5 種烏頭屬藥用植物種子的顯微鑒別研究

尹碧薇，郭云剛，池秀蓮，陳靈麗，李漣漪，程 蒙，李文淵，葛 慧，趙 鑫，崔光紅*，李曉琳*

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心 道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700；2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；3.中國科學(xué)院昆明植物研究所，云南 昆明 650201；4.青海大學(xué) 醫(yī)學(xué)院中藏藥研究中心，青海 西寧 810001；5.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 和政藥用植物園，甘肅 臨夏 731100）

烏頭屬Aconitum植物為一年至多年生草本植物，在全世界范圍內(nèi)約有350 種，我國有200 多種[1]，分別屬于烏頭亞屬、牛扁亞屬和露蕊烏頭亞屬。其中，烏頭亞屬品種最豐富，共147 種，牛扁亞屬共19 種，露蕊烏頭亞屬僅1 種，即露蕊烏頭[2]。該屬植物在我國有兩千多年的藥用歷史，約有76 種植物可供藥用[3]，如川烏和附子來源于烏頭Aconitum carmichaeliiDebx.的母根和子根[4]；關(guān)白附來源于黃花烏頭Aconitumcoreanum(Levl.) Rapaics 的塊根[5]；草烏、制草烏、草烏葉均來源于北烏頭Aconitum kusnezoffiiReichb.[6]。它們多具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛之功效，廣泛用于風(fēng)寒溫痹、關(guān)節(jié)疼痛、心腹冷痛、寒疝作痛、麻醉止痛等[7]。此外，烏頭屬植物的花大多為藍(lán)紫色，是重要的觀賞花卉[8]。

種子是藥材生產(chǎn)的源頭，種子的真?zhèn)蝺?yōu)劣直接關(guān)系到藥材的質(zhì)量。烏頭屬植物種子外觀較為相似，易發(fā)生種質(zhì)混雜，而針對該屬植物種子外觀、顯微鑒別特征的研究也極為貧乏。如：CAPPELLETTI 等[9]對歐洲烏頭屬植物的種子進行了掃描電鏡觀察，討論了橫膜翅的產(chǎn)生對種子形態(tài)性狀演化及其生態(tài)適應(yīng)意義?？缀捷x等[10]首次對我國烏頭屬57 個種及5 個變種的種子外觀形態(tài)進行了掃描電鏡觀察，探討了烏頭屬種子形態(tài)的系統(tǒng)學(xué)意義。在顯微結(jié)構(gòu)研究方面，僅有烏頭[11]、鐵棒錘和伏毛鐵棒錘[12]種子顯微鑒別特征的報道。隨著烏頭類藥材市場需求的不斷增加，人工馴化及栽培顯得日益迫切，而種子的鑒別對于從源頭保障烏頭類藥材質(zhì)量具有重要意義。為此，本研究考察了烏頭屬3 個亞屬的5 種易混淆藥用植物種子的性狀特征、微性狀特征和顯微特征，以期為烏頭屬種子的鑒別、質(zhì)量評價及烏頭屬植物的系統(tǒng)分類研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

烏頭、顯柱烏頭Aconitum stylosumStapf 種子采自云南省麗江市玉龍縣魯?shù)猷l(xiāng)，烏頭種子由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心崔光紅研究員鑒定；顯柱烏頭種子由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高山經(jīng)濟植物研究所楊少華研究員鑒定；鐵棒錘AconitumpendulumBusch、高烏頭AconitumsinomontanumNakai 種子采自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)和政藥用植物園，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)杜弢教授鑒定；露蕊烏頭AconitumgymnandrumMaxim.種子采自青海省黃南藏族自治州同仁縣，由青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院楊仕兵副教授鑒定。采集的種子去除雜質(zhì)后于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

VHX-6000 型體視顯微鏡（日本基恩士公司）；Hitachi S-3400 型掃描電鏡（日本日立公司）；MICROM HM325 型轉(zhuǎn)輪式切片機（德國賽默飛世爾科技公司）；YD-6L 型生物組織包埋機（浙江金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司）；OLYMPUS BX53 型顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）等。

乙醇、二甲苯、藏紅T 生物染色劑（批號：20170411）、固綠FCF 染色劑（批號：20181221）（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 方法

種子大小采用游標(biāo)卡尺測量，10 個重復(fù)。外觀及解剖結(jié)構(gòu)采用體視顯微鏡觀察，對種子的外觀性狀、顏色、形態(tài)及解剖結(jié)構(gòu)等進行記錄并拍照。

