環(huán)境和食品中阿維菌素類(lèi)藥物殘留量檢測(cè)方法研究進(jìn)展

熊 巍，陶曉秋，張海燕

（四川省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)站，成都 610041）

0 引言

阿維菌素類(lèi)(Avermectins，AVMs)農(nóng)藥是從鏈霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物中分離出來(lái)的一組新型、廣譜、高效、安全的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑，對(duì)動(dòng)植物的寄生線(xiàn)蟲(chóng)和節(jié)肢動(dòng)物均有高效的驅(qū)殺效果。AVMs類(lèi)農(nóng)藥主要的殺蟲(chóng)成分是阿維菌素(Avermectin，AVM)，其作用機(jī)理為AVM與靶動(dòng)物神經(jīng)-突觸的特定位點(diǎn)結(jié)合，引起突觸后膜的谷氨酸控制的CL-離子通道開(kāi)發(fā)，增加細(xì)胞膜對(duì)CL-離子的通透性，導(dǎo)致神經(jīng)元休止點(diǎn)位超極化，神經(jīng)傳導(dǎo)受阻，最終導(dǎo)致蟲(chóng)體麻痹死亡[1]。AVM屬高毒性農(nóng)藥，對(duì)大鼠的半致死量(LD50)為10 mg/kg，與有機(jī)磷農(nóng)藥的毒性相仿。基于其毒性作用，歐美和日本等均制訂了AVMs的最高殘留限量。

AVMs類(lèi)農(nóng)藥主要包括AVM、多拉菌素(Doramectin，DOR)、伊維菌素(Ivermectin，IVM)、莫西菌素(moxidectin，MOX)、?，斁?Emamectin，EMM)、塞拉菌素(Selamectin，SEM)和乙酰氨基阿維菌素(eprinomectin，EPR)等，各種化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。AVMs的相對(duì)分子質(zhì)量大（如AVM，C48H72O14，相對(duì)分子量為873），難汽化，也無(wú)有效的氣相衍生化方法，因此，現(xiàn)有的檢測(cè)AVMs殘留量的方法主要基于液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)，適宜的檢測(cè)器主要有熒光檢測(cè)器(fluorescence detection，F(xiàn)L)，定量核磁共振波譜(quantitative nuclear magnetic resonance spectroscopy，qNMR)、質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)和串聯(lián)質(zhì)譜(tandem mass spectrometry，MS/MS)等。HPLC-FL和LC-MS/MS在AVMs殘留量檢測(cè)中應(yīng)用廣泛，2種方法各有利弊，HPLC-FL具有檢測(cè)器靈敏度高，基質(zhì)干擾少的特點(diǎn)，但是AVMS本身并無(wú)對(duì)稱(chēng)共軛結(jié)構(gòu)，不能直接采用FL測(cè)定，需要加入帶熒光基團(tuán)的衍生化試劑衍生化，而衍生化反應(yīng)的完成程度直接影響方法的準(zhǔn)確性。從2010年開(kāi)始，LC-MS/MS法在AVMs殘留量檢測(cè)中應(yīng)用最為廣泛，該方法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)，無(wú)需HPLC基線(xiàn)分離就可對(duì)不同的AVMs進(jìn)行準(zhǔn)確定量，而基質(zhì)干擾是LC-MS/MS法面臨的最大挑戰(zhàn)，尤其是對(duì)于動(dòng)物組織和土壤等復(fù)雜基質(zhì)的樣品，凈化過(guò)程顯得尤為重要。免疫法和化學(xué)發(fā)光法也應(yīng)用于快速篩查食品或環(huán)境基質(zhì)中AVMs殘留量，由于前處理簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)，在食品中AVMs殘留量的快速篩查分析中具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。

圖1 AVMs藥物的結(jié)構(gòu)式

本研究就2010—2020年國(guó)內(nèi)外常用的不同樣品基質(zhì)中AVMs殘留量檢測(cè)的前處理和分析方法以及樣品基質(zhì)干擾對(duì)定量的影響等方面進(jìn)行綜述，以期為AVMs殘留量相關(guān)研究提供技術(shù)支撐。

