超聲細胞粉碎法快速提取真菌中的麥角甾醇

霍理堅,馮祖睿,林雅鈴

(華南農業(yè)大學材料與能源學院,廣東 廣州 510642)

麥角甾醇,別名麥角固醇,是真菌細胞膜的重要組成成分,因其結構穩(wěn)定,專一性強,可以將其含量作為真菌生物量的指標[1]?？拐婢幫ㄟ^與麥角甾醇生物合成途徑中的各種酶作用,干擾或阻斷麥角甾醇生物合成,破壞真菌細胞膜結構而達到抑菌、殺菌目的[2-3]。麥角甾醇也是一種重要的醫(yī)藥化工原料,可用于生產(chǎn)可的松、激素黃體酮等甾醇類藥物。為提高麥角甾醇的產(chǎn)量,國內外學者廣泛開展了微生物發(fā)酵合成麥角甾醇的研究[4]。因此,無論是在真菌病害防治領域,還是藥物生產(chǎn)領域,找到一種從真菌中快速提取麥角甾醇并準確測定其含量的方法是十分必要的。

目前,麥角甾醇的提取方法有皂化回流法、超聲輔助提取法、微波萃取法或超臨界流體CO2萃取法等[4],其中以皂化回流法最常見。皂化回流法存在提取時間長、溫度高、有機溶劑使用量大、安全系數(shù)小等缺點[5]。超聲波是一種高頻機械振蕩波,其能量會引起萃取溶劑的空化,而空化作用能加速傳熱和傳質速率,從而破壞細胞膜[6]。目前超聲波法的常用設備是超聲清洗機[7-9],其超聲波能量分布不集中,細胞粉碎效率不高,若能提高超聲粉碎效率則有望縮短提取時間,提高工作效率。

水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)引發(fā)的水稻紋枯病是全球范圍內危害最為嚴重的水稻真菌病害之一[10]。金針菇(Flammulinavelutipes)是常見的食藥兩用菌類，其富含維生素、氨基酸、纖維素等成分,具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值,在功能性食品、醫(yī)藥保健品開發(fā)上具有很大潛力[11]。本研究先以水稻紋枯病菌為對象,采用具有較大超聲粉碎功率的超聲細胞粉碎儀,以甲醇為溶劑,探索和改進超聲細胞粉碎法提取麥角甾醇的條件,用HPLC法測定提取后麥角甾醇含量;然后將優(yōu)化的超聲細胞粉碎法用于金針菇麥角甾醇的提取,以期能找到一種可替代傳統(tǒng)皂化回流法且簡單可行的麥角甾醇提取與測定方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)由華南農業(yè)大學植物保護學院植物病理系真菌研究室提供。金針菇(毛柄金線菌,Flammulinavelutipes)購自華南農業(yè)大學農貿市場。

1.2 試劑和儀器

麥角甾醇標準品(純度98.0%)購自成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司;甲醇(色譜純)、氫氧化鉀、維生素C、氯化鈉、無水乙醇、石油醚(60～90 ℃)、無水硫酸鈉均為分析純,購自上海麥克林生化科技有限公司。試劑配制:2 mol·L-1氫氧化鉀-乙醇溶液(KOH-EtOH),取KOH 11.2 g,加入EtOH溶解成100 mL;0.1 mol·L-1維生素C溶液,取維生素C 0.176 g,加無水乙醇100 mL;飽和NaCl溶液,取NaCl 25 g,加水50 mL振搖溶解,靜置后取上清液;麥角甾醇標準溶液,精確稱取麥角甾醇標準品5 mg,加色譜甲醇稀釋定容至50 mL,質量濃度為0.1 mg·mL-1。

儀器:高效液相色譜儀(Waters 600-2998);Hypersil ODS 250×4.6 mm 5 μm色譜柱;JY92-IIDN超聲細胞粉碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司);KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);BSA124S萬分之一電子天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司)。

1.3 麥角甾醇含量的測定方法

參照李治建等[12]方法,采用HPLC法,以甲醇為流動相,流速為1 mL·min-1,檢測波長為260 nm,進樣量10 μL,室溫測定。以0.1 mg·mL-1麥角甾醇標準溶液作對照,外標法計算供試液中麥角甾醇的含量。

1.4 皂化回流法提取R.solani中的麥角甾醇

參照Heleno等[13]方法,稱取約0.2 g菌絲干粉,精密稱量,加入2 mol·L-1KOH-EtOH溶液10 mL,0.1 mg·mL-1維生素C溶液2.5 mL,60 ℃下恒溫皂化45 min。皂化液放冷至室溫,加入5 mL NaCl飽和溶液,以10 mL石油醚萃取3次,收集有機相,加少量無水Na2SO4除水,40 ℃旋蒸至干,以甲醇溶解轉移至10 mL容量瓶定容。