顯微結(jié)構(gòu)研究先采用掃描電鏡進行觀察：將干燥后的種子用導(dǎo)電雙面膠固定在樣品臺上，干燥、噴金處理后在放大35 倍、200 倍和1 000 倍下，對種子的整體形態(tài)、表面附屬物形態(tài)及表皮紋飾進行觀察和拍照。然后再用石蠟切片法進行制片觀察：將種子在FAA 固定液中固定15 d，依次用70%、80%、90% 、95%、100%乙醇溶液逐級脫水，每次2 h。無水乙醇-二甲苯（1 ∶1）1 h、二甲苯1 h 浸泡至種子透明。浸蠟時間24 h，切片厚度為10 μm。切好的蠟片在展片儀上展開，并于50 ℃烤干。在二甲苯中脫蠟、梯度復(fù)水，番紅染色2 h，經(jīng)系列乙醇逐級脫水后放入固綠溶液中染色，乙醇洗滌后二甲苯透明封片，在顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 性狀鑒別

烏頭屬種子的共同性狀特征是倒卵狀三棱形，灰褐色至褐色，頂端較寬且平，基部具不明顯的種臍；內(nèi)外種皮膜質(zhì)，胚乳豐富，乳白色，含油脂，胚細(xì)小，魚雷形，乳黃色，埋生于種仁基部，見圖1。

烏頭種子長：3.42 ～ 4.53 mm，寬：1.65 ～ 2.61 mm，厚：1.04 ～ 1.52 mm，千粒重：2.35 g；具3 條縱棱，腹棱延伸成較寬的翼狀膜質(zhì)翅；背部具波狀橫膜翅，兩端延伸至兩側(cè)面，皺縮，翅上具縱脈紋，見圖1：A1-A4。

顯柱烏頭種子與烏頭極為相似，但較大，長：4.20 ～5.79 mm，寬：2.35 ～ 3.34 mm，厚：1.22 ～ 2.06 mm，千粒重：3.40 g；具3 條縱棱，腹棱延伸成翼狀膜質(zhì)翅，背部橫膜翅較短，見圖1：B1-B4。

鐵棒錘種子較烏頭和顯柱烏頭略小，長：2.89 ～3.87 mm，寬：2.03 ～ 2.63 mm，厚：1.24 ～ 1.86 mm，千粒重：1.87 g；3 條縱棱延伸成翼狀膜質(zhì)翅，無皺縮，表面光滑，無明顯的橫膜翅或橫向鱗狀翅，見圖1：C1-C4。

高烏頭種子略小，長：2.42 ～ 3.35 mm，寬：1.91 ～2.29 mm，厚：1.53 ～ 1.89 mm，千粒重：3.29 g；具1 條縱棱，沿棱無翅，背部密生較窄的橫向鱗狀翅，見圖1：D1-D4。

露蕊烏頭為露蕊烏頭亞屬唯一的種，種子顯著小于其它烏頭屬種子，長：1.96 ～ 2.59 mm，寬：1.20 ～1.53 mm，厚：0.70 ～ 1.32 mm，千粒重：1.06 g；表面密生橫膜翅，較窄，見圖1：E1-E4。

圖1 5 種烏頭屬種子的形態(tài)及解剖結(jié)構(gòu)Fig. 1 Microstructures and anatomical structure of 5 Aconitum seeds

2.2 顯微鑒別

2.2.1 微性狀特征 在放大倍數(shù)為35 倍的掃描電鏡下觀察到烏頭種子的翼狀翅較寬，橫膜翅上具縱脈紋；顯柱烏頭種子的翼狀翅表面具不規(guī)則網(wǎng)格狀脈紋，橫膜翅較窄；鐵棒錘種子的表面較平滑，形成長梭形紋理；高烏頭種子的鱗狀翅較窄，具縱脈紋；露蕊烏頭種子的橫膜翅較窄，見圖2。

圖2 5 種烏頭屬種子翅的掃描電鏡圖Fig. 2 Scanning electron microscope images of seed wings of 5 Aconitum seeds

在放大倍數(shù)為1 000 倍的掃描電鏡下觀察到烏頭種子的表皮細(xì)胞呈長方形，表面具有較多瘤狀突起；顯柱烏頭種子的表皮細(xì)胞呈長方形，密生瘤狀突起；鐵棒錘種子的表皮細(xì)胞呈長梭形，表面具有較多瘤狀突起；高烏頭種子的表皮細(xì)胞呈長方形，表面幾乎無瘤狀突起；露蕊烏頭種子的表皮細(xì)胞呈梭形或橢圓形，形成網(wǎng)狀凹陷，見圖3。

圖3 5 種烏頭屬種子表皮紋飾的掃描電鏡圖Fig. 3 Scanning electron microscope images of seed epidermal ornamentation of 5 Aconitum seeds