1 AVM的應(yīng)用及在食品和環(huán)境中賦存狀態(tài)

AVMs類(lèi)藥物既是獸用驅(qū)蟲(chóng)劑，又是農(nóng)用抗生素類(lèi)殺蟲(chóng)劑，還是家庭衛(wèi)生用藥，也是驅(qū)除絲蟲(chóng)的人用驅(qū)蟲(chóng)劑。AVMs類(lèi)藥物最初是應(yīng)用于農(nóng)牧業(yè)和衛(wèi)生方面，現(xiàn)在AVMs類(lèi)藥物作為有機(jī)磷類(lèi)高毒性農(nóng)藥的替代品在大農(nóng)業(yè)上廣泛應(yīng)用。其作為生物農(nóng)藥，具有高效、低毒、高選擇性和環(huán)境友好等特點(diǎn)，受到農(nóng)藥界的高度關(guān)注。目前，已根據(jù)AVM母核，合成出了上千種全新的化合物[2]，其中EPR被美國(guó)FDA認(rèn)定為全程安全的獸用驅(qū)蟲(chóng)劑。AVMs類(lèi)藥物對(duì)寄生與動(dòng)物體內(nèi)的線(xiàn)蟲(chóng)和節(jié)肢動(dòng)物具有極強(qiáng)的驅(qū)殺作用，殺蟲(chóng)活性極強(qiáng)，能夠?qū)⒂盟巹┝坑蒻g/kg降低到μg/kg，目前已在多個(gè)國(guó)家登記應(yīng)用[3-4]。近期的研究還表明，AVMs類(lèi)藥物具有一定的抗腫瘤效果[5]，可應(yīng)用于臨床濃度的IVM的抗腫瘤活性已經(jīng)在體內(nèi)和體外得以證實(shí)，這也表明IVM很有可能近期會(huì)被允許應(yīng)用于癌癥病人的臨床研究。

AVMs類(lèi)藥物具有光不穩(wěn)定特性，且能夠被微生物分解為無(wú)活性化合物，從而使得AVMs類(lèi)藥物在環(huán)境中的殘留量降低。AVMs類(lèi)藥物在自然環(huán)境中與土壤成分緊密結(jié)合，較難被沖刷和下滲，又會(huì)使其成為環(huán)境中不流動(dòng)的農(nóng)藥。隨著AVMs類(lèi)藥物用量的迅速增加，其對(duì)環(huán)境的影響不可避免，特別是對(duì)水體的影響較為嚴(yán)重，殘留會(huì)對(duì)浮游生物和水生生物產(chǎn)生嚴(yán)重影響[6-7]。由于AVMs對(duì)沉積物中搖蚊幼蟲(chóng)等底棲動(dòng)物毒性極強(qiáng)[8]，AVMs的大量使用已成為底棲無(wú)脊椎動(dòng)物毒性的主要貢獻(xiàn)者之一[9]。

2 樣品前處理方法

2.1 樣品提取方法

樣品提取方法主要基于樣品基質(zhì)的復(fù)雜程度和后續(xù)的分離檢測(cè)方法，對(duì)于液體基質(zhì)的樣品，如水體、牛奶等，主要的提取方式主要選取液液萃取、分散液液萃取以及固相微萃取等方式，而對(duì)于固體基質(zhì)的樣品，就需要先粉碎或者勻漿以保證樣品的均勻性，然后選取不同的萃取方式來(lái)提取樣品基質(zhì)中的目標(biāo)物，主要的萃取方式包括：有機(jī)溶劑萃取法、加速或加壓溶劑萃取法、超臨界萃取法和QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged and safe)法等。

2.1.1 有機(jī)溶劑萃取法 有機(jī)溶劑提取是目前AVMs殘留量檢測(cè)方法中最為常用的提取方法，主要應(yīng)用的提取溶劑有甲醇[10]、乙腈[11]、丙酮[12]和環(huán)己烷等，溶劑提取的過(guò)程中還需要輔以超聲[13]、微波、振蕩[14]、渦旋或者均質(zhì)等方式來(lái)增加溶劑提取的效率，縮短提取時(shí)間[15]。

2.1.2 加速溶劑萃取或加壓液體萃取 加速溶劑萃取(accelerated solvent extraction，ASE)或加壓液體萃取(pressurized liquid extraction，PLE)是在較高的溫度(50～200℃)和壓力(1000～3000 PSI)下用有機(jī)溶劑萃取固體或半固體的自動(dòng)化方法。提高的溫度能極大地減弱由范德華力、氫鍵、目標(biāo)物分子和樣品基質(zhì)活性位置的偶極吸引所引起的相互作用力。液體的溶解能力遠(yuǎn)大于氣體的溶解能力，因此增加萃取池中的壓力使溶劑溫度高于其常壓下的沸點(diǎn)。該方法的優(yōu)點(diǎn)是有機(jī)溶劑用量少、快速、基質(zhì)影響小、回收率高和重現(xiàn)性好。

