富硒菊芋多糖的提取及其體外抗氧化活性研究

許丹丹，徐雅琴，雋 行，周守標，汪昌保，杭 華

（1安徽師范大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，安徽蕪湖 241000；2安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽蕪湖 241000）

0 引言

菊芋(Jerusalemartichoke)是多年宿根性草本植物，又稱洋姜，鬼子姜[1]。菊芋被稱為“21世紀人畜共用作物”，在醫(yī)療保健、生態(tài)環(huán)境改善以及功能食品開發(fā)等方面有著重要作用[2]。菊糖具有腸道益生素、促進礦物質(zhì)吸收、抗氧化、預(yù)防骨質(zhì)疏松、調(diào)節(jié)血糖血脂、調(diào)節(jié)免疫、抗癌等生理功能[3-4]，其已經(jīng)成為功能性食品的研究熱點。硒(Selenium)作為人體生命必需的微量元素[5]，其是谷胱甘肽過氧化物酶不可缺少的組成部分。谷胱甘肽過氧化物酶是穩(wěn)定生物膜的必需成分和體內(nèi)自由基的捕獲劑；其與VE協(xié)同地保護細胞免受脂質(zhì)過氧化損傷，防止生成脂褐素，抗衰老，抑癌抗癌和解除重金屬中毒等作用[6]。

近年來，富硒產(chǎn)品日益增多，尤其是富硒農(nóng)產(chǎn)品及其硒多糖提取也是研究熱點[7]。植物富硒已經(jīng)成為農(nóng)產(chǎn)品功能化與深加工的研究熱點，其產(chǎn)品開發(fā)利用也具有較大的發(fā)展空間和經(jīng)濟效益[8]。在植物體中，硒多糖是植物體對無機硒進行有機化的主要作用方式。與無機硒相比，有機硒更易被機體吸收和利用，且安全性較高[9]。硒多糖作為有機硒的一種，天然獲得產(chǎn)量很低，不能滿足需求，通過化學(xué)合成的硒多糖，既可保持多糖的基本構(gòu)型和生理功能，又能有效的提高硒的生物利用度，發(fā)揮微量元素硒和多糖的雙重功能[10]。楊銘等[11]從富硒植物中提取純化硒多糖，并對其與硒的結(jié)合狀態(tài)進行研究。Liu X[12]等證明紫花苜蓿硒多糖比天然多糖有更強的抗氧化活性。鄧正春等[13]研究表明菊芋具有較好的富硒能力。

植物多糖的提取方法有微波輔助法、超高壓提取技術(shù)、酶提取法、超聲輔助法、超臨界流體萃取法、雙水相萃取[14]。本研究采用超聲輔助法[15]，利用響應(yīng)面法對富硒菊芋多糖的提取條件進行優(yōu)化。前期實驗中表明菊芋多糖具有抗氧化性，而富硒菊芋多糖的抗氧化活性有待進一步研究。本研究擬采用亞硒酸鈉對菊芋進行富硒種植，以富硒菊芋為試材，對其提取條件及抗氧化活性進行研究，以期為富硒菊芋多糖的進一步開發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

富硒菊芋（對菊芋幼苗拌料施硒，種植獲得富硒菊芋）、普通菊糖、葡萄糖標準樣品、硒標品、亞硒酸鈉、苯酚、濃硫酸、三羥基氨基甲烷(Tris)、鄰苯三酚、濃硝酸、高氯酸、過氧化氫(30%)、鐵氰化鉀、鹽酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine,DPPH)、無水乙醇、Vc、硫酸亞鐵等均為分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計購于上海佑科儀器儀表有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA9購于上海亞榮生化儀器廠；KH3200E型超聲波清洗器購于昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購于上海市三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；HH-S恒溫水浴鍋購于國勝實驗儀器廠；SHZ-D(Ш)循環(huán)水式真空泵購于上海凌科實業(yè)發(fā)展有限公司；TG16-WS臺式高速離心機購于長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菊芋富硒 在江蘇宿遷附近區(qū)域采集50份菊芋生長地區(qū)的適宜土壤和50份菊芋，采集后立即密封貯藏。菊芋播種育苗，播種深度10～20 cm，播后30天左右出苗。

