芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的研究進(jìn)展

■雷新雨 陳玉珂 王桂芹 高永生 于夢(mèng)楠 張宇柔 王嘉婧 張東鳴，3

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130118；3.通化師范學(xué)院，吉林通化 134000）

在我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展中，抗生素的出現(xiàn)雖然促進(jìn)了其發(fā)展，但也對(duì)人和環(huán)境造成了嚴(yán)重的危害。因此，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部宣布，從2020年7月1日起，飼料企業(yè)將停止生產(chǎn)含有促生長(zhǎng)藥物飼料添加劑的商業(yè)化飼料（中藥除外），禁止在飼料中添加促生長(zhǎng)藥物，這意味著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)進(jìn)入了無(wú)抗養(yǎng)殖時(shí)代。在對(duì)抗生素替代品的研究過(guò)程中，研究人員發(fā)現(xiàn)益生菌是一個(gè)好的選擇。因此，研究者篩選了多種益生菌，如節(jié)桿菌（Conn and Dimmick）、芽孢桿菌（Bacillus）、腸球菌（Enterococcus）、乳桿菌（Lactobacillus）、乳球菌（Lacto?coccus）和微球菌（Micrococcus）等，均可用于提高水產(chǎn)養(yǎng)殖物種的生長(zhǎng)和免疫。

益生菌作為安全飼料添加劑用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，通過(guò)促進(jìn)宿主生長(zhǎng)、提供營(yíng)養(yǎng)、調(diào)節(jié)腸道菌群、改善免疫應(yīng)答、提高飼料利用率、提高消化吸收酶活性、改善水質(zhì)和提高魚體抗病力等來(lái)增強(qiáng)宿主的健康。在已發(fā)現(xiàn)的許多益生菌種類中，芽孢桿菌已被證明具有較好的益生菌特性，這是因?yàn)樗鼈兡軌虍a(chǎn)生抗菌物質(zhì)，這些抗菌物質(zhì)對(duì)許多微生物有調(diào)節(jié)作用，具有非致病性且無(wú)毒。與其他益生菌相比，芽孢桿菌在不同的環(huán)境中生存具有雙重優(yōu)勢(shì)（耐熱性和較長(zhǎng)的保質(zhì)期）。芽孢桿菌被證明可以增強(qiáng)消化酶活性、抗氧化酶活性、免疫酶活性、免疫相關(guān)基因和應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)以及抗病毒活性等，最重要的是維持腸道菌群平衡。芽孢桿菌也提高了魚對(duì)飼料的利用率，從而促進(jìn)魚體的生長(zhǎng)。因此，文章旨在綜述芽孢桿菌種類的形態(tài)特征、在調(diào)節(jié)飼料利用和生長(zhǎng)性能、抗氧化、免疫力、抗病力、腸道微生物、相關(guān)基因表達(dá)及改善水質(zhì)等方面的研究進(jìn)展，并對(duì)今后芽孢桿菌的研究重點(diǎn)進(jìn)行了展望。

1 芽孢桿菌種類的特征和形態(tài)

芽孢桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，是好氧或兼性厭氧菌，這種革蘭氏陽(yáng)性菌是飼養(yǎng)環(huán)境中的天然菌群，能夠產(chǎn)生和分泌許多細(xì)胞外酶，包括蛋白酶（桿菌肽和枯草素）。細(xì)胞形態(tài)呈桿狀，單個(gè)、成對(duì)或短鏈狀排列，兩端為鈍圓形；有芽孢，呈橢圓形或柱狀，中生或偏中生，孢囊微微膨大；在肉質(zhì)培養(yǎng)基上形成白色菌落，菌落呈扁平狀、邊緣不整齊、表面有皺褶；酶分泌的最適溫度為37℃。芽孢桿菌對(duì)外界環(huán)境有較強(qiáng)的抵抗力，對(duì)高溫、酸性、膽鹽和人工胃液有一定的耐受能力。目前用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的芽孢桿菌通常是從土壤、養(yǎng)殖水體、魚的腸道、陸生動(dòng)物體內(nèi)和卵圓管絳蟲腸道中分離出來(lái)的

