布魯菌M5侵染小鼠骨髓源性樹突狀細胞后抗原肽的篩選

張 凡，周永順，陳福龍，李 剛，何 營，韓 凱，孟凡則，李婷婷，劉子超，高劍峰

(石河子大學 生命科學學院，新疆 石河子 832003)

布魯菌(Brucella)是一種兼性胞內(nèi)寄生的革蘭陰性菌，能直接或間接感染人和動物[1]，對以畜牧業(yè)為主的發(fā)展中國家和地區(qū)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[2-4]。其羊種疫苗株M5由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所于1962年研發(fā)，該疫苗來自于羊分枝桿菌的強毒株[5-6]。樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)是目前免疫系統(tǒng)中被認為最有效的抗原遞呈細胞之一，是唯一能夠激活初始T淋巴細胞并由此誘導適應性免疫應答的抗原遞呈細胞，幾乎與所有類型的免疫細胞相互作用[7]，可以感知不同類型的病原體，并調(diào)節(jié)不同類型的免疫反應[8]。樹突狀細胞捕獲、處理入侵的微生物，接著將其抗原決定簇遞呈至相應的淋巴細胞中，捕獲入侵的抗原后，未成熟的樹突狀細胞將轉化為成熟且活化的表型[9]，樹突狀細胞依賴Ⅰ類和Ⅱ類主要組織相容性復合物(MHC)分子進行抗原的處理和遞呈，以分別觸發(fā) CD8+或CD4+T細胞應答[10]，MHC Ⅰ類分子參與內(nèi)源性經(jīng)典遞呈途徑的同時也參與外源性抗原內(nèi)化遞呈途徑，而MHC-Ⅱ類分子僅參與遞呈外源性抗原[11]。

MHC Ⅱ類分子在抗原遞呈細胞的表面表達，并與源自自身和非自身抗原的短肽片段結合[12]。 這些肽-MHC復合物在自身抗原情況下具有維持免疫耐受的功能，在外源蛋白質(zhì)情況下具有啟動CD4+T細胞介導的適應性免疫的功能[13]。對抗原遞呈細胞上MHC Ⅰ和MHC Ⅱ分子蛋白的抗原肽序列的了解，將有助于疫苗和免疫療法的鑒定。關于病原體抗原肽的篩選及其與MHC分子的識別結合研究一直是免疫學研究的熱點之一。人們對抗原攝入、加工的機制，胞內(nèi)抗原肽-MHC Ⅱ類分子復合物的形成及其在抗原提呈細胞表面的遞呈過程等都有較為深入的了解[14]。目前，已經(jīng)運用表面展示技術、雙向熒光差異凝膠電泳及質(zhì)譜技術[15]等篩選并獲得多種病原體的主要抗原肽，其中將毛細管電泳或高效液相色譜儀與電離子噴霧串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，可以實現(xiàn)多肽混合樣品的在線分離測序，使抗原肽的大規(guī)模篩選成為可能，因此質(zhì)譜技術在抗原肽研究中的應用越來越多。Bozzacco等[16]建立了用小鼠FMS樣酪氨酸激酶3配體(Flt3L)體外富集小鼠脾臟樹突細胞和MHC-抗原肽免疫共沉淀的方法，結合質(zhì)譜和多肽合成技術，對小鼠脾臟樹突狀細胞中MHC Ⅱ類分子與抗原肽的結合進行了確證和定量分析。本試驗在體外誘導培養(yǎng)小鼠骨髓源性樹突狀細胞的基礎上，使用布魯菌M5作為外源性抗原刺激培養(yǎng)7 d的處于未成熟狀態(tài)的樹突狀細胞，使其成熟并完成抗原遞呈過程，再結合免疫共沉淀(CO-IP)以及LC-MS/MS技術對成熟樹突狀細胞表面MHC Ⅱ類分子結合的多肽片段進行分離篩選，以期為后續(xù)布魯菌病相關疫苗的研究提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材 料 C57BL/6小鼠200只，雄性，8～10周齡，由鄭州市惠濟區(qū)華興實驗動物養(yǎng)殖中心提供。綠色熒光標記的布魯菌M5菌株(GFP-M5)，由石河子大學生命科學學院細胞分子生物學實驗室構建。