ASE應(yīng)用于動(dòng)物組織中多種AVMs的測(cè)定，選取的萃取溶劑主要有甲醇、乙腈或者甲醇-乙腈[16]混合溶劑。PLE在環(huán)境樣品中AVMs殘留量測(cè)定中應(yīng)用較多，主要源于在較高溫度和較高壓力的條件下，可以增加溶劑在土壤等復(fù)雜基質(zhì)樣品中的提取效率，縮短提取時(shí)間[17]。目前PLE法已應(yīng)用于水、不同類(lèi)型的土壤樣品和表層沉積物[18]中AVMs的殘留量提取。

2.1.3 超臨界萃取法 超臨界流體萃取法是利用CO2在超臨界狀態(tài)下同時(shí)具有液體和氣體的性質(zhì)，使用超臨界狀態(tài)下的CO2或者其他有機(jī)溶劑萃取食品和環(huán)境樣品中殘留量的AVMs化合物。Park等[19]報(bào)道了乙醇改性的CO2超臨界流體萃取土壤樣品中的5種VAMs，方法具有簡(jiǎn)單、高效的特點(diǎn)，適用于環(huán)境樣品中VAMs同時(shí)測(cè)定。張婭婷等[20]報(bào)道了利用亞臨界丁烷流體分離鮮葉表面殘留的AVM，亞臨界丁烷流體能夠在保持茶葉物理結(jié)構(gòu)和多酚氧化酶活性基本不變的情況下，有效分離茶葉中的AVM，這一研究也為亞臨界流體在去除天然植物農(nóng)殘的應(yīng)用中提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和技術(shù)支持。

2.1.4 QuEChERS法 QuEChERS法是由美國(guó)農(nóng)業(yè)部Anastassiades等[21]發(fā)明的一種集提取和凈化于一體的農(nóng)藥殘留量檢測(cè)的前處理方法，由于其對(duì)適應(yīng)于多種基質(zhì)中不同種類(lèi)和極性的農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)，目前廣泛應(yīng)于農(nóng)殘和環(huán)境污染物分析領(lǐng)域[22-24]。方法主要分為樣品粉碎、單一溶劑提取、加入鹽類(lèi)除水與破乳和加入萃取劑分散固相萃取，該方法具有適用范圍廣、回收率高、溶劑用量少和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。

由于QuEChERS法中加入的硫酸鎂吸水會(huì)放熱結(jié)塊，從而會(huì)影響提取效率，降低熱敏感農(nóng)藥的回收率，后續(xù)有較多的研究針對(duì)這些缺陷進(jìn)行了改進(jìn)，主要的方式有在樣品中加入冷水[25-26]來(lái)抵消硫酸鎂吸水產(chǎn)生的熱量。加入冷水的方式對(duì)于干基樣品如茶葉、土壤等需要加水浸泡的方法較為適用，而對(duì)于含水量較高的蔬菜、水果和肉類(lèi)等適用性存在一定局限，并且少量冷水的加入不足以克服硫酸鎂的發(fā)熱結(jié)塊作用，基于此，后續(xù)有研究采取在鹽類(lèi)加入前整體冷凍樣品和加入均質(zhì)子的方式來(lái)減少結(jié)塊和發(fā)熱導(dǎo)致的方法回收率降低[27]。

由于樣品基質(zhì)的不同，后續(xù)有研究對(duì)QuEChERS法中使用的提取溶劑乙腈進(jìn)行了改進(jìn)，以期獲得更好的提取效率，降低基質(zhì)干擾。其中在胺化乙腈是最為常見(jiàn)的改進(jìn)方式之一，通過(guò)在乙腈中加入不同體積的氨水有助于提高殘留AVMs的提取效率，增加回收率[28]，近期的一個(gè)研究也顯示在乙腈中加入三乙胺也會(huì)有助于動(dòng)物源食品中AVM和IVM的提取[29]。

2.2 樣品的分離純化方法

食品和環(huán)境樣品的基質(zhì)都較為復(fù)雜，不同基質(zhì)的樣品主要的基質(zhì)干擾物差異較大，如動(dòng)物組織樣品的干擾物主要是大分子蛋白以及脂肪等[30]，而土壤樣品的基質(zhì)干擾物主要是色素、有機(jī)質(zhì)和鹽類(lèi)等[31]，針對(duì)不同的干擾物選取不同的分離純化方式顯得尤為重要。最優(yōu)的分離純化方法會(huì)在最大程度的降低樣品基質(zhì)干擾的前提下，提高分析方法的準(zhǔn)確性和精密度。目前報(bào)道的食品和環(huán)境樣品中AVMs殘留量檢測(cè)的前處理方法主要包括：液液萃取(Liquid-liquid extraction，LLE)[14]、固相萃取(Solid-phase extraction，SPE)、固相微萃取(solid-phase microextraction，SPME)、分散液相微萃 取 (Dispersive Liquid-liquid Microextraction，DLLME)和分散固相萃取(Dispersed solid phase extraction，dis-SPE)。近期也有采用定量核磁共振(Quantitative nuclear magnetic resonance，qNMR)用于純化有機(jī)樣品，測(cè)定生物基質(zhì)樣品中的AVMs[32]。

