基于指紋圖譜和化學(xué)計(jì)量法的白芥子藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

張澤康，喻剛艷，喻祥龍，張 晴，王昌海，趙玥瑛，白 潔*，陸 洋,2*

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；2. 深圳北京中醫(yī)藥大學(xué)研究院，廣東 深圳 518000)

白芥子為十字花科植物白芥Sinapis albaL.的干燥成熟種子，具有溫肺化痰、通絡(luò)止痛等功效，主治胸脅脹痛、寒痰咳嗽、痰滯經(jīng)絡(luò)、關(guān)節(jié)麻木、疼痛、痰濕流注、陰疽腫毒等癥[1-2]。臨床常用于穴位貼敷治療咳嗽[3]、哮喘[4-5]、慢性阻塞性肺疾病等[6]。全國(guó)各地均有栽培，主產(chǎn)于安徽、河南、四川、山東、浙江、陜西等地[2,7]。白芥子的化學(xué)成分主要為芥子堿硫氰酸鹽、芥子酸、白芥子苷等[7]，其中，芥子堿硫氰酸鹽是2020 年版《中國(guó)藥典》中規(guī)定的指標(biāo)性成分，也是止咳、平喘、豁痰的藥效成分[8]。

2020 年版《中國(guó)藥典》中芥子堿硫氰酸鹽含量測(cè)定方法在實(shí)際操作中存在不足，因此本研究通過(guò)建立更為科學(xué)、合理的含量測(cè)定方法，結(jié)合指紋圖譜相似度、聚類分析及主成分分析綜合評(píng)價(jià)白芥子藥材的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

LC-20A 型高效液相色譜儀［島津（中國(guó)）有限公司］；2998 型高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司）；BT25 型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；AE-160 型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品（ 批號(hào)：111702-201605，純度：98.3%）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；芥子酸對(duì)照品（批號(hào)：530-59-6，純度≥98%）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。

白芥子藥材（河北雙寧藥業(yè)有限公司，批號(hào)：0850017031），經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為十字花科植物白芥Sinapis albaL.的干燥成熟種子。

水為娃哈哈純凈水，乙腈、磷酸為色譜純，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 白芥子藥材中芥子堿硫氰酸鹽含量測(cè)定

2.1.1 供試品溶液的制備 精密稱取白芥子粉末（過(guò)3 號(hào)篩）1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，超聲處理20 min（250 W，20 kHz），濾過(guò)，濾渣加甲醇同法提取3 次，濾液合并定容至150 mL容量瓶中，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成1 006 μg/mL 的對(duì)照品母液，按比例稀釋得400、300、200、100、50、25 μg/mL 的對(duì)照品溶液。

2.1.3 色譜條件 LC-20A 型高效液相色譜儀［島津（中國(guó)）有限公司］，Spursil C18色譜柱（250 mm ×4.6 mm, 5 μm），以乙腈-0.02 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（15 ∶85）為流動(dòng)相等度洗脫，流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：326 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.4 芥子堿硫氰酸鹽含量測(cè)定方法學(xué)考察（1）線性關(guān)系考察 取“2.1.2”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，濃度X為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y= 34 119X- 78 982，R2= 0.999 8，結(jié)果表明芥子堿硫氰酸鹽在25 ～ 400 μg/mL 內(nèi)線性關(guān)系良好。

（2）精密度考察 取“2.1.2”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，峰面積RSD 為0.14%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

（3）重復(fù)性考察 按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算芥子堿硫氰酸鹽含量，RSD 為0.12%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

（4）穩(wěn)定性考察 按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)樣，計(jì)算芥子堿硫氰酸鹽含量，RSD 為0.04%，結(jié)果表明樣品24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（5）加樣回收率考察 取已測(cè)知含量的樣品6 份，每份約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入4.40 mg 芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。計(jì)算得芥子堿硫氰酸鹽平均加樣回收率為102.1%，RSD 為0.55%，結(jié)果表明方法穩(wěn)定可靠。

2.1.5 芥子堿硫氰酸鹽含量測(cè)定 測(cè)定市售三個(gè)產(chǎn)地15 批白芥子藥材中芥子堿硫氰酸鹽的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 15 批白芥子藥材中芥子堿硫氰酸鹽含量測(cè)定結(jié)果（n = 3）Tab. 1 Determination results of sinapine thiocyanate content in 15 batches of white mustard（n = 3）