1.1.2 試 劑 RPMI 1640細胞培養(yǎng)液、重組小鼠GM-CSF、重組小鼠IL-4、PBS和FBS，均購自美國GIBCD公司；紅細胞裂解液，購自北京索萊寶科技有限公司；PE標記的CD11c抗體和FITC標記的CD80抗體，購自美國Biolegend公司；IP Lysis Buffer(50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)，150 mmol/L NaCl，體積分數(shù)1% NP-40，質(zhì)量分數(shù)0.1% SDS，PierceTMIP Lysis Buffer，87787)，含體積分數(shù)2% Tween(Sigma公司，P9416)的PBST(NaCl 0.138 mol/L,KCl 0.002 7 mol/L(國藥集團，分析純)，體積分數(shù)0.05% TWEEN?20，pH 7.4)；pH 2.8的甘氨酸(Sigma公司，G1377)洗脫液(50 mmol/L)；甲酸、乙腈(ACN)，購自碧云天根生物有限公司；三氟乙酸(TFA)購自美國Biolegend公司。

1.2 小鼠骨髓源性樹突狀細胞的誘導培養(yǎng)

參考童志霞[17]的分離方法并稍作改進。

1.2.1 小鼠骨髓細胞的獲得 將小鼠用頸椎脫臼法處死，置于體積分數(shù)75%酒精中浸泡5 min消毒滅菌，手術去除所有股骨和脛骨，并用剪刀和鑷子將骨周圍的肌肉組織剔除干凈，然后再用醫(yī)用紗布揉搓，成為光桿，將剝離后的完整骨浸沒于事先預冷的4 ℃ PBS溶液中；將骨移至超凈工作臺內(nèi)，并用盛有體積分數(shù)75%酒精的無菌培養(yǎng)皿浸泡3 min消毒滅菌，然后用無菌的PBS清洗2次；將骨移入另一個盛有PBS的新培養(yǎng)皿中，剪去骨兩端，用注射器抽取PBS，針頭分別從骨兩端插入骨髓腔，反復沖洗出骨髓至新的無菌培養(yǎng)皿中，直至骨完全變白；收集骨髓懸液，用移液槍反復吹打使聚集的細胞完全分散，再用孔徑0.075 mm(200目)的尼龍網(wǎng)濾去小碎片和肌肉組織；濾過液1 200 r/min離心5 min，棄上清；加入4 mL紅細胞裂解液，吹打重懸細胞，室溫孵育4～10 min；加入15 mL PBS中和裂解液的作用，然后1 200 r/min離心5 min，棄上清；細胞沉淀用PBS洗1次，然后用含體積分數(shù)10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細胞，即可獲得小鼠骨髓細胞。

1.2.2 小鼠骨髓源性樹突狀細胞的誘導分化 小鼠骨髓細胞用計數(shù)板計數(shù)后，用含體積分數(shù)10% FBS的RPMI 1640 完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為 1×106mL-1；將細胞鋪至6孔板內(nèi)，每孔3 mL，同時加入重組小鼠GM-CSF(20 ng/mL)和IL-4(10 ng/mL)，將細胞培養(yǎng)板置于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此為培養(yǎng)的第1天；2 h后洗去細胞培養(yǎng)板中未貼壁的細胞；每2 d輕輕搖晃培養(yǎng)板，培養(yǎng)第3天按培養(yǎng)液1/2體積輕輕棄去上清培養(yǎng)液(以去除懸浮生長的粒細胞和淋巴細胞)，補加新鮮培養(yǎng)液及細胞因子GM-CSF(20 ng/mL)和IL-4(10 ng/mL)；培養(yǎng)第5天，再次補加細胞因子GM-CSF(20 ng/mL)和IL-4(10 ng/mL)；培養(yǎng)第6天按培養(yǎng)液1/3體積輕輕棄去上清培養(yǎng)液并補加相應的新鮮培養(yǎng)液及細胞因子；培養(yǎng)第7天，輕柔吹打培養(yǎng)液，收集懸浮細胞及疏松貼壁生長的細胞，1 200 r/min 離心5 min，棄上清，用含體積分數(shù)10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細胞并計數(shù)，然后調(diào)整細胞濃度至1×106mL-1鋪板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 小鼠骨髓源性樹突狀細胞的形態(tài)學觀察