實驗：將生長一致的菊芋幼苗分別移入1.5 kg的塑料花盆中，試驗設(shè)1個空白對照，并設(shè)5個試驗樣，用亞硒酸鈉進行施硒處理，硒含量分別為15、25、50、75、100 mg/kg，隨機區(qū)組排列且設(shè)置3個重復(fù)，存放于安徽師范大學(xué)實驗室中。施硒150天收獲。供試土壤理化性質(zhì)為pH 6.56，其余指標均符合正常生長狀態(tài)。

1.3.2 富硒菊芋多糖的提取工藝 見圖1。

圖1 富硒菊糖的提取工藝流程

1.3.3 除蛋白 采用sevage法除蛋白[16]。

1.3.4 硒含量 采用氫化物-原子熒光光譜法[17]測定硒含量。

1.3.5 多糖含量 采用苯酚-硫酸法測定總糖含量，以葡萄糖的質(zhì)量濃度和吸光度值為坐標繪制標準曲線[18]，得回歸方程：y=8.28x+0.1151，R2=0.9990。根據(jù)標準曲線計算多糖提取率，見公式(1)。

式中：M0為硒多糖提取量(g)；M1為富硒菊芋原料用量(g)。

1.3.6 多糖提取單因素試驗 以富硒菊芋粉末為原料，分別研究超聲溫度、超聲時間、超聲功率以及液料比對硒多糖提取率的影響。各因素水平為：超聲溫度45、50、55、60、65、70、75℃；超聲時間50、55、60、65、70、75、80 min；超聲功率250、300、350、400、450、500、550 W；液料比5:1、25:1、45:1、65:1、85:1(mL/g)。

1.3.7 富硒菊芋多糖提取條件響應(yīng)面優(yōu)化 選擇超聲時間、超聲功率、液料比3個因素，選用Box-Behnken模型[19]進行響應(yīng)面設(shè)計，以多糖提取率為響應(yīng)值進行優(yōu)化。試驗設(shè)計因素與水平見表1，重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平

1.3.8 富硒菊芋多糖抗氧化活性研究 以多糖清除·OH、DPPH、O2-·的能力為指標，對利用超聲提取的富硒菊糖與普通菊糖進行體外抗氧化活性比較分析。

（1）對·OH的清除活性的檢測

①供試溶液的制備：分別配制濃度為10 mg/mL的Se-Inulin和Inulin水溶液，并依次稀釋得到濃度為2、4、6、8、10 mg/mL待測樣品液，配制同濃度的Vc水溶液；配制10 mmol/L FeSO4和10 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液以及8.8 mmol/L H2O2溶液。

②樣品對·OH清除活性的檢測：依據(jù)Fenton反應(yīng)體系中，F(xiàn)e2+和H2O2反應(yīng)生成的·OH可與水楊酸反應(yīng)，可用比色法于510 nm處測定·OH含量[20]。實驗設(shè)樣品組、空白組和對照組。實驗步驟參考何鋼等[21]的實驗，根據(jù)公式(2)計算清除率I。

式中：A空白是空白組的吸光度值；A樣品是樣品組的吸光度值；A對照是對照組的吸光度值。

（2）對DPPH清除能力的測定[22]

①供試溶液的制備：分別配制濃度為10 mg/mL的Se-Inulin和Inulin水溶液，并依次稀釋得濃度為2、4、6、8、10 mg/mL待測樣品液，配制同濃度的Vc水溶液；配制0.1 mmol/L的DPPH-乙醇溶液。

②樣品對DPPH清除活性的檢測：取3個試管，分別加入1.5 mL DPPH與1.5 mL水、1.5 mL無水乙醇與1.5 mL多糖溶液、1.5 mL DPPH與1.5 mL多糖溶液，分別設(shè)為空白組，對照組和樣品組。根據(jù)DPPH具有單電子而使其在517 nm處有一強吸收呈深紫色，當存在自由基清除劑時，清除劑與單電子配對而使其吸收逐漸消失，而褪色程度與其所接受的電子數(shù)成定量關(guān)系這一原理[23]，測定樣品液對DPPH的清除活性。并按照公式(2)計算清除率I。