2.2.1 液液萃取法 LLE是環(huán)境樣品AVMs殘留量檢測(cè)中較為常用的凈化方式之一，主要萃取溶劑有乙腈[33]、二氯甲烷[12]、乙酸乙酯[14]和正己烷[13]等。后續(xù)的研究者通過(guò)在提取溶劑中加入酸性或者堿性成分來(lái)增加提取效率，減少提取液的基質(zhì)干擾。對(duì)于液態(tài)樣品或水分含量較高的樣品，如牛奶、蔬菜、水果或者肉類(lèi)等，在LLE過(guò)程中加入鹽類(lèi)，有利于破乳和鹽析，使得有機(jī)相提取層的基質(zhì)更為干凈，效果更好，這一方式在后續(xù)的研究中大量應(yīng)用。后期較多的研究者甚至將干基的固態(tài)樣品，如茶葉、煙葉及土壤等[34]，通過(guò)加水浸潤(rùn)，然后鹽析破乳分層來(lái)增加提取效率，減少萃取液中干擾物。

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2.2.2 固相萃取法 SPE法是較為常用的樣品凈化方法，一般分為吸附和洗脫2個(gè)步驟，根據(jù)分析化合物和樣品基質(zhì)性質(zhì)的差異，可以選擇不同填料SPE小柱，最為常見(jiàn)的SPE小柱有C18柱，硅膠柱，離子交換柱和聚苯乙烯-二乙烯苯柱[35]等。在測(cè)定食品或環(huán)境樣品中AVMs殘留量過(guò)程中，SPE的應(yīng)用也較為廣泛[36]。錢(qián)卓真等[11]應(yīng)用堿性氧化鋁固相萃取柱和LC-C18固相萃取柱串聯(lián)凈化石斑魚(yú)血漿、肌肉組織、肝臟組織萃取液，用于測(cè)定石斑魚(yú)中AVMs藥物多殘留及食用安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。近期，張振東等[10]評(píng)價(jià)了EPR藥動(dòng)學(xué)前處理中2種SPE柱的凈化、萃取效果，顯示C18柱對(duì)EPR的萃取效果更理想。

特殊的SPE小柱有助于增加柱子對(duì)目標(biāo)成分的保留，起到更好的凈化效果，其中免疫親和柱的使用較為廣泛。Li等[37]建立了免疫親和柱分離純化凈化生物基質(zhì)樣品，準(zhǔn)確測(cè)定ABA 1a含量，該方法具有萃取效率高，結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)。免疫親和SPE小柱的應(yīng)用可以選擇性的吸附目標(biāo)分析物，有效的降低基質(zhì)干擾，提高了方法的準(zhǔn)確性，但是免疫親和柱的局限在于只能對(duì)一種或者一類(lèi)特定的成分具有較好的吸附性，而多余多種分析化合物，特別是不同種類(lèi)的分析物的應(yīng)用存在較大局限。分子印跡聚合物作為固相填料的SPE柱有助于專(zhuān)一性的吸附保留目標(biāo)分析物，最大程度的凈化樣品基質(zhì)，從而使得方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性更好。

近年來(lái)，可重復(fù)使用的整體SPE柱的出現(xiàn)使得在線(xiàn)SPE的前處理方式變得較為容易，方法主要通過(guò)六通閥切換的方式先在線(xiàn)凈化樣品，切換后將凈化后的樣品導(dǎo)入儀器分析[38]。其中最為關(guān)鍵的是整體SPE萃取柱，目前較為常用的SPE整體柱有疏水性整體柱[39]、Hysphere resin C18柱[29]和介孔性整體柱[38]，分別用于除去水溶性雜質(zhì)和大分子蛋白等雜質(zhì)。目前，在線(xiàn)SPE方法已應(yīng)用于測(cè)定牛肝[40]、豬肉[29]、牛肉[29]、香腸和土壤[41]樣品中AVMs殘留量的測(cè)定，凈化效果良好。與傳統(tǒng)的LLE方法相比，SPE方法的優(yōu)勢(shì)主要有有機(jī)溶劑消耗少、萃取時(shí)間短、不易乳化且回收率較好。