芽孢桿菌的種類是非常重要的，因?yàn)樗鼈冇心芰Ξa(chǎn)生抗生素或抗生素代謝物，對(duì)致病性微生物有頡頏作用。由于具有合成多種具有抗菌活性的代謝物的能力，他們已被應(yīng)用于醫(yī)藥和制藥業(yè)，用于控制人、動(dòng)物和植物的各種疾病。芽孢桿菌還具有抗病毒能力，可以代謝生成桿菌肽、蛋白多肽類、多烯類等活性物質(zhì)，從而達(dá)到抑制有害病菌繁殖的目的，也可以通過(guò)與病原菌競(jìng)爭(zhēng)宿主體內(nèi)的附著位點(diǎn)，并且協(xié)助雙歧桿菌等有益菌在宿主體內(nèi)定植，恢復(fù)腸道菌群平衡，并且產(chǎn)生的抗生素和細(xì)菌素，能夠抑制毒性基因表達(dá)和水解酶的產(chǎn)生，如蛋白酶等。應(yīng)用于魚類的芽孢桿菌主要有枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短雙歧桿菌和淀粉酶芽孢桿菌。

2 芽孢桿菌提高水產(chǎn)動(dòng)物的飼料利用率和生長(zhǎng)性能

益生菌作為一種簡(jiǎn)單而安全的添加劑，能夠提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提高消化酶活性，從而提高飼料利用率和消化率來(lái)促進(jìn)魚體的生長(zhǎng)。芽孢桿菌以孢子的形式進(jìn)入，在腸道上部能迅速地復(fù)活并為機(jī)體提供有益代謝物質(zhì)（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等多種酶類），這些酶類可以將腸道中的大分子分解為小分子物質(zhì)，促進(jìn)宿主的吸收。無(wú)論是單獨(dú)或與其他免疫刺激劑聯(lián)合使用，芽孢桿菌作為益生菌，都能提高水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)和飼料利用率。芽孢桿菌給藥后水產(chǎn)動(dòng)物的消化酶活性的提高可能是由于細(xì)菌自身合成的酶，也可能是芽孢桿菌能夠刺激水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)內(nèi)源酶的產(chǎn)生。有研究發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）分泌的植酸酶對(duì)商業(yè)飼料和豆粕具有良好的消化效率；而且地衣芽孢桿菌在代謝過(guò)程中還會(huì)產(chǎn)生多種維生素，改善腸道消化功能，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體對(duì)各種營(yíng)養(yǎng)成分的消化和吸收；地衣芽孢桿菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的乙酸、丙酸和丁酸等能降低動(dòng)物腸道pH，酸化飼料，提高飼料消化吸收率。還有研究發(fā)現(xiàn)103CFU/g的芽孢桿菌和鰻弧菌（Vibrio anguillarum）聯(lián)合使用對(duì)白蝦（E.ori?entis）幼體的生長(zhǎng)性能、存活率以及對(duì)哈維氏和白斑綜合征病毒的抗性都有一定的促進(jìn)作用，109CFU/g的克勞氏芽孢桿菌（Bacillus Clausii）DE5和短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus Meyer and Gottheil）SE5對(duì)石斑魚（Epinephelinae）的腸道消化酶活性也有改善作用?？梢娧挎邨U菌在不同水生動(dòng)物的生長(zhǎng)性能方面均有積極作用，但在實(shí)際生產(chǎn)中要根據(jù)動(dòng)物種類及生長(zhǎng)階段的不同，制定不同的飼喂方案。

3 芽孢桿菌增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物抗氧化、免疫力和抗病力

吞噬過(guò)程和細(xì)胞代謝最終會(huì)導(dǎo)致活性氧（ROS）的產(chǎn)生，如過(guò)氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（·O2-）和羥基自由基（·OH）?；钚匝蹙哂懈叨鹊臍⑽⑸镒饔谩＿@些活性氧引起的損傷被抗氧化酶抵消，因此抗氧化酶保護(hù)宿主免受氧化應(yīng)激。超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）是魚類常見的抗氧化酶。已經(jīng)有研究證實(shí)投喂含有107CFU/g芽孢桿菌的飼料后，在第2周和第4周時(shí)，水產(chǎn)動(dòng)物的血清和黏液中SOD和GSH-Px活性均有升高，并且飼料中添加蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、乳桿菌和地衣芽孢桿菌均能提高草魚（Ctenopharyngodon idella）的抗氧化能力。上述結(jié)果表明，芽孢桿菌可提高動(dòng)物機(jī)體抗氧化能力，從而減少氧化應(yīng)激帶來(lái)的相關(guān)疾病的發(fā)生。