1.5 超聲細胞粉碎法提取R.solani中的麥角甾醇

1.5.1 正交試驗確定最佳提取條件在前期預試驗中,發(fā)現(xiàn)菌絲(g)與溶劑(mL)的比例(簡稱為料液比)、菌絲干粉超聲粉碎前浸泡在溶劑中的時間、超聲粉碎的功率、超聲粉碎的時間等對麥角甾醇的提取率有一定的影響,故初步確定4個變量,即:料液比(A)、超聲粉碎前浸泡時間(B)、超聲功率(C)和超聲時間(D),其變量水平見表1,選用L16(45)正交試驗評價上述4個變量對提取率的影響并獲得最優(yōu)提取條件。

表1 正交優(yōu)化試驗因素與水平表Table 1 Level and factors in the L16(45)orthogonal experiments

超聲細胞粉碎法提取麥角甾醇的試驗步驟:將R.solani菌絲凍干,研細成粉,待用?？紤]到麥角甾醇易溶于甲醇,HPLC法測定也以甲醇作為流動相,故在超聲提取時,采用色譜純甲醇作為溶劑。根據(jù)設定的變量條件,分別精密稱取干燥R.solani菌絲凍干粉,置于15 mL離心管,準確移取設定量的甲醇,浸泡規(guī)定時間,稱量;在設定的功率條件下,冰浴中超聲處理設定的時間,放置室溫后再次稱量,滴加甲醇補足減失的量;搖勻,取溶液適量以0.45 μm尼龍濾膜過濾,得到供試溶液,用HPLC測定麥角甾醇含量。每個試驗條件重復3次,取平均值。

1.5.2 含量測定方法學考察最佳提取條件的加樣回收試驗:取約0.20 gR.solani菌絲干粉9份,精密稱定,分為高、中、低3個濃度組,分別加入含標準品0.75、0.50、0.25 mg的甲醇溶液,按1.5.1節(jié)中確定的最佳提取條件下進行提取,根據(jù)測定結果計算加樣回收率。

重復性試驗:取約0.20 g的R.solani菌絲干粉5份,精密稱定,以上述最佳提取條件平行操作得供試溶液,測定并計算提取率及相對標準偏差(RSD)。

1.6 提取金針菇中麥角甾醇的方法

超聲細胞粉碎法:取約0.20 g金針菇凍干粉3份,精密稱定,置于15 mL離心管,準確移取10 mL甲醇,充分混合后浸泡20 min,稱量;超聲細胞粉碎儀超聲(250 W,冰浴)處理8 min,放置室溫,再次稱量,滴加甲醇補足減失的量,搖勻,以微孔濾膜過濾,測定含量。

超聲輔助提取法:取約0.20 g金針菇凍干粉3份,精密稱定,置于15 mL離心管,準確移取10 mL甲醇,搖勻,稱量,超聲清洗機超聲(250 W,40 ℃水浴)處理40 min,放置室溫,再次稱量,滴加甲醇補足減失的量,搖勻,以微孔濾膜過濾,測定含量[7,14]。

皂化回流提取法:取約0.20 g金針菇凍干粉3份,精密稱定,加入2 mol·L-1KOH-EtOH 10 mL,在85～90 ℃下皂化3 h[7]。冷卻后轉移至分液漏斗,加入10 mL石油醚萃取2次,收集上層石油醚[15],旋轉蒸發(fā)至干,用甲醇溶解轉移至10 mL容量瓶定容。溶液以微孔濾膜過濾,測定含量。

上述提取試驗均重復3次,取平均值,計算其RSD值并進行方差分析。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件進行繪圖和處理分析數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 麥角甾醇HPLC檢測方法的建立

在1.3節(jié)所述的HPLC色譜條件下,得到麥角甾醇標準溶液(0.1 mg·mL-1)和菌絲提取液中麥角甾醇的色譜圖(圖1)。由圖1可以看出:麥角甾醇色譜峰的保留時間約為14.423 min,樣品峰與其他物質峰完全分離,分離度大于1.5。

圖1 菌絲提取液和麥角甾醇標準溶液的HLPC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mycelium extract solution and ergosterol standard solution

麥角甾醇在0.010～0.200 mg·mL-1線性關系良好,標準曲線的回歸方程為:

Y=15 181X+31 335,R2=0.999 9。

在相同條件下,0.1 mg·mL-1標準品溶液連續(xù)進樣3次,麥角甾醇峰面積的相對標準偏差(RSD)為0.59%,說明本色譜條件滿足檢測要求。

2.2 皂化回流法提取R.solani中麥角甾醇

根據(jù)文獻所述的皂化法,按1.4節(jié)所述條件從R.solani菌絲中提取麥角甾醇,并采用1.3節(jié)中所述的方法進行含量測定。3次重復測試結果顯示:菌絲中麥角甾醇含量約為2.18 mg·g-1,RSD為2.28%。