2.2.3 固相微萃取法 SPME技術(shù)是一種較好的替代傳統(tǒng)的前處理方法的技術(shù)，其主要的優(yōu)點(diǎn)有快速、簡(jiǎn)單、高效、無(wú)需溶劑并且能夠與多種分離方法結(jié)合使用。SPME主要通過(guò)涂有固定相的熔融石英纖維來(lái)實(shí)現(xiàn)采樣、萃取、濃縮樣品，提高了前處理效率，縮短了分析時(shí)間，與SPE的原理不同，SPME無(wú)需將樣品基質(zhì)中的目標(biāo)分析物完全萃取出來(lái)，只需目標(biāo)分析物在固定相和水相之間達(dá)到一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡。

SPME也已應(yīng)用于食品和環(huán)境基質(zhì)中AVMs殘留量的測(cè)定，Teixeira等[42]以聚（1-乙烯基咪唑-三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯）分子印跡化合物作為固定相的固相微萃取提取槍頭，成功應(yīng)用于提取水和水果中的AVMs化合物。Florez等[43]應(yīng)用聚吡咯作為自組裝管尖的固定相，應(yīng)用于萃取和濃縮牛奶中的多種獸藥殘留。You等[44]利用磁性多壁碳納米管作為支撐材料，將磁性分子印跡聚合物聚合于碳納米管中，用于提取和純化魚(yú)肉樣品中殘留的AVMs化合物。雖然，SPME已經(jīng)應(yīng)用于食品基質(zhì)中殘留的AVMs化合物的提取與凈化，但其主要應(yīng)用于液體基質(zhì)中殘留的AVMs化合物的提取，對(duì)于復(fù)雜的土壤和生物基質(zhì)樣品的應(yīng)用較少。

2.2.4 分散固相萃取 Dis-SPE是一種快速樣品處理技術(shù)，在多種化合物的分析檢測(cè)中都有應(yīng)用[45]。這種方法主要通過(guò)在液體樣品中加入固相吸附劑用以分離純化復(fù)雜基質(zhì)樣品中的多種分析物。Dis-SPE在不同基質(zhì)中多種農(nóng)藥殘留量的分析中多有應(yīng)用，選取的固相吸附劑包括：PSA，C18，GCB，MWCNTs，PEP-2，Al2O3，F(xiàn)lorisil，PVPP和磁性吸附劑等[46]。Dis-SPE的另一優(yōu)勢(shì)在于省去了后續(xù)的沉淀、離心和過(guò)濾等可能會(huì)降低方法準(zhǔn)確性的步驟。Dis-SPE在AVMs的測(cè)定方法的樣品凈化中已有應(yīng)用[47]。Whelan等[48]在牛奶中AVMs的測(cè)定方法中應(yīng)用Dis-SPE方法凈化樣品基質(zhì)，樣品經(jīng)乙腈提取，鹽析液液分配后，加入分散萃取劑凈化萃取液，然后將萃取液濃縮于二甲基砜中進(jìn)行分析測(cè)定，結(jié)果顯示該前處理方法能夠有效的提取凈化牛奶樣品中的AVMs分析物。

2.2.5 其他萃取方法 DLLME技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型樣品前處理技術(shù)，相當(dāng)于微型化的液液萃取，是基于目標(biāo)分析物在樣品溶液和小體積的萃取劑之間平衡分配的過(guò)程[49]。DLLME技術(shù)具有簡(jiǎn)單快速、環(huán)境友好和成本低廉等特點(diǎn)，在食品和環(huán)境樣品的前處理分析中應(yīng)用廣泛。近期，DLLME技術(shù)也應(yīng)用于環(huán)境基質(zhì)中AVM的殘留量測(cè)定，張偉等[50]應(yīng)用DLLME技術(shù)凈化水體樣品，測(cè)定了樣品中的AVMs殘留。

3 AVMs藥物殘留量的檢測(cè)方法

表1列出了食品和環(huán)境樣品中AVMs殘留量檢測(cè)方法使用的分析儀器，最為主流的分析儀器是基于HPLC技術(shù)以及HPLC-MS/MS技術(shù)。ELISA和化學(xué)發(fā)光免疫法(Chemiluminescent immunoassay，CLIA)在食品樣品中AVMs殘留量的快速篩查分析中也有應(yīng)用，由于其操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可信，可滿(mǎn)足中國(guó)市場(chǎng)和進(jìn)出口食品檢測(cè)需要。