增強(qiáng)宿主免疫力是補(bǔ)充益生菌飲食的重要好處之一。有研究指出，益生菌可以通過(guò)調(diào)節(jié)體液免疫應(yīng)答和免疫相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)先天免疫。溶菌酶、過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶、蛋白酶和抗蛋白酶、過(guò)氧化氫酶（CAT）和髓過(guò)氧化物酶（MPO）對(duì)微生物感染具有較強(qiáng)的殺菌活性。根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，日糧中添加芽孢桿菌可增強(qiáng)魚的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，具體表現(xiàn)為增強(qiáng)抗病性。傳染源影響并啟動(dòng)黏液感染的過(guò)程是感染至關(guān)重要的一步，因?yàn)轸~類黏液中有溶菌酶、補(bǔ)體、干擾素、凝集素、免疫球蛋白和卵黃蛋白等免疫物質(zhì)。但是目前很少有文獻(xiàn)表明芽孢桿菌能增強(qiáng)魚的黏膜免疫。雖然在黏膜免疫中的作用不明確，但芽孢桿菌作為飼料添加劑進(jìn)入水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)能夠促進(jìn)體液免疫，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性，提高其免疫力的作用是毋庸置疑的。

在水生環(huán)境遭受污染的情況下，可能會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖魚出現(xiàn)肝膽綜合征的情況。有研究指出，谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）是用于診斷肝損傷的敏感生物標(biāo)志物，因?yàn)樗麄儽举|(zhì)上是細(xì)胞質(zhì)在細(xì)胞損傷后釋放到血液循環(huán)中。在研究中發(fā)現(xiàn)，用添加枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的飼料飼喂蝦，蝦體內(nèi)在養(yǎng)殖過(guò)程中也可能會(huì)發(fā)生細(xì)菌感染的疾病。但是，疫苗治療只對(duì)特定的致病菌有效，不能作為通用的控制劑。因此益生菌被作為一種促進(jìn)魚類健康和控制疾病的替代品而引入。許多研究也都證明了芽孢桿菌具有改善肝功能的作用，顯示出其保護(hù)肝臟的潛力，能夠減少慢性肝病等肝膽綜合征的出現(xiàn)。

益生菌提高魚類抗病性的機(jī)制主要通過(guò)產(chǎn)生抗菌物質(zhì)排除病原體，與病原體競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和空間，以及引起宿主非特異性或特異性免疫系統(tǒng)的上調(diào)，從而增強(qiáng)對(duì)病原體的防御能力。越來(lái)越多的研究證明了，芽孢桿菌在細(xì)菌疾病防治中有一定的作用。大瀧六線魚（Hexagrammos otakii）體內(nèi)注射殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）14 d后發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌能夠延長(zhǎng)大瀧六線魚出現(xiàn)死亡的時(shí)間，進(jìn)而降低大瀧六線魚的累積死亡率。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在日糧中添加芽孢桿菌后，能夠增強(qiáng)對(duì)海豚鏈球菌（Streptococcus ini?ae）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、不動(dòng)桿菌（Acinetobacter）和殺鮭氣單胞菌等的抗性。芽孢桿菌在多種水產(chǎn)動(dòng)物的養(yǎng)殖中都有所應(yīng)用，如大瀧六線魚、青蝦（Macrobrachium nipponense）和凡納濱對(duì)蝦（Penaeus vannamei）等。以上結(jié)果表明，芽孢桿菌能增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物的抗病能力，對(duì)于肝膽綜合征和細(xì)菌性疾病等發(fā)生有抑制作用，有利于動(dòng)物的健康。