2.3 超聲細胞粉碎法提取R.solani中麥角甾醇的正交試驗結果及其提取條件優(yōu)化

由表2中極差(R)值可知:料液比(A)對麥角甾醇的提取率影響最大,其次為超聲前浸泡時間(B)、超聲時間(D),超聲功率(C)的影響最小。由表3方差分析結果可知:料液比、超聲前浸泡時間對麥角甾醇提取率的影響較顯著,而超聲功率與超聲時間對麥角甾醇的提取率影響不顯著?；诖?確定以超聲細胞粉碎法提取水稻紋枯病菌中麥角甾醇的最佳條件為A3B2C2D2,即:料液比1/50,超聲前浸泡20 min,超聲功率200 W,超聲時間4 min。

表2 正交優(yōu)化試驗結果分析表Table 2 Analysis of the results from orthogonal experiment

表3 方差分析表Table 3 Analysis results of variance

2.4 超聲細胞粉碎法的準確度和精密度

由表4加樣回收試驗結果可知:在超聲細胞粉碎法的最佳提取條件下,麥角甾醇的加樣回收率為92.22%～101.13%,平均回收率為96.53%,RSD為2.68%。由表5重復性試驗結果可見:在最佳提取條件下其麥角甾醇的平均含量為2.59 mg·g-1,RSD為0.88%。試驗結果均符合相關規(guī)定要求,說明此提取方法準確度高,重復性好。

表4 超聲細胞粉碎法加樣回收試驗結果Table 4 Test results of sample recovery rate of ultrasonic cell disruption method

表5 超聲細胞粉碎法重復性試驗結果Table 5 Reproducibility test results of ultrasonic cell disruption method

2.5 3種方法提取金針菇中麥角甾醇的比較結果

由表6可看出:3種提取方法中,以超聲細胞粉碎法提取率最高,需時最少,且重現(xiàn)性良好。方差分析結果顯示,超聲細胞粉碎法提取麥角甾醇的提取率與皂化回流法和超聲輔助法提取麥角甾醇的提取率差異極顯著(P<0.01)。

表6 皂化回流法、超聲輔助法及超聲細胞粉碎法提取金針菇中麥角甾醇的比較及方差分析

3 結論與討論

麥角甾醇存在于真菌的菌絲細胞中,對其進行有效提取的前提是麥角甾醇必須能從細胞中溶出。超聲波的機械效應、空化效應、熱效應等作用有利于細胞的粉碎,促使麥角甾醇從菌絲細胞中溶出并迅速分散在提取液中。故相對于皂化回流法,超聲輔助提取和超聲細胞粉碎提取法的提取量均有所增加。一般認為,超聲前的浸泡有利于甲醇與菌絲的充分接觸,有利于超聲波能量的傳導,提高菌絲細胞的粉碎率,正交試驗結果亦證實了這一點。當超聲的功率達到一定值(250 W)時,已經(jīng)基本實現(xiàn)對菌絲細胞的有效粉碎,故進一步提高超聲功率和超聲時間,對麥角甾醇的提取影響不顯著。本試驗還發(fā)現(xiàn),當料液比為1/20時,供試樣品中可見有未完全粉碎的菌絲,說明減少料液比(即增加溶劑的用量)也有利于菌絲在超聲條件下的充分粉碎,麥角甾醇更易溶出,提取更充分。

利用超聲波提取,以往常用超聲清洗機進行超聲輔助提取,其操作是把菌絲、提取液混合至容器(如錐形瓶)中,浸入清洗槽水浴超聲。超聲波從清洗槽底部的振子發(fā)出,透過水浴(體積相對較大)和容器才到達提取液,在此過程中能量分散弱化,要使細胞粉碎率高需時較長。而超聲細胞粉碎儀的工作原理是超聲波通過浸入在樣品溶液中的鈦合金變幅桿對容器中的細胞、提取液直接產(chǎn)生作用,能量集中,細胞粉碎效率高。試驗結果證實了這一點,超聲細胞粉碎提取進一步縮短了提取時間,且麥角甾醇提取率也有提高。

借助超聲波進行提取比傳統(tǒng)的皂化回流法用時大幅減少,且操作簡單,溶劑使用量少。相比于超聲清洗機,由于超聲細胞粉碎儀可提供能量更為集中的超聲波,因此用超聲細胞粉碎法可得到更高的提取率,且試驗結果顯示該方法的準確度及重復性均達到相關規(guī)定。綜上所述,超聲細胞粉碎法可作為真菌菌絲中麥角甾醇含量快速測試的參考方法。本研究僅選擇了較有代表性的植物致病菌和食用菌各1種作為試驗材料,將來要對多種真菌進行研究,進一步確定超聲細胞粉碎法應用于真菌中提取麥角甾醇的可行性。