不同光照處理甘藍型油菜幼苗花青素合成的轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析

滕守連，李 番，祁麗娟，郭童童，張生萍，妥小云，羅玉秀

(青海大學(xué)a生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，b農(nóng)林科學(xué)院,青海 西寧 810016)

油菜是世界上重要的油料作物之一[1]，種類繁多，其中低芥酸油菜的菜用價值近年來備受關(guān)注[2]，而光照是影響油菜生長、發(fā)育和產(chǎn)量的主要環(huán)境因素之一[3]。在光照誘導(dǎo)下，油菜內(nèi)的花青素會在植物器官(組織)內(nèi)逐漸積累[4]，使其顏色發(fā)生變化，這是許多植物的共同特征[5-6]。油菜幼苗在強光下會變紫，是由于其花青素物質(zhì)含量相應(yīng)提高，因此可作為膳食花青素的潛在來源[2]。

花青素是三大天然色素之一[7-8]，也是一種抗氧化劑，具有抵抗癌癥和預(yù)防心血管疾病的功效[2]，主要以花青素苷的形式存在。目前發(fā)現(xiàn)的天然花青素苷主要有6種：天竺葵素、矢車菊素、翠雀素、芍藥花色素、牽牛花色素和錦葵色素[9-10]，其中翠雀素、牽牛花色素和錦葵色素的花色苷衍生物是紫色和深色的來源，而矢車菊素、芍藥花色素和天竺葵素衍生物是鮮紅色水果中的主要色素[11-12]。目前，對模式植物擬南芥的花青素合成、代謝與調(diào)控基因已經(jīng)較為清楚[13]，已克隆的花青素合成基因有黃酮羥化酶(flavonoid 3′-hydroxylase，F(xiàn)3′H)、查爾酮合酶(chalcone synthase，CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase，CHI)、黃烷酮羥化酶(flavanone-3-hvdroxylase，F(xiàn)3H)、二氫黃酮還原酶(dihydroflavonol reductase,DFR)、黃酮葡糖基轉(zhuǎn)移酶(flavonoid 3-o-glucosyl-transferase，UF3GT)、花青素合成酶(anlthocyanidin synthase，ANS)基因和轉(zhuǎn)錄因子(MYB、bHLH和WD40)[14-18]；在小麥、玉米、矮牽牛等高等植物中也克隆了多個與花青素合成相關(guān)的基因[19-20]?；ㄇ嗨睾铣上嚓P(guān)基因受環(huán)境影響，其中光照是誘導(dǎo)花青素合成的環(huán)境因素之一,從擬南芥中已分離出早期光誘導(dǎo)蛋白1(ELIP1)和2(ELIP2)。目前，有關(guān)光照誘導(dǎo)植物花朵和果實顏色變化及花青素積累方面的研究較多[21]，對植物生殖器官色素的形成機理[22-26]研究較透徹，而有關(guān)營養(yǎng)器官花青素合成和積累機理的研究尚未見報道。本研究通過對油菜幼苗轉(zhuǎn)錄組和代謝組的分析，篩選出強光和弱光下油菜幼苗中的差異表達基因和差異代謝物，并對花青素合成途徑的相關(guān)基因進行驗證，鑒定出光照誘導(dǎo)油菜幼苗花青素合成的關(guān)鍵基因，以期為光照誘導(dǎo)植物營養(yǎng)器官花青素合成機理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

以甘藍型油菜自交系GLH4為研究材料。RNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Kit with gDNA Eraser)和熒光定量試劑盒(TB GreenTMPremix Ex TaqTM1)以及試驗所用Marker、酶、瓊脂糖等試劑,均由TaKaRa(大連)公司提供。引物用Primer5自行設(shè)計并由上海生工合成。

1.2 試驗設(shè)計

選取籽粒飽滿的油菜種子種植于花盆中，在人工氣候箱中培養(yǎng)，溫度設(shè)置為10/0 ℃(晝/夜)，光周期為16 h光照/8 h黑暗，光照強度300 μmol/(m2·s)，相對濕度90%，培養(yǎng)至2葉1心期進行光照誘導(dǎo)試驗。設(shè)置2個光照處理，分別為300 μmol/(m2·s)弱光處理和700 μmol/(m2·s)強光處理，溫度21/17 ℃(晝/夜)，相對濕度90%。觀察不同光照處理下0,24,48,72和96 h油菜幼苗的表型變化，并分別取處理96 h油菜的第1片真葉，用于轉(zhuǎn)錄組分析和代謝組分析；另取強光處理0，4，8，16和96 h的油菜第1片真葉和莖用于熒光定量(RT-qPCR)分析。樣品重復(fù)3次，每重復(fù)取6個單株混樣。取樣后用干冰存放送測。

