì)胞增殖和多種激素的釋放，具有抗分泌、抗增殖和抗血管生成的作用，因此，在人類疾病治療方面特別是腫瘤具有優(yōu)異的效果[9]。天然的SST因?yàn)榕R床應(yīng)用半衰期短的原因而受到抑制，因此現(xiàn)階段的臨床研究多是其類似物，如SST的類似物奧曲肽，臨床治療顯示服用14.3個月后可顯著延緩腫瘤的進(jìn)展，表現(xiàn)出突出的抗增殖作用，且患者預(yù)后也較好[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，SST在CAFs中的表達(dá)水平顯著低于正常成纖維細(xì)胞，通過在CAFs中構(gòu)建SST的過表達(dá)載體，再與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，可顯著抑制肝癌的增殖與侵襲，說明SST通過抑制CAFs與肝癌細(xì)胞的相互作用，抑制肝癌細(xì)胞的增殖與侵襲。

細(xì)胞因子/趨化因子家族在調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展和癌細(xì)胞間質(zhì)相互作用中同樣占據(jù)重要的位置。在口腔鱗狀細(xì)胞癌，CAFs通過增加單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1/CCL2)的表達(dá)促進(jìn)腫瘤的侵襲和遷移[11]。在涎腺腺樣囊性癌中CAFs條件培養(yǎng)基對ACC細(xì)胞遷移和侵襲有顯著促進(jìn)作用，通過干預(yù)基質(zhì)金屬蛋白酶和CXCL12/CXCR4途徑，可以抑制CAFs促進(jìn)的ACC侵襲[12]。Wnt/β-catenin信號通路是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和腫瘤發(fā)生的經(jīng)典信號通路，可通過調(diào)控EMT的進(jìn)展參與腫瘤發(fā)生[13]。Shan等人報道Wnt/β-catenin信號通路是CXCL12過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化所必需的。因此當(dāng)CAFs與肝癌細(xì)胞培養(yǎng)時，趨化因子CCL2、CCL5、CXCL21、CXCL25和Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平顯著增加，而在CAFs中過表達(dá)SST后，四種趨化因子和Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)受到抑制，說明SST是通過增加趨化因子和激活Wnt/β-catenin信號通路參與肝癌的發(fā)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SST在肝癌患者癌旁組織的CAFs中表達(dá)下調(diào)，SST與肝癌患者臨床病理因素及預(yù)后相關(guān)，過表達(dá)SST可抑制肝癌細(xì)胞的增殖與侵襲，其機(jī)制可能與SST抑制CAFs分泌的趨化因子和肝癌細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。