3.1 高效液相色譜法

HPLC-UV常作為化學(xué)分析實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)配備儀器，適合于方法的推廣與應(yīng)用，然而UV檢測(cè)器也存在靈敏度較低、選擇性不高、易受干擾等缺點(diǎn)。Florez[43]開(kāi)發(fā)了一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單、易于操作的利用HPLC-UV測(cè)定牛奶中AVMs殘留量的方法，方法選取了固相微萃取方式提取與凈化樣品基質(zhì)，HPLC-UV分離測(cè)定，方法中IVM的LOD達(dá)到(21.51±2.94)ng/mL；近期，覃國(guó)新等[52]也建立了UPLC-UV測(cè)定甘藍(lán)和橙子中的AVMs殘留，樣品經(jīng)乙腈提取，混合使用PSA和C18基質(zhì)分散凈化劑進(jìn)行凈化，AVM在橙子和甘藍(lán)中的LOD分別為0.0160 mg/kg和0.0109 mg/kg。

HPLC-FL具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)的特點(diǎn)，但是其檢測(cè)前需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化，選取的衍生化試劑主要有三氟乙酸酐(trifluoroacetic anhtdride，TFAA)和N-甲基咪唑(1-methylimidazole，NMIM)等[53]。由于環(huán)境樣品中AVMs的濃度不確定，若萃取液中AVMs的濃度過(guò)高，可能就會(huì)導(dǎo)致衍生化過(guò)程不完全，降低方法的準(zhǔn)確度[13]，此外，熒光衍生化過(guò)程對(duì)樣品的凈化效果要求嚴(yán)格，若有微量的水分或光的存在也會(huì)導(dǎo)致衍生化失敗，因此實(shí)驗(yàn)過(guò)程必須保證避光且完全無(wú)水的狀態(tài)。

近年來(lái)，HPLC結(jié)合qNMR也應(yīng)用于AVMs的測(cè)定，Hou等[54]建立了HPLC-qNMR法測(cè)定商業(yè)配方產(chǎn)品中的AVB1a，該方法選取氘代氯仿作為溶劑，LOD達(dá)到0.009 mg/mL。最近，Zhang等[32]報(bào)道了離線(xiàn)的內(nèi)標(biāo)回收率校正-HPLC-qNMR用于測(cè)定AVM B1a，該方法選取定量核磁共振(qNMR)純化有機(jī)樣品。

3.2 酶聯(lián)免疫法

近年來(lái)，酶聯(lián)免疫法也應(yīng)用于食品和環(huán)境樣品中AVMs殘留量的測(cè)定。早在2010年，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法已應(yīng)用于測(cè)定肝臟中的ABM、IVM和EPR殘留量，方法的LOQ能定達(dá)到1.06 ng/mL[55]。后續(xù)研究將ELISA法應(yīng)用于牛奶中的多種AVMs化合物的快速檢測(cè)，樣品經(jīng)有機(jī)溶劑提取后，無(wú)需純化過(guò)程直接測(cè)定[56]。近期，在國(guó)內(nèi)商品化的ELISA檢測(cè)試劑盒已經(jīng)廣泛應(yīng)用于雞肉、雞肝[57]、牛奶[58]、蔬菜[59]和牛肉[60]等動(dòng)植物源食品中AVMs殘留量的快速檢測(cè)，并且該方法與大型儀器的檢測(cè)數(shù)據(jù)比對(duì)結(jié)果良好，可滿(mǎn)足食品中AVMs殘留量快速檢測(cè)的需要。

3.3 化學(xué)發(fā)光免疫法

化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)牛肝、牛肉中AVMs藥物的殘留。黨娟等[61]自主研發(fā)了化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒用于牛肝、牛肉樣品中IVMs藥物殘留量的測(cè)定，方法的檢出限范圍為1.463～1.392 ng/kg，準(zhǔn)確度較好，這種方法與液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)實(shí)際樣品的陰、陽(yáng)性判斷結(jié)果一致，可滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)動(dòng)物組織中AVMs藥物殘留的需要。Crooks等[62]建立了解離增強(qiáng)鑭系元素的熒光免疫分析法(dissociation enhanced lanthanide fluoroimmunoassay，DELFIA)用于測(cè)定牛奶中的AVMs殘留量，3種AVMs的檢出限達(dá)到4.6 ng/mL，日內(nèi)和日間精密度分別為11.6%和15.8%。