1.3 RNA提取及cDNA合成

按照RNA提取試劑盒說明提取不同光照處理96 h油菜幼苗第1片真葉的總RNA，用1.2%瓊脂糖檢測RNA的完整性及是否存在DNA污染，用NanoPhotometer 分光光度計檢測 RNA 濃度(OD260/280和OD260/230)。

按First-Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(TaKaRa)說明將總RNA合成cDNA第一鏈，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄操作。將1 μL總RNA，2 μL Oligo(dT)18和24 μL RNA free ddH2O混勻，65 ℃水浴5 min，冰浴30 s，12 000 r/min瞬時離心，然后依次加入8 μL 5×R Buffer，2 μL RNA抑制劑，4 μL dNTPs和2 μL M-MVLV，瞬時離心后在PCR儀上于42 ℃孵育60 min，70 ℃滅活10 min。合成的cDNA置-20 ℃冰箱備用。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序及分析

cDNA文庫構(gòu)建完成后，使用Agilent 2100對文庫的插入片段進行檢測，用Illumina HiSeq2000高通量測序平臺(武漢邁威代謝生物公司)對cDNA文庫進行測序，再將下機數(shù)據(jù)進行過濾得到高質(zhì)量的Clean Data，與指定參考基因組進行序列比對，得到Mapped Data，用于可變剪接、新基因挖掘和基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化等分析；根據(jù)不同處理基因表達量進行差異表達、差異基因功能注釋等分析。采用 FPKM (fragments per kilobase of transcript per million fragments)計算方法估算每個轉(zhuǎn)錄本的表達量，若組間表達量差異>2,即差異表達倍數(shù)對數(shù)的絕對值>1,且P<0.05則視為差異表達基因，并對篩選到的差異基因進行KEGG分析[27]。

1.5 代謝組分析

用處理96 h的油菜第1片真葉為樣品，經(jīng)真空冷凍干燥，用研磨儀(MM 400,Retsch)研磨(30 Hz,15 min)至粉末。取100 mg粉末溶于1.0 mL提取液中，4 ℃冰箱過夜后，10 000g離心10 min，取上清，0.22 μm pore size濾膜過濾，存入進樣瓶，用于超高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)分析[28-29]。液相色譜分析條件為,(1)色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm，2.1 mm×100 mm；(2)流動相：乙腈-水溶液(體積比5∶9)；(3)洗脫梯度：0～11.0 min水/乙腈體積比95∶5，11.0～12.0 min水/乙腈體積比5∶95)，12.1～15.0 min水/乙腈體積比95∶5；(4)流速0.4 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量2 μL。質(zhì)譜條件為：電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)溫度500 ℃，質(zhì)譜電壓5 500 V，簾氣(curtain gas,CUR)25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離 (collision-activated dissociation，CAD)參數(shù)設(shè)置為高。在三重四級桿(QQQ)中，每個離子對根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓(declustering potential，DP) 和碰撞能 (collision energy，CE)進行掃描檢測。利用軟件Analyst 1.6.3處理數(shù)據(jù)。對原始數(shù)據(jù)進行過濾、去冗余；參考已有的質(zhì)譜公共數(shù)據(jù)庫(KNAPSAcK、DB和METLIN等)和基于本地自建代謝物數(shù)據(jù)庫對代謝物進行定性定量分析；利用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判別分析((O)PLS-DA)的VIP值和P值來篩選差異代謝物。代謝組分析由武漢邁威代謝生物公司完成。