6孔細胞板中的小鼠骨髓源性樹突狀細胞經(jīng)RPMI 1640完全培養(yǎng)液誘導培養(yǎng)，收集的細胞經(jīng)PBS洗滌、1 500 r/min 離心5 min后，再用含重組小鼠GM-CSF和IL-4的完全培養(yǎng)液吹打混勻，制成細胞懸液，分別在第1,3,5,7天置于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)學變化，包括細胞貼壁情況、細胞形態(tài)變化、細胞數(shù)量、細胞集落生長情況等。

1.4 小鼠骨髓源性樹突狀細胞表面表型的鑒定

收集6孔細胞板中培養(yǎng)至第7天的小鼠骨髓源性樹突狀細胞，用PE標記的CD11c抗體和FITC標記的CD80抗體進行標記，流式細胞儀檢測其成熟性。

1.5 GFP-M5侵染小鼠骨髓源性樹突狀細胞

收集6孔細胞板中培養(yǎng)至第7天的小鼠骨髓源性樹突狀細胞，按照細菌數(shù)與細胞數(shù)100∶1的比例用GFP-M5侵染細胞，然后用體積分數(shù)10% RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。以不作侵染處理的細胞作為空白對照，激光共聚焦顯微鏡觀察侵染情況。

1.6 MHC Ⅱ分子結合肽的分離純化

收集GFP-M5侵染24 h的樹突狀細胞，設置3組生物學重復，加入IP Lysis Buffer至體積20 μL，冰上孵育15 min，12 000g離心20 min，去掉上清，收集蛋白樣品。加入200 μL PBST，再加入到結合了MHC Ⅱ抗體的磁珠中，在旋轉混合儀上室溫孵育2 h。用400 μL PBST洗滌磁珠3遍，每次旋轉混合儀上洗滌5 min去掉未結合的蛋白或多肽。用60 μL甘氨酸溶解洗滌后的磁珠，加入15 μL 5×SDS loading buffer沸水浴5 min，1 000g離心1 min，收集上清溶液。上清液使用10 ku超濾管[18](pall OD010C35)過濾并離心15 min，去除大分子量蛋白成分，保留小的肽段成分。濾過液使用C18 固相萃取柱脫鹽。脫鹽詳細步驟為：收集多肽樣品用1 mL體積分數(shù) 0.1% TFA復溶；C18柱內(nèi)加入1 mL乙腈，抽干；C18柱內(nèi)加入1 mL體積分數(shù)0.1% TFA水，抽干；C18柱內(nèi)加入樣品，抽干；C18柱內(nèi)加入1 mL體積分數(shù)0.1% TFA水，抽干，重復1次；換1.5 mL新收集管，加入1 mL體積分數(shù)70% ACN/0.1%(體積分數(shù))TFA，抽干，此時1.5 mL EP管中有大約1 mL洗脫液，凍干。脫鹽凍干樣品用10 μL 體積分數(shù)0.1%甲酸水溶液復溶后供質(zhì)譜分析使用。