3.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

由于LC-MS/MS的高靈敏度與高選擇性，使得直接分析復(fù)雜基質(zhì)中低含量的AVMs成為可能。適用的樣品基質(zhì)：蔬菜水果[63]、水產(chǎn)品[28]、肉類(lèi)[64-65]、奶及奶制品[43]和水[50]、水體沉積物及土壤[66]等環(huán)境樣品。

報(bào)道的LC-MS/MS測(cè)定食品和環(huán)境基質(zhì)樣品中AVMs殘留量的方法中，色譜柱的固定相基本都是基于C18的反相色譜柱[63]，主要的區(qū)別在于是否封端，或者采用何種鍵合基團(tuán)封端。流動(dòng)相的選取也是在液質(zhì)中應(yīng)用較多的甲醇或乙腈-水相體系，各個(gè)方法略有不同的是會(huì)在有機(jī)相和水相加入0.1%～0.2%的甲酸[63]、0.1%NH4OH[39-40]或者5～10 mmol/L乙酸銨[29,41]用以調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH，增加離子源的電離效率，早期的LCMS/MS系統(tǒng)由于色譜柱的選取多為4.5 mm柱徑的色譜柱，流速設(shè)置多為1 mL/min，介入串聯(lián)質(zhì)譜后往往需要先經(jīng)過(guò)分流以減少流量。隨著小柱徑(2.1 mm)色譜柱的應(yīng)用以及電噴霧離子源技術(shù)的改進(jìn)，現(xiàn)有的LC-MS/MS系統(tǒng)無(wú)需分流，流速的設(shè)置一般將為0.25～0.5 mL/min[40]，樣品的進(jìn)樣體積范圍為 5～20 μL[28,36]，由于在線(xiàn)SPE-LC-MS-MS系統(tǒng)進(jìn)樣后涉及凈化過(guò)程，需要較大的進(jìn)樣體積，且不同的方法使用的定量環(huán)的體積差異較大，一般為50～250 μL[41]。由于小粒徑填料色譜柱優(yōu)異的分離度與塔板數(shù)，在WATERS開(kāi)發(fā)出耐高壓的亞微米粒徑的UPLC色譜柱后，UPLC-MS/MS應(yīng)用于蔬菜[63]、奶粉[67]和中草藥[68]中AVMs殘留量的測(cè)定，樣品的分析時(shí)間顯著縮短，進(jìn)樣量可以進(jìn)一步的縮小至1～2 μL[63]。

大氣壓電離離子源是LC-MS/MS系統(tǒng)中最為常用的離子源，ESI源在AVMs殘留量測(cè)定的方法應(yīng)用最為廣泛，主要選取ESI+[36]和加熱電噴霧離子(HESI+)源[28]，由于軟電離離子源ESI的使用，使得LC能夠直接將樣品引入串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定，主要的串聯(lián)質(zhì)譜儀有三級(jí)四級(jí)桿質(zhì)譜[40]、QTrap[69]、和高分辨質(zhì)譜[70]等。

基于LC-MS/MS的檢測(cè)方法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，適合于復(fù)雜基質(zhì)如動(dòng)物源食品和土壤樣品中的AVMs殘留量的測(cè)定，并且已經(jīng)成為主流的分析儀器。而LC-MS/MS的儀器較為昂貴，且LC-MS/MS系統(tǒng)的養(yǎng)護(hù)費(fèi)用都較高，有些實(shí)驗(yàn)室難以承受，這也是LC-MS/MS方法難以全面普及的原因。

4 定量分析和基質(zhì)效應(yīng)

色譜和質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用能夠提供穩(wěn)定、可靠的測(cè)定食品和環(huán)境基質(zhì)中痕量AVMs殘留量的方法，但是由于食品和環(huán)境基質(zhì)，尤其是動(dòng)物源食品和土壤基質(zhì)的復(fù)雜性，使得基質(zhì)干擾物與目標(biāo)分析物的緊張作用會(huì)嚴(yán)重影響方法的專(zhuān)一性和選擇性。通過(guò)優(yōu)化方法，能夠降低或者清除方法的基質(zhì)干擾。目前，最為有效的降低樣品基質(zhì)效應(yīng)的方法為一一對(duì)應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)定量法，然而，同位素內(nèi)標(biāo)非常昂貴，因此，大量的研究者選取了其他的降低樣品基質(zhì)效應(yīng)的方法。

