西瓜滲調蛋白ClOsm基因克隆及其編碼蛋白的抑菌活性

黃小忠，韋 湘，徐曉燕

(江蘇農林職業(yè)技術學院 茶與食品科技學院，江蘇 句容 212400)

西瓜是重要的經濟作物之一，我國是西瓜生產與消費的第一大國。據(jù)世界糧農組織(FAO)統(tǒng)計，2018年我國西瓜種植面積149.91萬hm2，總產量6 280.38 萬t，分別占世界西瓜種植面積和總產量的46.25%和60.43%。西瓜枯萎病由尖孢鐮刀菌西瓜?；颓秩疽穑瑖乐刂萍s西瓜生產，為害嚴重時可減產80%以上甚至絕收[1]。西瓜蔓枯病由瓜類黑腐球殼菌侵染引起，主要為害瓜蔓、葉片和果實，引起葉蔓枯死和果實腐爛[2]。西瓜白粉病主要為害葉片，以生長中后期受害較重，造成葉片干枯，植株早衰[3]。西瓜生長發(fā)育過程中枯萎病、蔓枯病和白粉病等病害的發(fā)生，降低了西瓜產量和品質。因此，挖掘抗病相關基因并應用于其抗病育種是提高西瓜品種抗病性的根本途徑。

病程相關蛋白(pathogenesis-related proteins，PRs)是寄主與病原物互作過程中誘導產生的一類蛋白，不僅在受侵染的組織中積累，在整個植株中均有表達[4]。目前已鑒定出17個不同的PRs蛋白家族，如具有β-1,3葡聚糖酶活性的PR-2、具有幾丁質酶活性的PR-3和類甜蛋白家族PR-5等，其中許多具有抗真菌活性[5]。PR-5蛋白包括類甜蛋白(thaumatin-like proteins，TLP)和滲調蛋白(osmotin)，是PRs蛋白中非常重要的蛋白之一。研究證明，PR-5蛋白不僅能誘導真菌細胞程序性死亡，抑制真菌侵染,還能誘導植物細胞的程序性死亡，激活植物防衛(wèi)反應信號途徑，增強植物的抗逆境能力[5]。體外抑菌試驗證明，PR-5蛋白能夠抑制尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)、輪枝菌(Verticilliumdahliae)等多種植物病原菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長[6-9]。用LePR5重組蛋白處理后，番茄黑腐病發(fā)病率比對照降低了49%[7]。PR-5蛋白因其顯著的抑菌活性，已被廣泛應用于植物抗真菌基因工程研究[8-11]。目前已經從小麥[12]、大豆[13]、羅勒[6]、荔枝[14]、香蕉[15]、櫻桃番茄[7]等多種植物中克隆到PR-5基因。大量研究表明，PR-5基因在土豆[10]、煙草[8]、櫟樹[11]、擬南芥[9]等植物中的過量表達均顯著提高了轉基因植株的抗真菌能力。總之，盡管已經從多個物種中克隆了PR-5基因并開展了相關功能研究，但從西瓜中克隆和分析PR-5的研究并不多，只有Zhang等[16]報道了體外重組西瓜TLP蛋白的抑菌活性。因此，開展西瓜PR-5抗病基因挖掘，對其進行深入的表達和功能分析很有必要。

筆者前期運用蛋白質雙向電泳結合質譜鑒定技術，分析了枯萎病菌侵染下西瓜根系的差異表達蛋白，發(fā)現(xiàn)枯萎病菌侵染后有1個滲調蛋白的豐度顯著提高(數(shù)據(jù)另文發(fā)表)。在此基礎上，本研究利用RT-PCR技術，克隆該滲調蛋白基因，命名為ClOsm，采用熒光定量PCR技術分析ClOsm基因在西瓜不同器官及病原菌侵染下的表達特征，利用原核表達技術體外表達并純化ClOsm蛋白，研究其對病原菌生長的抑制活性，以期為通過基因工程技術創(chuàng)制西瓜抗病材料奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試西瓜(Citrulluslanatus(Thunb.) Matsum. et Nakai)品種為8424，種子購于上?；莺头N苗有限責任公司。將西瓜種子浸于55 ℃熱水中并不斷攪動，水溫自然降低至25 ℃左右后繼續(xù)浸種6～8 h。然后將種子置于28～30 ℃恒溫箱中催芽24 h，種子露白后播種于無菌育苗缽中，置于25～30 ℃、光照/黑暗時間為16 h/8 h、相對濕度70%的人工氣候箱中培養(yǎng)。取培養(yǎng)15 d的幼苗，取西瓜根、莖、葉，用于組織表達分析和病原菌侵染處理。