2.2 白芥子藥材指紋圖譜的建立

2.2.1 供試品溶液的制備 取白芥子1 g 于圓底燒瓶中，加水300 mL，回流提取30 min，待藥液溫度降至約50 ℃，過(guò)濾，藥渣加水200 mL，同法回流一次，過(guò)濾。將兩次煎液合并后用容量瓶定容至500 mL，搖勻后取5 mL 煎液，加5 mL 甲醇，室溫放置10 min，于離心機(jī)中10 000 r/min 離心5 min，過(guò)0.22 μm 濾膜濾過(guò)。

2.2.2 色譜條件 2998 型高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司），ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（含0.05%三乙胺溶液）（B）為流動(dòng)相梯度洗脫（0 ～ 5 min，98% ～ 97% B；5 ～ 15 min，97% ～ 95% B；15 ～55 min，95% ～ 70% B），流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，白芥子藥材中各成分得到很好的分離。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 白芥子樣品 HPLC 圖譜Fig. 1 HPLC of white mustard samples

2.2.3 方法學(xué)考察 （1）精密度考察 取編號(hào)P4 藥材適量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，以7 號(hào)色譜峰為參照峰（S），計(jì)算得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD < 0.11%，相對(duì)峰面積的RSD <4.35%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

（2）重復(fù)性考察 取編號(hào)P4 藥材適量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，以7 號(hào)色譜峰為參照峰（S），計(jì)算得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD <1.05%，相對(duì)峰面積的RSD < 3.67%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

（3）穩(wěn)定性考察 取編號(hào)P4 藥材適量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件分別在第0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)樣，記錄峰面積，以7 號(hào)色譜峰為參照峰（S），計(jì)算得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD < 0.49%，相對(duì)峰面積的RSD < 4.76%，結(jié)果表明樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 不同產(chǎn)地白芥子藥材指紋圖譜比較 按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備15 批次白芥子藥材供試品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，將圖譜以cdf.格式導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”，以P1 為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度為0.1 min，對(duì)照?qǐng)D譜生成方法為中位數(shù)法。因P5 指紋圖譜中色譜峰較少，P9 指紋圖譜中雜質(zhì)峰影響較大，故進(jìn)行剔除處理，見(jiàn)圖2。生成樣品對(duì)照指紋圖譜R，見(jiàn)圖3。其中，13 批次不同產(chǎn)地白芥子藥材共有峰10 個(gè)。在與對(duì)照品色譜圖比對(duì)之后，確定7 號(hào)峰為芥子堿硫氰酸鹽，10 號(hào)峰為芥子酸。13 批白芥子藥材指紋圖譜相似度范圍為0.944 ～ 1.000，表明這13 批白芥子藥材的指紋圖譜相似度較高。

圖2 15 批白芥子樣品色譜峰匹配圖Fig. 2 Chromatographic peak matching diagram of 15 batches of white mustard samples

圖3 白芥子樣品 HPLC 指紋圖譜共有模式Fig. 3 The common pattern of HPLC fingerprints of white mustard samples

2.2.5 聚類分析 利用SPSS 20.0 軟件對(duì)除P5、P9 外其它13 個(gè)產(chǎn)地的白芥子藥材進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。13 批白芥子藥材被分為兩類，P1-P4、P6 -P8、P10 號(hào)藥材為一類；P11-P15 號(hào)藥材為一類。聚類分析顯示白芥子藥材的質(zhì)量受產(chǎn)地影響。

圖4 13 批白芥子藥材聚類分析圖Fig. 4 Cluster analysis diagram of 13 batches of white mustard

2.2.6 主成分分析 以13 批白芥子藥材的10 個(gè)共有峰的峰面積為初始數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，得到主成分的特征值和方差貢獻(xiàn)率見(jiàn)表2，碎石圖見(jiàn)圖5。以特征值>1 為提取標(biāo)準(zhǔn)，共確定3 個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率為85.995%，能夠較好地反映其化學(xué)成分特征。對(duì)主成分載荷值進(jìn)行計(jì)算，并根據(jù)公式F=0.469 12F1+ 0.279 99F2+ 0.110 84F3（F為 主 成 分綜合得分，F(xiàn)1、F2、F3分別為3 個(gè)主成分得分）計(jì)算綜合得分，見(jiàn)表3。不同產(chǎn)地白芥子綜合得分為-2.51 ～ 1.20，若以10 個(gè)共有成分為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，其中，四川產(chǎn)地的白芥子藥材總體評(píng)分較高。主成分分析能把不同產(chǎn)地白芥子分開(kāi)，說(shuō)明其質(zhì)量存在差異。