1.7 多肽樣品的色譜分離

每份樣品采用納升流速HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC(ThermoFisher)進行分離。液相所用A液為體積分數(shù)0.1%甲酸水溶液，B液為體積分數(shù)0.1%甲酸-乙腈水溶液(乙腈體積分數(shù)為84%)。液相色譜柱(0.15 mm×150 mm，RP-C18)以95%的A液進行平衡，樣品由自動進樣器上樣到Zorbax 300SB-C18，再經(jīng)過液相色譜柱分離，流速為250 nL/min，液相梯度設置如下：0～30 min，B液線性梯度從4%升到50%；30～34 min，B液線性梯度從50%升到100%；34～35 min，B液維持在100%。

1.8 多肽樣品的質(zhì)譜鑒定

酶解產(chǎn)物經(jīng)毛細管高效液相色譜分離后用Q Exactive質(zhì)譜儀(ThermoFisher)進行質(zhì)譜分析，分析時長35 min。多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集,檢測方式：正離子模式；母離子掃描范圍：300～1 800 m/z；一級質(zhì)譜分辨率：70 000 at m/z 200；AGC指標：3e6；一級最大IT：10 ms；掃描范圍數(shù)：1；動態(tài)排除：40.0 s。每次全掃描后采集10個碎片圖譜(MS2 scan)，MS2激活類型:HCD；隔離窗：2 m/z；二級質(zhì)譜分辨率：17 500 at m/z 200；微掃描：1；二級最大IT：60 ms；碰撞能量：30 eV；底部填充率：0.1%。

1.9 數(shù)據(jù)分析

質(zhì)譜測試原始數(shù)據(jù)(RawFile)用MaxQuant 1.5.5.1 軟件在布魯菌M5數(shù)據(jù)庫中比對，與布魯菌M5基因組匹配的MHCⅡ類結合序列即為樹突狀細胞遞呈的布魯菌M5短肽序列，再用軟件MEGA 7檢索這些序列在布魯菌M5中所代表的蛋白質(zhì)。

2 結果與分析

2.1 小鼠骨髓源性樹突狀細胞的形態(tài)學特征

由圖1可知，剛接種于培養(yǎng)液的骨髓細胞呈懸浮狀態(tài)生長，體積相對較小，細胞形態(tài)呈圓形，表面光滑無突起(圖1-A)；在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后(圖1-B)，部分細胞呈半懸浮狀態(tài)生長，細胞體積較之前明顯增大，形狀不規(guī)則，少數(shù)細胞表面可見微小突起；培養(yǎng)至第5天，懸浮生長的細胞明顯增多，有大量的細胞集落形成，細胞集落的數(shù)量和體積明顯增大，表面有微小突起的細胞數(shù)量增多(圖1-C)；培養(yǎng)至第7天，可見懸浮細胞大量聚集，形態(tài)更加突出，細胞表面突起明顯伸長，可見明顯的樹突狀突起明顯增多，呈現(xiàn)典型的樹突狀細胞特征(圖1-D)。

A.培養(yǎng)第1天；B.培養(yǎng)第3天；C.培養(yǎng)第5天；D. 培養(yǎng)第7天A.Day 1 of culture;B.Day 3 of culture;C.Day 5 of culture;D.Day 7 of culture

2.2 小鼠骨髓源性樹突狀細胞表面表型的鑒定

由圖2可知，誘導培養(yǎng)至第7天的小鼠骨髓源性未成熟樹突狀細胞高表達CD11c，其陽性率為72.0%；同時低表達CD80，其陽性率為8.4%，符合未成熟樹突狀細胞表面標志物的特征。

圖2 培養(yǎng)第7天的小鼠骨髓源性樹突狀細胞表型鑒定Fig.2 Phenotype identification of mouse bone marrow-derived dendritic cells on day 7 of culture

2.3 GFP-M5對小鼠骨髓源性樹突狀細胞的侵染程度觀察

由圖3可知，GFP-M5侵染未成熟小鼠骨髓源性樹突狀細胞24 h后，在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到大部分樹突狀細胞已完全被GFP-M5侵染，可進行后續(xù)試驗。