1.6 熒光定量PCR驗證

對涉及轉(zhuǎn)錄因子、向光性應(yīng)激蛋白基因功能的8個花青素合成相關(guān)的差異表達基因進行RT-qPCR驗證，8個差異表達基因分別是2個轉(zhuǎn)錄因子MYB114和bHLH28,2個光誘導(dǎo)因子ELIP1和ELIP2，4個結(jié)構(gòu)基因F3′H、CHS、DFR和黃酮醇合成酶基因(flavonol synthase，F(xiàn)LS)。取強光處理0,4,8,16和96 h的油菜第1片真葉和莖，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA進行反轉(zhuǎn)錄。采用 Primer 5設(shè)計基因特異性引物，以β-ACT為內(nèi)參基因。RT-qPCR使用LightCycler?96儀器完成。反應(yīng)體系：上游引物(20 μmol/L) 4 μL，下游引物(20 μmol/L)4 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O 8 μL；反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性 60 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)。每個基因都進行3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，-2ΔΔCt法計算相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光照處理甘藍型油菜幼苗的表型觀察

圖1顯示，油菜幼苗在弱光300 μmol/(m2·s)下培養(yǎng)時，幼苗為綠色；但在強光700 μmol/(m2·s)下培養(yǎng)時，幼苗的子葉、真葉、葉柄和莖顏色隨培養(yǎng)時間延長逐漸變紫，且葉片背面變色較正面明顯，葉柄和葉脈顏色尤深，說明強光誘導(dǎo)了油菜幼苗中的花青素積累。

圖1 不同光照處理甘藍型油菜幼苗的表型觀察Fig.1 Phenotypic observation of Brassica napus seedlings under different light treatments

2.2 不同光照處理油菜幼苗的轉(zhuǎn)錄組分析

對經(jīng)弱光和強光處理96 h的油菜幼苗進行差異基因表達分析，共找到了9 840個表達差異顯著的基因(DEGs)，其中上調(diào)基因5 573個、下調(diào)基因4 267個。說明強光誘導(dǎo)一些基因表達的同時，也抑制了部分基因的表達，從而對強光作出應(yīng)答。

對差異基因進行KEGG功能注釋,結(jié)果顯示，9 840個DEGs被注釋到了139個KEGG通路中。其中參與光誘導(dǎo)的差異基因顯著富集到20條通路中(圖2)；注釋到代謝途徑的差異基因最多，為1 751個；其次為次生代謝物差異基因，為986個；此外，還有植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因349個，碳代謝基因208個，晝夜節(jié)律基因113個。

點越大，表示通路富集的差異基因數(shù)量越多；點顏色越紅，代表富集越顯著Larger point indicates more number of differential genes enriched by pathways；Color shows significance with most significant in red

通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，油菜幼苗在強光和弱光處理下，花青素生物合成途徑有48條差異表達基因。通過序列比對，這48條基因分別歸屬于10個花青素合成結(jié)構(gòu)基因，分別為3個F3′H、4個CHS、5個CHI、2個F3H、8個DFR、3個ANS、1個UF3GT、6個糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferase,GTs)、5個黃酮醇合成酶(flavonol synthase,FLS)和11個苯丙氨酸酶(phenylalanine ammpnialyase,PAL)基因(表1)。說明在強光誘導(dǎo)下，油菜通過對這些結(jié)構(gòu)基因表達量的調(diào)控來控制花青素合成，從而使油菜顏色發(fā)生變化。從花青素合成差異基因及關(guān)鍵基因中篩選獲得了表達量高度上調(diào)的編號為LOC106431192的基因，該轉(zhuǎn)錄本的FPKM值之比達49.10，說明片段數(shù)目能真實反映轉(zhuǎn)錄本表達水平。

表1 不同光照處理油菜幼苗中花青素合成途徑關(guān)鍵酶基因的KEGG分析Table 1 KEGG analysis of key enzyme genes of pigmentoglycin biosynthesis pathways Brassica napus seedlings under different light treatments

表1(續(xù)) Continued table 1

表1(續(xù)) Continued table 1

表1(續(xù)) Continued table 1

表1(續(xù)) Continued table 1

在強光處理油菜幼苗轉(zhuǎn)錄組中，多個轉(zhuǎn)錄因子表達水平發(fā)生了變化(表2)，其中參與花青素合成途徑的調(diào)節(jié)基因有MYB、bHLH、WD40[29]。根據(jù)基因注釋信息，通過Blast數(shù)據(jù)庫比對，本試驗中預(yù)測和鑒定到228個調(diào)節(jié)基因，包括編碼MYB的基因102個，編碼bHLH的85個，編碼WD40的41個，多數(shù)情況下1個以上的基因編碼同一種轉(zhuǎn)錄因子，這些基因或許代表不同的基因片段或者來自同一個基因家族，證明花青素相關(guān)基因在甘藍型油菜中存在多個拷貝，花青素合成相關(guān)基因受光照誘導(dǎo)調(diào)節(jié)。