除同位素內(nèi)標(biāo)法外，最為通用的有效降低樣品基質(zhì)效應(yīng)的方法為空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法。表1列出的AVMs殘留量檢測(cè)方法中，多數(shù)都使用了基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方法[70-71]。如Qin等[23]利用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量測(cè)定典型動(dòng)物食品基質(zhì)中的AVMs殘留量，在5～500 μg/kg的線(xiàn)性范圍內(nèi)，各個(gè)化合物的相關(guān)系數(shù)大于0.998。在使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的檢測(cè)方法中，可以選擇加入內(nèi)標(biāo)如甲氨基阿維菌素苯甲基鹽[13]和羅紅霉素[16]來(lái)消除樣品前處理或者儀器分析過(guò)程中引入的誤差。氘代內(nèi)標(biāo)雖然能夠更好的消除基質(zhì)效應(yīng)，而由于氘代AVMs合成較為困難且價(jià)格非常昂貴，導(dǎo)致未見(jiàn)應(yīng)用其作為內(nèi)標(biāo)定量AVMs殘留量的檢測(cè)方法。

表1 近期報(bào)道的食品和環(huán)境樣品中AVMs藥物殘留量分析方法

續(xù)表1

5 展望

過(guò)去10年，研究人員建立了大量的食品和環(huán)境基質(zhì)樣品中AVMS的殘留量的檢測(cè)方法，其中，最為常用的提取溶劑為乙腈，固相萃取和基質(zhì)分散固相萃取是應(yīng)用較多的樣品凈化方式，QuEChERS及其改良方法是最受歡迎的前處理方式，LC配備三級(jí)四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜是最為常見(jiàn)的多種AVMs檢測(cè)儀器。近10年來(lái)，食品和環(huán)境基質(zhì)樣品中AVMS的殘留量的檢測(cè)方法呈現(xiàn)出以下發(fā)展趨勢(shì)：（1）檢測(cè)方法由單指標(biāo)測(cè)定轉(zhuǎn)向多個(gè)指標(biāo)同時(shí)檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)；（2）更注重方法的簡(jiǎn)便與環(huán)保，注重減少有機(jī)溶劑的用量；（3）QuEChERS為最受歡迎的前處理方法，大量的方法基于此進(jìn)行改良與創(chuàng)新；（4）色譜技術(shù)的進(jìn)步，尤其是亞微米粒徑的UPLC柱的使用使得方法的分析時(shí)間縮短到10 min以?xún)?nèi)，大大增加了檢測(cè)通量；（5）在線(xiàn)前處理方式的使用能夠節(jié)省大量人力，減少人為誤差，提高了方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性；（6）單指標(biāo)的快檢方法具有一定的應(yīng)用市場(chǎng)，部分實(shí)驗(yàn)室關(guān)注于開(kāi)發(fā)與應(yīng)用此類(lèi)方法；（7）LC-MS/MS設(shè)備的逐漸普及使得相應(yīng)的檢測(cè)方法成為主流。

目前，雖然已經(jīng)建立大量的AVMS的殘留量的檢測(cè)方法，這些方法也存在以下局限性：（1）90%的方法都使用外標(biāo)法定量，對(duì)操作條件的穩(wěn)定性要求較高；（2）雖然有極少文獻(xiàn)選取單一的內(nèi)標(biāo)法定量，但是對(duì)于降低復(fù)雜基質(zhì)樣品（動(dòng)物組織和土壤）帶來(lái)的基質(zhì)干擾效果不明顯，一一對(duì)應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)定量才是最優(yōu)選擇；（3）主流檢測(cè)儀器LC-MS/MS受基質(zhì)干擾嚴(yán)重，需要選擇專(zhuān)一性更好的如MIP固相萃取技術(shù)等前處理方式。針對(duì)現(xiàn)有方法可能的局限性，需要針對(duì)各個(gè)AVMs，開(kāi)發(fā)和合成出經(jīng)濟(jì)適用的同位素內(nèi)標(biāo)；合成經(jīng)濟(jì)性和適用性更好的MIP-SPE小柱或MIP分散萃取材料；新儀器如納流LC-MS/MS、合相色譜-MS/MS和LC-高分辨質(zhì)譜的使用也會(huì)顯著提升復(fù)雜基質(zhì)中痕量AVMs殘留分析的準(zhǔn)確性。此外，ELISA，CLIA和免疫層析法等快速檢測(cè)技術(shù)由于其前處理簡(jiǎn)單、不受實(shí)驗(yàn)室條件限制，在食品中AVMs殘留的快速篩查以及環(huán)境樣品的野外分析中具有較大的應(yīng)用前景，如何開(kāi)發(fā)出操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可信、價(jià)格低廉的快速檢測(cè)方法與設(shè)備成為其發(fā)展的關(guān)鍵。