4 芽孢桿菌緩解水產(chǎn)動(dòng)物的脅迫作用

水生動(dòng)物的應(yīng)激是由于理化因素發(fā)生變化時(shí)，水生環(huán)境或系統(tǒng)中的任何物理和生理干擾而產(chǎn)生的。在商業(yè)養(yǎng)魚中，應(yīng)激源是不可避免的，益生菌可以提高魚的抗應(yīng)激能力。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)用5 mg/kg濃度的鹽刺激黃鱸魚（Diploprion bifasciatum）后，除熱休克蛋白70（HSP70）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶和細(xì)胞色素氧化酶亞基I在黃鱸魚肝臟和肌肉中的表達(dá)上調(diào)外，皮質(zhì)醇水平也有所上升。凡納濱對(duì)蝦（Penaeus vannamei）在受到各種化學(xué)物質(zhì)和環(huán)境脅迫時(shí)，飼料中添加枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的蝦抗性較對(duì)照組強(qiáng)。這表明，當(dāng)水產(chǎn)動(dòng)物出現(xiàn)脅迫情況時(shí)可以適當(dāng)添加芽孢桿菌進(jìn)行緩解，提高抗應(yīng)激能力以減少損傷。

5 芽孢桿菌平衡水產(chǎn)動(dòng)物腸道菌群的作用

腸道菌群對(duì)腸道形態(tài)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和代謝機(jī)制有重要影響，有益和有害細(xì)菌動(dòng)態(tài)平衡的正態(tài)分布是保證宿主健康生長(zhǎng)的重要基礎(chǔ)。研究結(jié)果表明，芽孢桿菌能夠在水生動(dòng)物腸道內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，形成優(yōu)勢(shì)菌群，參與機(jī)體的新陳代謝，改善腸道形態(tài)，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育。并且有研究表明適當(dāng)濃度的益生菌可產(chǎn)生抑菌劑，抑制病原菌的生長(zhǎng)，與病原菌爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而提高腸道中益生菌的豐富度。芽孢桿菌對(duì)多種水產(chǎn)動(dòng)物的腸道微生物平衡都有作用，如里海白魚（Rutilus frisii kutum）、鯰魚（Silurus asotus）、南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）和草魚等。這說(shuō)明芽孢桿菌的補(bǔ)充可以幫助水生動(dòng)物調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，利于畜禽的生長(zhǎng)發(fā)育。芽孢桿菌與其他制劑的聯(lián)合使用同樣有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

腸道黏膜屏障與微生物的相互作用對(duì)平衡腸道菌群起著非常重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)，腸黏膜屏障的完整性被破壞，會(huì)導(dǎo)致抗原(微生物、毒素)通過(guò)黏膜進(jìn)入腸腔內(nèi)易位，進(jìn)而破壞腸黏膜的穩(wěn)定性。有研究發(fā)現(xiàn)草魚飼料中添加地衣芽孢桿菌可以改善腸道屏障功能，增加絨毛長(zhǎng)度，上調(diào)ZO-1的表達(dá)。這也說(shuō)明了芽孢桿菌定植在腸道中，不僅能減少有害微生物對(duì)腸道屏障的破壞，還可以改善水生動(dòng)物的腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，提高小腸對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率和飼料轉(zhuǎn)化率。

6 芽孢桿菌調(diào)控水產(chǎn)動(dòng)物的基因表達(dá)

據(jù)報(bào)道，芽孢桿菌可增強(qiáng)與炎癥、生長(zhǎng)代謝、消化過(guò)程、細(xì)胞骨架、連接復(fù)合物蛋白編碼基因、抗氧化基因和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因的表達(dá)。一種混合芽孢桿菌可以通過(guò)降低HSP70基因的表達(dá)來(lái)降低海鯛（Sea bream）幼體細(xì)胞應(yīng)激的嚴(yán)重程度，從而提高魚對(duì)飼養(yǎng)條件的耐受性。如表1所示，芽孢桿菌能夠調(diào)節(jié)異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）免疫相關(guān)基因的表達(dá)，如促炎細(xì)胞因子（IL-8和IL-1β），還能調(diào)節(jié)石斑魚腸道和頭部腎臟中的TGF-β1和TLR5的表達(dá)，以及尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）腸道中促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。雖然芽孢桿菌能夠在基因水平上對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物進(jìn)行調(diào)控，但與調(diào)節(jié)生長(zhǎng)和消化酶活性的作用不同，有關(guān)芽孢桿菌調(diào)控基因表達(dá)的研究很少。