表2 不同光照處理甘藍型油菜幼苗的差異轉(zhuǎn)錄因子Table 2 Differential transcription factors of Brassica napus seedlings under different light treatments

2.3 不同光照處理油菜幼苗的代謝組分析

對經(jīng)弱光和強光培養(yǎng)96 h的油菜幼苗進行代謝譜差異比較分析，結(jié)果(圖3)表明，共檢測到248個差異代謝物(DMs)，其中182代謝物表現(xiàn)為上調(diào)，66個代謝物表現(xiàn)為下調(diào)。代謝物主要包括黃酮類、糖類、氨基酸及衍生物、脂質(zhì)和苯丙素。其中黃酮類占比最大(32.66%)，其次為氨基酸及其衍生物(14.51%)，脂質(zhì)和苯丙素分別占5.24%和10.08%。

1.氨基酸及衍生物;2.糖類;3.苯丙素;4.脂質(zhì);5.黃酮類;6.有機酸及衍生物;7.維生素及衍生物;8.酚胺;9.醇類;10.吲哚及衍生物;11.核苷酸及衍生物;12.生物堿;13.多酚;14.萜類;15.其他1.Amino acid and derivatives;2.Carbohydrates;3.Phenylpropanoids;4.Lipids;5.Flavonoid;6.Organic acids and derivatives;7.Vitamins and derivatives;8.Phenolamides;9.Alcohols;10.Indole derivatives;11.Nucleotide and derivates;12.Alkaloids;13.Polyphenol;14.Terpene;15.Others圖3 不同光照處理油菜幼苗差異代謝物數(shù)量的分布Fig.3 Quantity analysis of different metabolites in Brassica nupus seedlings under different light treatments

對黃酮類物質(zhì)的功能注釋結(jié)果顯示，類黃酮代謝途徑的81個差異代謝物中包含34個黃酮、21個黃酮醇、9個黃烷酮、 7個花青素苷、7個類黃酮苷、2個原花青和1個異黃酮。7個花青素苷分別為松香花青素 O-己糖苷、花翠素 3-O-葡萄糖苷、矢車菊素、花翠素、芍藥色素雙葡萄糖苷、牽?；ㄉ?3-O-葡萄糖和天竺葵素-3-O-葡萄糖苷。其中矢車菊素、花翠素、花翠素 3-O-葡萄糖苷和牽?；ㄉ?3-O-葡萄糖代謝差異達到極顯著水平，說明光誘導(dǎo)油菜幼苗顏色的變化是以上4種花青素苷的積累所致。

2.4 不同光照處理油菜幼苗差異基因和差異代謝物的關(guān)聯(lián)分析

對不同光照處理油菜幼苗的差異基因和差異代謝物進行關(guān)聯(lián)分析，共找到多條共同富集代謝通路，但只有黃酮類代謝途徑的差異基因和差異代謝物均達到極顯著水平。注釋到類黃酮合成途徑的81個代謝物與48個差異表達基因顯著相關(guān)。說明油菜顏色的改變是由于光誘導(dǎo)調(diào)控了類黃酮合成途徑的多個基因表達發(fā)生變化，從而改變了類黃酮化合物的含量所致?；ù渌亍⑹杠嚲账丶捌溲苌锖康母淖兪菍?dǎo)致油菜幼苗顏色變化的主要色素。

2.5 強光處理油菜幼苗差異基因的驗證

采用RT-qPCR方法，對強光處理油菜幼苗測序中表達數(shù)量高且在各條通路中均顯著富集的前8個差異基因進行驗證，結(jié)果(圖4)顯示，4個結(jié)構(gòu)基因(F3′H、CHS、DFR、FLS)、2個轉(zhuǎn)錄因子(MYB114、bHLH28)和2個光誘導(dǎo)因子(ELIP1、ELIP2)在光誘導(dǎo)幼苗莖和葉中的表達量均隨誘導(dǎo)時間延長而增高，這與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致；所檢測的基因均受強光影響而表達，光誘導(dǎo)因子(EILP1、EILP2)和轉(zhuǎn)錄因子(MYB114)在強光下表達量很高，而4個結(jié)構(gòu)基因(F3′H、CHS、DFR、FLS)和轉(zhuǎn)錄因子(bHLH28)雖受光誘導(dǎo)表達，但表達量較低，因此推測EILP1、EILP2和調(diào)節(jié)因子MYB114為光誘導(dǎo)花青素合成的關(guān)鍵基因。