枯萎病菌、蔓枯病菌、白粉病菌、茄病鐮刀菌和輪枝鐮刀菌分別置于PDA平板上，25 ℃恒溫氣候箱中培養(yǎng)。以上菌株均由江蘇省農業(yè)科學院植保所提供。

1.2 病原菌侵染

取15 d的西瓜幼苗，用刀片進行傷根處理。取枯萎病菌菌塊接種于100 mL土豆葡萄糖液體培養(yǎng)基中，25 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，用血球記數(shù)法稀釋至孢子液濃度為5×106個/mL。采用浸根接種法進行植株侵染，分別于侵染后0(CK)，12，24，48，120，168 h取西瓜根系組織，液氮速凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ClOsm基因的克隆與序列分析

根據(jù)蛋白質雙向電泳分析中獲得的部分滲調蛋白序列信息，搜索西瓜基因組數(shù)據(jù)庫(http://cucurbitgenomics.org/)，獲得該滲調蛋白基因的全序列，采用PrimerPremier 5軟件設計特異引物，以西瓜枯萎病菌侵染12 h的西瓜根系組織cDNA為模板進行擴增。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃再保溫10 min。對PCR產物進行割膠回收并純化，再連接pGEM-T easy載體轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞進行藍白斑篩選，陽性克隆送南京擎科生物公司測序。采用Clustal X (ver 2.2)軟件進行多重氨基酸序列比對分析，采用GeneDOC(ver 2.7)軟件編輯序列，采用MEGA 5.0軟件構建系統(tǒng)進化樹。

1.4 ClOsm基因表達特性的RT-PCR分析

以西瓜根、莖、葉各器官的cDNA為模板，進行ClOsm基因在各器官中的表達模式分析。以西瓜枯萎病菌侵染不同時間的西瓜根系組織cDNA為模板，進行ClOsm基因的誘導表達分析。采用SuperReal PreMix (SYBR Green,TianGen,China)熒光定量PCR試劑和ABI PRISM7300實時定量PCR儀進行表達分析,反應體系與程序參照試劑說明。以西瓜18S rRNA基因(GenBank登錄號AB490410)為內參。采用2-ΔΔCT法[17]分析基因的相對表達量。每樣品設3個重復，試驗重復3次。

1.5 原核表達載體構建

以西瓜葉片cDNA為模板，用帶有NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點的ClOsm引物進行PCR擴增，得到ClOsm基因編碼區(qū)。分別將ClOsm基因與帶有His標簽的pET-28a(+)載體進行NcoⅠ與XhoⅠ雙酶切，采用同源重組的方法將ClOsm基因片段連接到pET-28a(+)載體上，經瓊脂糖電泳進行膠回收(按試劑盒步驟進行)，過程中去掉ClOsm基因的信號肽。16 ℃連接過夜，連接產物轉化到DH5α感受態(tài)細胞中，37 ℃培養(yǎng)14 h后在氨芐青霉素抗性平板上挑取白色菌落，經菌落PCR初步鑒定陽性克隆，再用NcoⅠ與XhoⅠ雙酶切鑒定，交由上海三優(yōu)生物醫(yī)藥公司測序，測序正確的質粒即為pET-28a(+)-ClOsm，得到His-ClOsm，以His為陰性對照。采用凍融法將pET-28a(+)-ClOsm重組質粒轉入大腸桿菌原核表達菌株Trans BL21(DE3) pLysS中，用于ClOsm重組蛋白的體外誘導表達。

1.6 ClOsm重組蛋白的體外誘導表達及純化

挑取His-ClOsm單克隆接種到適量氨芐青霉素抗性2×YT培養(yǎng)基中，200 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD600為0.6左右。加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，16 ℃培養(yǎng)14 h誘導融合蛋白表達。7 000 r/min離心10 min收集菌體，PLB buffer重懸后超聲裂解。裂解液過Ni柱純化，分別用低濃度咪唑洗滌和高濃度咪唑洗脫，SDS-PAGE檢測純化蛋白。

1.7 His-ClOsm融合蛋白的體外抑菌活性檢測

配制含50 μmol/L His-ClOsm的PDA培養(yǎng)基平板，用5 mm打孔器分別打取枯萎病菌、蔓枯病菌、白粉病菌、茄病鐮刀菌和輪枝鐮刀菌菌塊，分別置于PDA平板中央，28 ℃培養(yǎng)4 d后觀察His-ClOsm對病菌生長的抑制情況。以不含His-ClOsm蛋白的PDA平板為對照。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)利用SPSS 16.0的Student’t-test進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 ClOsm基因克隆及序列分析

以西瓜根系cDNA為模板進行PCR擴增，得到1條特異的長768 bp的產物(圖1)，經克隆和測序后獲得基因序列，命名為ClOsm(GenBank登錄號為MF445019)。ClOsm基因ORF包含768個堿基，編碼255個氨基酸，預測分子質量為27.52 ku，等電點為7.78。