表2 主成分特征值和貢獻(xiàn)率Tab. 2 Principal component eigenvalues and contribution rate

表3 不同產(chǎn)地白芥子主成分得分和綜合得分Tab. 3 Principal component scores and comprehensive scores of white mustard from different producing areas

圖5 13 批白芥子藥材碎石圖Fig. 5 Scree plot of 13 batches of white mustard

由表4 載荷矩陣可知，第1 主成分主要反映1、2、3、5、10 號(hào)色譜峰的主要信息；第2 主成分主要反映4、6、7 號(hào)色譜峰的主要信息；第3 主成分主要反映8、9 號(hào)色譜峰的主要信息。以3 個(gè)主成分為變量得到載荷圖，見(jiàn)圖6。已標(biāo)定的芥子堿硫氰酸鹽（峰7）落在第2 主成分，芥子酸（峰10）落在第1 主成分，且芥子堿硫氰酸鹽（峰7）有較大的權(quán)重值，說(shuō)明其在這13 批白芥子藥材中比較穩(wěn)定，對(duì)主成分的貢獻(xiàn)率最大，在決定不同批次間白芥子藥材質(zhì)量差異上起著重大的作用。

圖6 主成分分析載荷圖Fig. 6 Principal component analysis loading plot

表4 初始因子載荷矩陣Tab. 4 Initial factor loading matrix

3 討論

3.1 供試品的制備方法

3.1.1 粉碎粒度的考察 達(dá)到2020 年版《中國(guó)藥典》粒度標(biāo)準(zhǔn)粉碎時(shí)間較長(zhǎng)且堵塞篩孔現(xiàn)象嚴(yán)重，且2020 年版《中國(guó)藥典》收載的其它種子類藥材，如：萊菔子、馬錢子、車前子等，均為粉碎過(guò)3 號(hào)篩后進(jìn)行含量測(cè)定，因此最終確定將白芥子粉碎后過(guò)3號(hào)篩。

3.1.2 供試品復(fù)溶溶劑的考察 樣品經(jīng)減壓回收溶劑后用流動(dòng)相復(fù)溶殘?jiān)?，靜置后油水分離，析出白色沉淀。本研究直接以提取液定容進(jìn)樣，省去除去溶劑、復(fù)溶的步驟，重復(fù)性較好，且含量均符合2020 年版《中國(guó)藥典》規(guī)定。

3.2 色譜條件的選擇

本研究采用乙腈-0.02 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（15 ∶85）進(jìn)行色譜分析，相比于原流動(dòng)相，大大降低了無(wú)機(jī)鹽的加入量，避免高鹽環(huán)境對(duì)儀器和色譜柱的損害，且能達(dá)到較好的峰型及分離效果。

3.3 分析方法評(píng)價(jià)

13 批藥材指紋圖譜相似度均大于 0.9，說(shuō)明不同產(chǎn)地的白芥子藥材質(zhì)量較穩(wěn)定。個(gè)別地區(qū)藥材指紋圖譜相似度小于0.9，分析原因可能與該地種植戶種植年限和采收時(shí)期有關(guān)。主成分分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致，15 批白芥子樣品主要分為兩類：四川產(chǎn)白芥子聚為一類，安徽產(chǎn)白芥子聚為一類。說(shuō)明藥材質(zhì)量受地域影響，為白芥子的產(chǎn)地識(shí)別追溯提供支持。

4 結(jié)論

本研究對(duì)2020 年版《中國(guó)藥典》中白芥子中芥子堿硫氰酸鹽含量測(cè)定方法進(jìn)行了優(yōu)化，并結(jié)合指紋圖譜、聚類分析和主成分分析方法對(duì)白芥子藥材質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果表明白芥子藥材質(zhì)量和地域之間存在相關(guān)性，同時(shí)為白芥子藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)研究奠定基礎(chǔ)。