（3）對O2-·清除能力的測定

①供試溶液的制備：分別配制濃度為10 mg/mL的Se-Inulin和Inulin水溶液，并依次稀釋得濃度為2、4、6、8、10 mg/mL待測樣品液，配制同濃度的Vc水溶液；配制pH 8.2 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液；3 mmol/L鄰苯三酚溶液（用10 mmol/L HCl溶液配制）。

②樣品對O2-·清除活性的檢測：采用鄰苯三酚自氧化法，實驗設(shè)樣品組、空白組。樣品組加入1 mL不同濃度的多糖提取液（濃度分別為2、4、6、8、10 mg/mL），實驗步驟參考張曉艷等[24]的實驗，按照公式(3)計算清除率I。

式中：ΔA空白為線性范圍內(nèi)空白組吸光度的增加值；ΔA樣品為線性范圍內(nèi)樣品組吸光度的增加值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 Origin(Version8.5)和 DesignExpert(Version8.0.4)作圖，采用SPSS(Version 17.0)進行統(tǒng)計學(xué)分析，顯著性檢驗采用最小顯著差數(shù)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤含硒量對菊芋塊莖含硒量的影響

由表2可知，在對土壤進行施硒的濃度范圍內(nèi)，施硒80天后，菊芋塊莖的硒含量在0.003～7.132 mg/kg之間。菊芋盆栽土壤施硒后，隨著施硒量的增加，其含硒量與之呈極顯著的正相關(guān)，且施硒組顯著高于空白組。方差分析表明：菊芋塊莖的含硒量在各處理組之間均呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)；在對土壤進行施硒濃度的范圍內(nèi)，盆栽土壤施硒150天后，菊芋塊莖的含硒量在0.121～8.563 mg/kg之間。同樣，隨著施硒量的增加，其含硒量與之呈極顯著的正相關(guān)，且施硒組顯著高于空白組。方差分析表明：菊芋塊莖的含硒量在各處理組之間均呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)。在盆栽土壤施硒范圍內(nèi)，菊芋能夠主動吸收土壤中的硒并富集在其塊莖處，其硒含量最高可達到8.563 mg/kg。

表2 盆栽土壤施硒對菊芋硒積累量的影響

2.2 多糖含量的測定

制作的標準曲線回歸方程y=8.28x+0.01151，R2=0.9990。經(jīng)試驗測定富硒菊芋多糖與對照樣品的OD值分別為1.253、0.943，計算多糖得率分別為13.68%、9.99%。

2.3 單因素試驗結(jié)果

由圖2(a)-(d)可知，超聲時間為60 min，超聲溫度為65℃，超聲功率為450 W、每克樣品加液量25 mL為適宜提取條件。由SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析得知，除超聲溫度對提取率影響不顯著外(P＞0.05)，其余各因素對多糖的提取率均存在極顯著的影響(P＜0.01)。單因素試驗結(jié)果表明，當超聲時間、超聲功率超過其適宜條件后，多糖提取率分別呈現(xiàn)不同程度的下降，這可能是由于過長的超聲波機械作用和熱效應(yīng)或過長/強的微波強熱效應(yīng)，使部分硒多糖發(fā)生降解造成的[25]。

圖2 超聲時間(min)(a)、超聲溫度(℃)(b)、超聲功率(W)(c)、每克樣品加液量(mL)(d)對富硒菊糖提取率的影響

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.4.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取超聲時間、超聲功率及液料比3個因素，采用三因素三水平進行響應(yīng)面設(shè)計，實驗方案及結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

2.4.2 回歸方程的建立與顯著性檢驗 利用SPSS(Version 17.0)軟件，通過對多項式回歸分析，得到的擬合全變量二次回歸方程模型為：Y=13.71+0.048A+0.015B-0.91C-0.22AB+0.25AC+0.14BC-1.17A2-0.49B2-1.07C2。該模型的模擬方差分析結(jié)果見表4。由表4可知，該模型P＜0.0001，表明回歸模型高度顯著；失擬項P=0.9676＞0.05，模型失擬不顯著，實驗誤差??；模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9984，校正決定系數(shù)R2Adj=0.9969，表明此模型擬合優(yōu)度好，因此可用該模型來分析和預(yù)測富硒菊芋多糖提取工藝。此外，液料比及模型各交互項對試驗結(jié)果影響較大。