從左到右分別為含綠色熒光的布魯菌、小鼠骨髓源性樹突狀細胞陰影輪廓圖以及含綠色熒光布魯菌和小鼠骨髓源性樹突狀細胞的疊加圖The three figure from left to right represents Brucella containing green fluorescence,the shadow profile of mouse bone-marrow-derived dendritic cells,and a superposition of Brucella containing green fluorescence and mouse bone marrow-derived dendritic cells,respectively圖3 GFP-M5對小鼠骨髓源性樹突狀細胞的侵染情況Fig.3 Infection of GFP-M5 on mouse bone marrow-derived dendritic cells

2.4 小鼠骨髓源性樹突狀細胞膜上MHCⅡ類結合肽段的分離及鑒定

對經(jīng)GFP-M5侵染24 h的3組樹突狀細胞進行細胞膜MHCⅡ結合肽洗脫及LC-MS/MS分析，結果顯示，在每組試驗中，都能從細胞膜上分離識別出800多個MHCⅡ分子結合的肽序列，在表1中只列舉了經(jīng)與布魯菌全基因組比對，屬于布魯菌且在3個試驗重復中至少有2組重復出現(xiàn)的28個序列。

表1 小鼠骨髓源性樹突狀細胞膜上部分MHCⅡ類結合肽序列Table 1 Partial peptide sequences combined with MHC Ⅱ class on membrane of bone marrow dendritic cells in mice

對鑒定到的MHCⅡ結合肽序列進行蛋白質(zhì)鑒定，結果見表2。

表2 小鼠骨髓源性樹突狀細胞膜上部分MHCⅡ類分子結合肽蛋白鑒定結果Table 2 Identification of partial peptide proteins combined with MHC Ⅱ class molecules on marrow cell membrane of dendritic cells in mice bone

由表2可知，鑒定到的蛋白主要為生物合成整合膜蛋白、外膜蛋白BP26、外膜蛋白OMP28和各種外膜蛋白組裝因子(外膜蛋白組裝因子BamA和BamE)以及一些膜蛋白插入酶等；除與布魯菌外膜蛋白相關的蛋白外，還鑒定到ABC轉運蛋白滲透酶亞基、ABC轉運蛋白通透酶、3-羥基異丁酸酯脫氫酶等一些參與天然毒物、代謝廢物排出體外和酶促反應的相關酶。

3 討 論

布魯菌的抗原蛋白及其毒力因子大多集中在外膜蛋白(Omps)上，布魯菌屬分為羊種、牛種、豬種、犬種、綿羊附睪種及沙林鼠種等19個生物型，在中國流行的菌種主要是羊種布魯菌，其次是牛種布魯菌[19]。目前，已經(jīng)發(fā)布的布魯菌全基因組序列有12個，相關的蛋白質(zhì)、DNA/RNA序列達數(shù)十萬條 (檢索自NCBI網(wǎng)站) 。有人將Omps分為3組，其中第1組目前已經(jīng)確定的有Omp10、Omp18和Omp19；第2組包括分子質(zhì)量為36～38 ku的 Omps，1984年Douglas等[20]確定這組Omps為一種外膜的孔蛋白；第3組包括分子質(zhì)量為31～34 ku和25～27 ku的Omps。第2組蛋白和第3組蛋白以共價鍵的形式與細胞外膜的肽聚糖層緊密結合。