表1 芽孢桿菌對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物基因表達(dá)的影響

7 芽孢桿菌改善水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖水體的作用

養(yǎng)殖水體環(huán)境本身就是一個(gè)由多種微生物組成的動(dòng)態(tài)平衡系統(tǒng)，有益菌和有害菌共生。養(yǎng)殖水體的最佳條件和理化狀態(tài)是水產(chǎn)養(yǎng)殖的一個(gè)重要問(wèn)題，大多數(shù)感染可能是由于水質(zhì)差造成的。許多研究表明，向水體添加有益微生物，使其大量繁殖形成優(yōu)勢(shì)種群可抑制有害病菌的生長(zhǎng)。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中，人工飼料、有機(jī)肥料和養(yǎng)殖生物的排泄物等會(huì)污染水體，在水體中投入地衣芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌增殖后能夠產(chǎn)生許多胞外酶，將養(yǎng)殖水體中的蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪等有機(jī)質(zhì)分解，從而達(dá)到減少底泥生成，并且降低養(yǎng)殖水體富營(yíng)養(yǎng)化的情況。有文獻(xiàn)表明，在水中或養(yǎng)殖動(dòng)物的飼料中添加益生菌可以改善水質(zhì)，使水適合培養(yǎng)微生物。研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加地衣芽孢桿菌能顯著提高發(fā)酵床墊料蛋白酶活性與芽孢桿菌分布數(shù)量，在一定程度上提高了糞便原位降解效率。

有研究表明，在蝦幼蟲中添加不同形式和劑量的益生芽孢桿菌，可顯著降低氨和亞硝酸鹽水平。許多研究人員報(bào)告了芽孢桿菌能通過(guò)硝化或反硝化作用使含氮廢物礦化，從而降低氨和亞硝酸鹽水平，改善了的水質(zhì)。添加益生芽孢桿菌產(chǎn)生的硝化作用釋放氫離子，從而降低pH。處理后記錄溶解氧、氨、BOD、TDS、COD、堿度和pH的變化，發(fā)現(xiàn)水環(huán)境的溫度和透明度不受影響。芽孢桿菌在從培養(yǎng)系統(tǒng)中去除有機(jī)物方面也很有用。由此表明，芽孢桿菌能夠保持水質(zhì)，使養(yǎng)殖的水產(chǎn)動(dòng)物更好的生長(zhǎng)，對(duì)實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展有重要作用。

8 亟待解決的問(wèn)題及建議

在實(shí)現(xiàn)可持續(xù)養(yǎng)殖過(guò)程中芽孢桿菌有巨大潛力，他能夠增強(qiáng)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能、飼料利用率、免疫反應(yīng)、預(yù)防疾病感染尤其是平衡腸道菌群以及改善水質(zhì)。但是，為了提高益生菌在魚類養(yǎng)殖中的研究和應(yīng)用，有一些問(wèn)題也是亟待解決的：①芽孢桿菌來(lái)源于水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)和生活環(huán)境的很少；②芽孢桿菌生長(zhǎng)繁殖環(huán)境在現(xiàn)實(shí)中無(wú)法達(dá)到最適生長(zhǎng)條件，所發(fā)揮的功能不能達(dá)到預(yù)期效果；③芽孢桿菌在水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)的各個(gè)階段的最適添加量尚不明確；④芽孢桿菌在保存過(guò)程中存在逐漸減少的現(xiàn)象，需要進(jìn)一步研究；⑤芽孢桿菌進(jìn)入水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)，與腸道微生物協(xié)同作用的機(jī)制尚不明確。雖然芽孢桿菌在應(yīng)用過(guò)程中還存在一些問(wèn)題，但芽孢桿菌制劑具有相對(duì)安全、環(huán)境兼容性好、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，因而更符合現(xiàn)代社會(huì)對(duì)生產(chǎn)及有害生物綜合防治的要求。

針對(duì)上述問(wèn)題提出以下建議：第一，研究清楚芽孢桿菌與水產(chǎn)動(dòng)物腸道和水體原籍菌群的相互作用機(jī)制。第二，進(jìn)一步優(yōu)化芽孢桿菌培養(yǎng)、加工和保存的條件。第三，探索不同品種、不同時(shí)期、不同規(guī)格、不同水體的差異，確定不同的用量，以達(dá)到精準(zhǔn)養(yǎng)殖。第四，尋找能夠與芽孢桿菌進(jìn)行協(xié)同作用的益生菌，制成復(fù)合益生菌添加劑，將微生物的作用最大化，這也是以后的發(fā)展趨勢(shì)。