圖4 強光處理下油菜幼苗類黃酮途徑差異基因的RT-qPCR驗證Fig.4 RT-qPCR validation of differentially expressed genes in flavonoid pathway in Brassica napus seedlings treated with intensive light

3 討 論

光照是植物生長發(fā)育的必要條件，強光處理可以使一些植物營養(yǎng)器官和生殖器官的顏色發(fā)生改變[30]。油菜在強光下營養(yǎng)器官(組織)顏色變紫，且隨著誘導(dǎo)時間延長，葉片和莖紫色加深，子葉、老葉邊緣、葉柄及葉脈尤為明顯，這一現(xiàn)象與矮牽牛中的研究結(jié)果[31]相一致。由于植物花器官的觀賞價值和果實的營養(yǎng)價值，所以針對光照誘導(dǎo)植物生殖器官變化的研究較多，這些研究認為光誘導(dǎo)植物顏色變化主要是由于光照誘導(dǎo)花青素積累所致[32]。植物顏色由組織細胞液泡內(nèi)的色素組分和含量決定，而常見的色素主要有花青素、生物堿和胡蘿卜素3大類，其中花青素是最主要的天然色素[33]，是類黃酮合成途徑的次生代謝產(chǎn)物。目前對模式植物擬南芥中類黃酮代謝途徑及其分子機理的研究較為清楚[34]，已從中分離出類黃酮合成途徑的多個結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因，且這些基因在高等植物中高度保守[35-36]。

本研究通過篩選不同光照處理下甘藍型油菜幼苗的差異表達基因和差異代謝物發(fā)現(xiàn),強光處理油菜幼苗莖、葉顏色變紫，且隨誘導(dǎo)時間延長，顏色逐漸變深。通過轉(zhuǎn)錄組分析檢測到986個次生代謝物基因，其中花青素代謝途徑的48個差異表達基因達極顯著水平。通過序列比對分析，這48個基因與10個花青素合成的結(jié)構(gòu)基因同源，并鑒定出花青素合成途徑的228個調(diào)節(jié)基因?qū)儆谵D(zhuǎn)錄因子MYB、bHLH和WD40，證明花青素合成相關(guān)基因在甘藍型油菜中存在多個拷貝，且受光誘導(dǎo)調(diào)節(jié)。通過代謝組分析，從油菜幼苗的第1片真葉中檢測出了248個差異代謝物，其中類黃酮代謝途徑代謝物81個，不同光照處理油菜幼苗類黃酮途徑代謝物差異極顯著，證明類黃酮代謝途徑受光照誘導(dǎo)調(diào)控，油菜顏色變化是由于光照誘導(dǎo)其花青素積累所致，光照誘導(dǎo)油菜顏色的變化主要是由于光照誘導(dǎo)花青素合成基因ANS表達上調(diào)，使油菜矢車菊素、翠雀素和牽牛素含量增加所致。對轉(zhuǎn)錄組分析鑒定出的表達數(shù)量高且在各條目和通路中顯著富集的前8個差異基因進行RT-qPCR驗證，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致，這些基因受光照誘導(dǎo)表達，其中結(jié)構(gòu)基因(F3′H、CHS、DFR、FLS)和調(diào)節(jié)基因bHLH28表達量較低，為組成型表達，而調(diào)節(jié)基因MYB114、光誘導(dǎo)因子ELIP1和ELIP2表達量較高，為特異性表達，其表達特征與強光下油菜幼苗表型變化一致，MYB114是光誘導(dǎo)花青苷合成的調(diào)節(jié)基因[37-38]。光誘導(dǎo)因子ELIP1和ELIP2在光誘導(dǎo)下表達量急劇升高，可能在花青苷合成中起到了關(guān)鍵作用，這2個基因的具體功能有待進一步研究。