M.DL2000 DNA Marker;1.ClOsm基因的擴增產物；2.陰性對照M.DL2000 DNA Marker;1.PCR product of ClOsm gene;2.Negative control圖1 西瓜ClOsm基因的PCR擴增Fig.1 Cloning of ClOsm from watermelon

將ClOsm基因編碼蛋白與已知的植物類甜蛋白(TLP)氨基酸序列進行多重序列比對，發(fā)現(xiàn)ClOsm基因編碼蛋白含有TLP蛋白家族特有的16個半胱氨酸保守域(圖2)。利用MEGA 5.0軟件進一步分析ClOsm蛋白與其他植物TLP 蛋白的親緣關系，結果如圖3所示。由圖3可以看出，不同植物的TLP 系統(tǒng)進化關系具有明顯的種屬特征，且進化樹分為兩類，一類為Thaumatin類型，另一類為osmotin類型。ClOsm蛋白與葫蘆科作物冬瓜BhOsm蛋白的親緣關系最近，相似度達95%，而BhOsm為osmotin類型[18]，故將ClOsm蛋白歸為osmotin類型。

*為16個TLP蛋白保守的半胱氨酸殘基。ClOsm.西瓜(MF445019)；BhOsm.冬瓜(AAD53089.1)；CsOsm.黃瓜(XP_004150181.1)；CmOsm.甜瓜(XP_008457495.1)；CjTLP.檸檬(BAI63297.1)；CcTLP.克萊門柚(XP_006424795.1)* indicate the conserved 16 cysteine residues.ClOsm.Citrullus lanatus (MF445019);BhOsm.Benincasa hispida (AAD53089.1);CsOsm.Cucumis sativus (XP_004150181.1);CmOsm.Cucumis melo (XP_008457495.1);CjTLP.Citrus jambhiri (BAI63297.1);CcTLP.Citrus clementina (XP_006424795.1)圖2 ClOsm氨基酸序列與其他植物TLP蛋白氨基酸序列的多重比對Fig.2 Multi-alignment of deduced TLP proteins of watermelon with other plant species

數(shù)字表示bootstrap重復1 000次的置信度。標尺為氨基酸置換概率Numbers show the confidence level of bootstrap replication 1 000.The scale bar means changes of amino acids圖3 ClOsm與其他植物TLP蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of ClOsm with TLPs from other plants

2.2 ClOsm基因的表達特性

由圖4-A可見，ClOsm基因在西瓜根、莖、葉各組織中都有表達，其中在根中表達量最高，莖中略低，而在葉中表達量最低。

由圖4-B可見，西瓜枯萎病菌侵染后ClOsm基因表達被誘導。接種120 h時ClOsm基因的表達量達到最高，為未接種對照CK的1.39倍(P<0.05)； 168 h時表達量有所下降，但仍高于對照CK，為對照CK表達量的1.19倍。

A.ClOsm基因在西瓜不同組織中的表達；B.ClOsm基因在西瓜根系枯萎病菌侵染不同時間的誘導表達A.Expression of ClOsm gene in different watermelon tissues;B.Expression of ClOsm gene in watermelon roots under Fusarium oxysporum inoculation圖4 ClOsm基因的表達特性Fig.4 Expression profile of ClOsm gene

2.3 His-ClOsm融合蛋白的誘導表達及純化

采用同源重組的方法將ClOsm基因片段連接到pET-28a(+)載體上，獲得重組質粒pET-28a(+)-ClOsm，其經雙酶切后得到1條長約750 bp的條帶(圖5-A)，與預期大小一致，結合測序驗證結果表明，原核表達載體pET-28a(+)-ClOsm已成功構建。用重組質粒pET-28a(+)-ClOsm轉化大腸桿菌原核表達菌株Trans BL21(DE3) pLysS后，用IPTG誘導重組蛋白的表達，根據(jù)重組蛋白序列預測ClOsm蛋白的分子質量為26.1 ku。SDS-PAGE鑒定結果顯示，誘導蛋白His-ClOsm分子質量大小約為26 ku，與理論分子質量一致，且樣品純度大于90%(圖5-B)。

A.pET-28a(+)-ClOsm原核表達載體酶切驗證：1.未酶切的pET-28a(+)-ClOsm質粒；2.酶切后的pET-28a(+)-ClOsm質粒；M1.DNA Marker。B.純化的His-ClOsm融合蛋白：M2.低分子量蛋白Marker；3.純化的His-ClOsm蛋白；4.陽性對照A.Recombinant plasmid digested by Nco Ⅰ and Xho Ⅰ：1.pET-28a(+)-ClOsm plasmid;2.pET-28a(+)-ClOsm plasmid digested by Nco Ⅰ and Xho Ⅰ；M1.DNA Marker.B.Purified recombinant His-ClOsm protein：M2.Low molecular weight protein Marker;3.Purified His-ClOsm protein;4.Positive control圖5 His-ClOsm融合蛋白的誘導表達Fig.5 Induction and purification of recombinant His-ClOsm protein