早期研究基本上是以小鼠或人的脾臟或胸腺組織為試驗材料，采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)或毛細管電泳質(zhì)譜聯(lián)用(HPCE-MS)技術分析淋巴細胞或樹突狀細胞中的MHC Ⅰ和Ⅱ免疫多肽組，其中包含的多肽數(shù)量有200～8 000不等，長度在11～25個氨基酸[21]。近年來，通過差異多肽組學技術，Ⅰ-Ⅱb期非小細胞肺癌的血清生物標志物[22]、早期胃癌血清特征性多肽組[23]、人阿爾茲海默癥血清多肽組[24]等陸續(xù)被報道，多肽組研究分析技術也不斷被改進和優(yōu)化[25-26]，基于HPLC-MS技術的多肽組學研究手段日益成熟。樹突狀細胞在抗原遞呈中扮演著重要角色，目前研究認為，樹突狀細胞為體內(nèi)遞呈功能最強大的專職抗原遞呈細胞[27]，是機體免疫應答的始動者。

本試驗使用布魯菌M5侵染體外誘導培養(yǎng)的小鼠骨髓源未成熟樹突狀細胞，并利用LC-MS/MS技術對樹突狀細胞膜上遞呈的外源性抗原肽進行篩選與分析。試驗設置3組生物學重復，從每組細胞膜上基本都能篩選出800多個MHCⅡ分子結合肽，經(jīng)過空白對照篩選，以及與布魯菌全基因組比對，得到了屬于布魯菌且至少在2組重復中出現(xiàn)的28個短肽序列。隨后對這些短肽序列進行了蛋白質(zhì)鑒定，可知這些蛋白質(zhì)有布魯菌外膜蛋白BP26(OMP26)和外膜蛋白OMP28、一些外膜蛋白組裝因子(外膜蛋白組裝因子BamA和BamE)、膜β-桶蛋白、生物合成整合膜蛋白等與布魯菌外膜蛋白相關的蛋白質(zhì)。其中，BP26蛋白是布魯菌的優(yōu)勢蛋白，是一種具有強免疫原性的外膜蛋白，在感染的動物血清中均能找到BP26蛋白單克隆抗體[28]。有研究表明，MHCⅡ分子遞呈的多肽分子除了來自相應的外源抗原蛋白外，還有一部分來自于細胞組織的重構、細胞的凋亡、細胞膜的編輯和補體或凝集因子的蛋白酶級聯(lián)降解[29]。本研究還鑒定到一些相關酶蛋白，如L,L-二氨基庚二酸酯氨基轉移酶、ABC轉運蛋白通透酶、DNA指導的RNA聚合酶β亞基、雙功能依賴ADP的NAD(P)H水合物脫水酶、NAD(P)H水合物差向異構酶等，這些酶類可能在布魯菌胞內(nèi)免疫逃逸或在細胞溶酶體內(nèi)以及抗原遞呈過程中發(fā)揮作用，也可能在細胞自身的生化反應中起作用。對篩選到的布魯菌外膜蛋白需要進行后續(xù)的原核表達、小鼠免疫以及小鼠布魯菌檢測等相關試驗，以進一步確證篩選到的布魯菌抗原肽。本試驗利用免疫共沉淀(CO-IP)以及LC-MS/MS技術完成了抗原遞呈細胞細胞膜上外源性抗原肽的分離與篩選，為針對布魯菌的特異性分子疫苗研制以及綿羊的抗布魯菌病分子標記輔助育種奠定了理論基礎。

4 結 論

本研究結果表明，聯(lián)合細胞因子重組GM-CSF和IL-4誘導小鼠骨髓單個核細胞向樹突狀細胞定向分化和增殖，第7天可以獲得數(shù)量較多、純度較高、具有抗原提呈功能的小鼠骨髓源樹突狀細胞；在經(jīng)外源性抗原布魯菌M5菌株持續(xù)侵染24 h 的樹突狀細胞膜上，可篩選到大量的MHCⅡ類分子結合肽，經(jīng)布魯菌全基因組比對，確定有28個短肽序列屬于布魯菌；進一步進行蛋白質(zhì)鑒定表明，這些短肽可能是布魯菌外膜蛋白和外膜蛋白組裝過程中需要的相關酶類，也可能是在抗原遞呈過程中細胞內(nèi)一系列生化反應所需的酶類。