表4 回歸模型方差分析

2.4.3 響應(yīng)面各因素交互作用分析 以超聲時間A、超聲功率B、液料比C這3個影響多糖得率的因素兩兩組合作為自變量，以多糖得率為相應(yīng)指標繪制響應(yīng)面，用來評價各因素兩兩組合對提取得率的交互影響作用，如圖3所示，AB、AC響應(yīng)曲面坡度陡峭，交互作用高度顯著，BC響應(yīng)面相對陡峭，交互作用顯著。3個因素中液料比對多糖提取率影響最大，隨著液料比的增大，硒多糖提取率亦快速上升。

圖3 兩因素交互作用對富硒菊糖提取率影響的響應(yīng)面分析

2.5 富硒菊芋多糖抗氧化活性的測定結(jié)果

2.5.1 對羥基自由基清除作用的評價 由圖4可以看出，在實驗濃度范圍內(nèi)，Se-Inulin和Inulin對羥基自由基的清除作用呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系，且隨著多糖質(zhì)量濃度的升高而不斷增強。在最高濃度10 mg/mL時，Se-Inulin和Inulin對羥基自由基的清除率分別達到了80.34%、62.1%，且實驗整體來看，Se-Inulin的清除效率始終大于Inulin。在質(zhì)量濃度為6 mg/mL時，Inulin對羥基自由基的清除趨勢平緩，而Se-Inulin的清除能率不受影響，說明硒與多糖的結(jié)合增強了多糖的抗羥基自由基能力。

圖4 Se-Inulin、Inulin和Vc對·OH自由基清除活性

2.5.2 對DPPH的清除能力的評價 由圖5可以看出，在實驗濃度范圍內(nèi)，Se-Inulin和Inulin對DPPH的清除作用呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系，且隨著多糖質(zhì)量濃度的升高而不斷增強，在最高濃度10 mg/mL時，Se-Inulin和Inulin的清除率均達到89.19%、77.23%，由此可說明Se-Inulin和Inulin均具有一定的抗氧化活性。此時Se-Inulin的最大抑制濃度接近于Vc的清除率，證明其有良好的清除DPPH活性的能力。在抗氧化物濃度遞增過程中，Se-Inulin的清除率均大于Inulin，而且其變化趨勢非常接近，一定程度上說明了Se-Inulin中的硒元素在清除DPPH的過程中發(fā)揮了重要的作用。在質(zhì)量濃度為6 mg/mL時，同羥基自由基清除率趨勢相同。

圖5 Se-Inulin、Inulin和Vc對DPPH清除活性

2.5.3 對超氧自由基的清除能力的評價 由圖6可以看出，在實驗濃度2～10 mg/mL濃度范圍內(nèi)，Se-Inulin和Inulin對超氧自由基清除率均呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，在最高濃度10 mg/mL時，Se-Inulin和Inulin對超氧自由基的清除率十分接近，分別為88.54%、81.82%。同時在整個實驗濃度過程中，Se-Inulin對超氧自由基的清除率均大于Inulin。在質(zhì)量濃度為6 mg/mL時，同DPPH清除率和超氧自由基清除率趨勢相同。

圖6 Se-Inulin、Inulin和Vc對O2-·自由基清除活性

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

菊芋富硒的硒含量最高可達到8.563 mg/kg；響應(yīng)面優(yōu)化超聲提取菊芋硒多糖最佳工藝條件（超聲時間60 min、超聲功率450 W、液料比為25:1），提取率達到(13.52%)；通過對比Se-Inulin和Inulin對羥基自由基、DPPH、超氧自由基的清除活性的研究，Se-Inulin對自由基具有更好的清除作用。

3.2 討論

多糖的提取條件已經(jīng)成熟，通過借鑒前人的研究方法，本研究優(yōu)化出富硒菊芋多糖的最佳提取條件。文章對富硒菊芋粗多糖的抗氧化活性做了初步研究，但菊芋多糖與硒的結(jié)合方式尚不明確，其潛在毒性也有待研究。下一步將展開對富硒菊芋粗多糖的純化、結(jié)構(gòu)解析、探究其生理功能等工作。