2.4 His-ClOsm融合蛋白的體外抑菌活性

由表1可見，對照PDA平板上菌絲能夠正常生長，而His-ClOsm融合蛋白處理的PDA平板上，西瓜枯萎病菌、蔓枯病菌、白粉病菌、茄病鐮刀菌和輪枝鐮刀菌等5種病原菌的生長均受到抑制，抑制率分別為70.2%，60.8%,65.3%，55.4%和46.6%。

表1 His-ClOsm重組蛋白對病原真菌的抑菌活性Table 1 Antifungal activity of recombinant His-ClOsm protein

3 討 論

植物受到生物或非生物脅迫時，病程相關蛋白5(PR-5)在植物組織內迅速表達并積累，從而快速提高植物抗性。本研究從西瓜中克隆到PR5蛋白基因ClOsm，其氨基酸序列具有典型的PR5蛋白保守結構域，系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)ClOsm與PR5蛋白家族中的osmotin類型蛋白聚為一類，表明ClOsm屬于osmotin蛋白類型；組織特異性表達結果表明，ClOsm基因在根中表達量最高，其次是莖和葉。這與張宏一等[19]的研究結果一致，而與尚姝婷等[20]在花中表達量最高的研究結果不同。osm基因在花中高表達可能與其促進花的減數(shù)分裂[21]有關。滲調蛋白在植物中普遍存在，其表達受多種脅迫因素誘導[22]。osm過量表達提高了植株對鹽脅迫[22]、干旱[20,23-24]、低溫和病害[25]的抗性。本研究中，西瓜被枯萎病菌侵染后，ClOsm基因的表達受到枯萎病菌的誘導，在侵染后120 h表達量最高，與王樹軍等[14]的研究結果一致，說明ClOsm基因可能在西瓜響應枯萎病菌侵染過程中發(fā)揮作用。

已有大量的體外抑菌試驗證明，抗真菌活性是PR-5蛋白的主要生理功能之一。如牛心樸子草類甜蛋白CkTLP對植物病原真菌尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、輪枝菌(Verticilliumdahliae)、絲核菌(Rhizoctoniasolani)、葡萄孢菌(Botrytiscinerea)和腐爛病菌(Valsamali)有抑制作用[26]?；ㄉ鶤dTLP重組蛋白對尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)和葡萄孢菌的孢子萌發(fā)以及絲核菌的菌絲生長有抑制作用[8]。Wang等[27]從美洲黑楊×歐美楊中分離到的類甜蛋白PeTLP能夠抑制根霉菌(Rhizopussp.)菌絲體生長和黑曲霉菌(Aspergillusniger)、桔青霉菌(Penicilliumcitrinum)的孢子萌發(fā)。TLP蛋白的抗真菌活性可能與其具有β-1,3-葡聚糖酶活性有關。β-1,3-葡聚糖是真菌細胞壁的主要成分，葡聚糖酶活性可以使TLPs結合并降解真菌細胞壁。但是并非所有的TLPs都具有抗菌活性，如大麥TLPs蛋白HvPR5b、Pr22-1和Pr22-2[28]及橡膠osmotin-like蛋白[29]不能抑制真菌生長。本研究中的體外抑菌試驗結果表明，ClOsm對枯萎病菌、蔓枯病菌、白粉病菌、茄病鐮刀菌和輪枝鐮刀菌等西瓜常見病原菌都有很好的抑制作用，提示ClOsm可能在西瓜抗病方面發(fā)揮一定作用。

有關植物PR-5蛋白的抑菌機制研究目前仍處于探索階段。有研究認為，PR-5蛋白能引起病原菌細胞膜通透性改變，在菌體細胞膜上產生小孔，使得細胞內容物外滲，從而導致菌體死亡[30]。也有研究認為，PR-5蛋白對病原菌的識別與病原菌細胞壁或細胞膜的表面成分有關，如Permatin蛋白通過與真菌細胞膜上的特異性磷脂成分相互作用，引起細胞膜裂解破碎致菌體死亡[31]。不同基因可以增強或抑制PR-5蛋白的抑菌作用。如酵母細胞壁糖蛋白的PIR家族能抑制PR-5蛋白的活性，而糖蛋白上的磷酸化甘露聚糖則能增強PR-5蛋白對菌體的毒性[32]。為進一步明確西瓜ClOsm基因的抑菌功能，后續(xù)擬采用農桿菌介導法獲得ClOsm基因過量表達的植株，并對其進行組織病理學觀察及抗病性分析，以明確ClOsm基因調控西瓜抗枯萎病的機制。