2.2.2 切面顯微特征 5 種烏頭屬種子非常相似，均由外種皮、內(nèi)種皮、胚乳和胚四部分組成。外種皮細(xì)胞為一列長方形厚壁細(xì)胞，細(xì)胞壁四面增厚，外壁最厚，并部分延伸成翅狀，外壁表面有乳頭狀小突起；內(nèi)種皮為啞鈴狀支柱細(xì)胞；基部有種臍細(xì)胞；胚乳為長方形的薄壁細(xì)胞，較大，徑向排列，靠近中央細(xì)胞較小，內(nèi)含脂肪油滴和糊粉粒；胚細(xì)胞較小，多角形，排列緊密，內(nèi)含脂肪油滴，見圖4。

烏頭屬種子在外種皮結(jié)構(gòu)、內(nèi)種皮支柱細(xì)胞間隙大小、脂肪油滴數(shù)目等略有不同，見圖4。烏頭種子腹棱處外種皮延伸成較寬的翅，背部外種皮延伸成5 ～ 8 個橫向膜質(zhì)翅，內(nèi)種皮細(xì)胞下有一層薄壁細(xì)胞；顯柱烏頭種子外種皮細(xì)胞外壁較薄，約為5 μm，有乳頭狀小突起，腹棱翅略窄，背部橫向膜質(zhì)翅較多；鐵棒錘種子3 條縱棱外種皮細(xì)胞外壁延伸成翅，其余部分無翅，有乳頭狀小突起，內(nèi)種皮的支柱細(xì)胞狹長，排列緊密，胚乳和胚細(xì)胞中脂肪油滴較多；高烏頭種子1 條縱棱無翅，但背面和側(cè)面的外種皮細(xì)胞延伸成多個小翅，內(nèi)種皮支柱細(xì)胞間隙較大；露蕊烏頭種子外種皮細(xì)胞外壁較薄，約為5 μm，密生較小的橫膜翅，內(nèi)外種皮間有1 ～ 2 層狹長的薄壁細(xì)胞，內(nèi)種皮下有一層較小薄壁細(xì)胞，頂端為多層。

圖4 5 種烏頭屬種子的顯微結(jié)構(gòu)Fig. 4 Seed microstructures of 5 Aconitum seeds

3 討論

本研究建立了5 種烏頭屬植物種子的鑒別方法。由于種子形態(tài)性狀相對穩(wěn)定，常作為屬下劃分的重要依據(jù)[13-14]，因此，露蕊烏頭和高烏頭種子很容易與烏頭亞屬的3 種植物種子鑒別。單種屬的露蕊烏頭種子不僅顯著小于其它烏頭屬植物種子，而且其表皮細(xì)胞性狀和內(nèi)外種皮間的狹長薄壁細(xì)胞均可作為其鑒別特征。牛扁亞屬的高烏頭種子大小和千粒重與烏頭亞屬的3 種植物種子區(qū)別不明顯，以種子密生橫向鱗狀翅，表皮細(xì)胞光滑、無瘤狀突起為其主要特征。烏頭亞屬的烏頭、顯柱烏頭和鐵棒錘種子共同的特征是均具3 條縱棱，縱棱延伸成翼狀膜質(zhì)翅[10]。但烏頭種子的翼狀膜質(zhì)翅較大，顯柱烏頭種子明顯大于烏頭種子，背部的橫向膜質(zhì)翅更多，鐵棒錘種子3 條縱棱均延伸成翼狀膜質(zhì)翅，無皺縮，表面光滑。在切面顯微結(jié)構(gòu)上，發(fā)現(xiàn)鐵棒錘內(nèi)種皮的支柱細(xì)胞狹長，排列緊密，這一結(jié)果豐富了鐵棒錘種子形態(tài)鑒別特征[12]。

4 結(jié)論

5 種烏頭屬種子的鑒別特征為：烏頭種子腹翅寬大，背部橫向膜質(zhì)翅有5 ～ 8 個；顯柱烏頭種子大，背翅多；鐵棒錘種子無明顯的橫膜翅或橫向鱗狀翅，內(nèi)種皮的支柱細(xì)胞狹長；高烏頭種子密生橫向鱗狀翅，表皮細(xì)胞光滑、無瘤狀突起；露蕊烏頭種子小，表面密生較窄橫膜翅，表皮細(xì)胞形成網(wǎng)狀凹陷，內(nèi)外種皮間有薄壁細(xì)胞層。上述鑒別特征可為烏頭屬種子鑒別提供快速、準(zhǔn)確的方法，從生產(chǎn)的源頭——種源上解決種質(zhì)混雜問題，有利于藥材質(zhì)量控制，為烏頭屬植物的人工馴化和繁育提供技術(shù)支撐，同時也可為烏頭屬植物的分類和系統(tǒng)學(xué)研究提供依據(jù)。